方法論記事

生産と一価量子ドットの標的

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DOI:

10.3791/52198

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2014年10月23日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Otolaryngology, University of California, San Francisco, 2Department of Chemistry, University of California, Berkeley, 3Materials Science Division, Lawrence Berkeley National Laboratory, 4Department of Pharmaceutical Chemistry, University of California, San Francisco, 5Tetrad Graduate Program, University of California, San Francisco, 6Center for Systems and Synthetic Biology, University of California, San Francisco, 7Chemistry and Chemical Biology Graduate Program, University of California, San Francisco

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この記事について

サマリー

私たちは、定義された長さのホスホロチオエートDNAから一価の標的量子ドット(mQD)を調製するための詳細な指示を提供します。DNAラッピングは高収率で行われるため、製品の精製は必要ありません。私たちは、生細胞イメージングアプリケーションのために、mQDを細胞表面受容体に標的とするSNAPタグの使用を実証しています。

要約

商用量子ドット(QD)の多価性や、モノバレントドットの生成に伴う困難さが、生体分子のクラスタリングや空間的組織化がしばしば研究対象となる生物学での応用を制限しています。ここでは、CdSe/ZnSコア/シェルQDと定義された長さのホスホロチオエートDNA(ptDNA)を単純に混合することにより、ほとんどの生物学研究室で達成できる一価量子ドット(mQD)を生成するためのプロトコルについて説明します。1本のptDNA鎖がQDを包み込んだ後、追加の鎖は表面から除外されます。この方法でのmQDの作製は、市販の試薬を使用して、小規模および大規模に、最小限のステップで達成できます。これらのmQDは、相補的な一本鎖標的DNAへのハイブリダイゼーションにより、特異的に生物学的標的に向けることができます。私たちは、ベンジルグアニン部分を持つmQDを標的とする生哺乳類細胞上のSNAPタグ付きNotch受容体を標識することにより、これらのmQDをイメージングプローブとして使用することを実証しています。

概要

生細胞上の単一分子のダイナミクスは、それらの生物学的機能に寄与する。単一分子蛍光イメージングは、細胞表面1,2,3上の単一分子のダイナミクスを研究するための一般的な手法です。しかし、これらの研究において、最も一般的に使用されるイメージングプローブは、いくつかの重要な欠点を有する。例えば、従来の有機色素および蛍光タンパク質は、典型的な生細胞イメージングの条件下で約10 5〜10 6光子の放出後に漂白、適度な明るさ、約10 5〜10 6 M -1 cm -1でを提供するが、光化学的に不安定である4,5。対照的に、半導体ナノ粒子、頻繁に呼び出される量子ドット（QD）は、10 6〜10 7 M -1 cm -1での範囲とphotobl前に10 7 -10 8放出された光子を超えること吸光係数で、かなり明るく、より安定である5 eaching。有機フルオロフォアの上QDの改善された明るさと光安定性が大幅に高速フレームレートで単一分子の観察を可能にし、上ではるかに長い6を軌道。

その利点と商業的利用にもかかわらず、いくつかの負債は、これらの強力な造影剤のために残っている。第一に、彼らは不十分目標と生体分子6の架橋をもたらし得る、原子価をターゲットに定義しました。第二に、彼らは一般的に、特定の混雑した細胞環境7への接近が制限され、大きな流体力学的サイズ（> 20 nm）を持っている。第三に、彼らは、モジュール7をターゲットに限られている。いくつかの戦略は、これらの問題8,9,10に対処しようとしましたが、一般的に実装するために専門的な知識や試薬を必要としている。

これらの問題に対処するために、本発明者らは最近、小さな価を調製するための「立体排除」戦略を報告し、そしてモジュラー量子ドット11。量子ドットは、単一の長いホスホロチオエートDNA（ptDNA）ポリマーで包まれている。 ptDNAは、表面露出Zn原子とptDNAポリマーのホスホロチオエート基の間の複数のZn-Sの相互作用を介してQDの表面に結合する。シングルバウンドポリマーは、立体的に静電著しく、粒子の全体的なサイズ（約2nm）を増加させることなく、ポリマーの追加的な同等物の結合を除外している。全ての試薬は、製品が高収率で形成され、市販されており、プロセスは、精製のための唯一の脱塩工程を必要とする。シングルptDNA（MQDS）ドメイン（ 例えば 、ベンジルグアニン（BG）、ベンジルシトシン、またはハロゲン化アルキル）を標的とするベアリングの相補的DNA鎖に結合して包まれたら、ラベル、量子ドット。

これらの機能は、具体的には、遺伝的に、目的のタンパク質に融合されるSNAP、CLIP＆HALOのような酵素タグにMQDSをターゲットにしています。これは合成のためのプロトコルです、ターゲティング、および立体排除によって生成MQDSの生細胞イメージング。

プロトコル

一価量子ドットの1。生産

  1. 水相への有機からQDの相間移動
    1. 5ミリリットルのガラスバイアル中のクロロホルム400μlの有機相QDの1μMの溶液200μlに希釈する。
    2. きちんとしたmPEGチオール（CH 3 O（CH 2 CH 2 O）6、C 2 H 5 SH）の36μlの0.3 Mテトラブチルアンモニウムブロマイド（TBAB）クロロホルム溶液を400μlを混合し、/ NとOを振る。
    3. 0.2MのNaOH水溶液800μlを加え、30秒間振る。相間移動は、より密度の高い有機相上記の水相への着色粒子の移動によって示され、数分以内に起こる。
    4. 粒子は、水相と有機相との間の第三相中で凝集した場合、のmPEGチオールとのインキュベーション時間を増加させる。水相が透明なままである場合、QDは、相間移動（ 図3Aを参照）しなかった。または、コンセントを増やす貧しい相間移動を緩和するステップ2でのmPEGチオールの比。
    5. （着色）水相を回復した後、1mlにセントリコンスピンカラム（30kDaの分子量カットオフ）で収集された量子ドットを集中。
    6. 30mMのNaClの液（pH8.0）を含む10mMトリス緩衝液で予め平衡化したセファデックスNAP10カラムに濃縮されたQD溶液を添加する。重力流によって溶出緩衝液1.5mlを持つ量子ドットを溶出する。
    7. 350nmでの吸収分光法と量子ドットの濃度を測定します。
  2. MQDSの調製
    1. 購入（または合成）ptDNA。このプロトコルは、シーケンスを使用して5'-S 50（CT）10（ACTG）5 -3 '（ 表1参照）。
DNA シーケンス
5'-S 50（CT）10（ACTG）5 -3 ' S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A、S
S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A、S
S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A、S
CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTACTGACTGACTGACTGACTG
5'-NH 2 - （CT）10（CAGT）5 -3 ' NH 2 - / C6spacer / CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGT
BG-DNA BG-/ C6spacer / CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGT

表1のDNA配列が生成し、ターゲットMQDSするために使用される。

  1. 30のNaCl（pH8の）を含む10 mMトリス緩衝液中で100 nMのQD溶液1mlを準備します。
  2. 激しく撹拌しながら1分間水のQDに100 nMのptDNA液の賢明な500μlのドロップ追加。かき混ぜるまたは追加の9時間、シェーカー上に置きます。
    注：ptDNAの2の比率：QDこれは理論的には1を生成する必要があります。しかし、実際の化学量論は完璧になることはありません - 通常の結果は1に近い。1.5。 1 ptDNAの比：1製造するために、QDを、ゲル電気泳動後、デンシトメトリーは、上記使用される既知の容積与えられたコンジュゲートの正確な比率を定量化することが必要である。
  3. 分析用アガロースゲル上で実行するようにQD混合物の〜10μlのを削除します。また、（ステップ1.2.1）から水相中非抱合型QDの同様の濃度を削除します。
    1. 〜2μを追加; 6×フィコールローディングバッファーのlは（溶液の密度を増加させる）と、近くに移行非共役対照レーンにおいて150 Vで15分間、ホウ酸ナトリウム緩衝液中の0.8％重量/容量アガロースゲル上で一緒に単一のバンドを、これらの二つのサンプルを実行するよく、共役量子ドットとレーン内の2つのバンドは（ 図2Bのジェルを参照）が見られる。
  4. 二つのバンドの相対強度を用いて非共役QD分率を算出する（ 図2Bの式を参照）。その後、量子ドットの数と一致するのに必要な100 nMのptDNA液の追加の体積を計算するために、その一部を使用しています。
  5. 繰り返しますが、この計算されたボリュームまたはすべてのQDの完全な結合を示すゲル上の単一バンドに共役量子ドットの崩壊まで、もう一度1.2.5 1.2.3を繰り返します。
  6. 共同10mMのトリス緩衝液中10mM（CO 2 H）CH 2 O（CH 2 CH 2 O）6 C 11 H 23 SH（カルボキシPEG6アルカンチオール）を100μlを追加上記で作製した共役MQDSに30のNaCl（pH8の）をntaining、10分間振とうする。
    注：これらのPEGリガンドは、量子ドットの表面を不動態化する。より長いPEGは、量子ドットをより良い不動態化、しかし、それはまた、それらのサイズが大きくなります。疎水性アルカンチオール官能性相間移動のための疎水性の低いPEG-チオール使用されるよりも、合計で、量子ドットのために非常に高い親和性を有する。そのため、このステップは長すぎるかptDNAを続行することはできませんアルカン-PEG-チオールに置き換えられます。 〜30分間のインキュベーション後、DNAのかなりの部分は、量子ドット（ 図3B）から変位されているであろう。
  7. 過剰なアルカンPEG-チオールを除去するために、溶出緩衝液（30mMのNaClを含有する10mM Tris緩衝液）で予め平衡化したセファデックスNAP5カラムにQD溶液0.5mlを加える。重力流によって溶出緩衝液1.0mlとMQDSを収集します。
  8. セントリコンスピンカラム（30 kDa）ので収集された量子ドットを濃縮する。ヶ月間、4℃で、これらのMQDS保管してください。 FRしないでくださいそれらをeeze。
    注：チューブの底における着色ペレットが見られた場合、ドットが集約され、もはや使用可能性が高いしている。

ターゲティング（Benzylguanine-）DNAの2。生産

  1. アミン末端のDNAを生成したり購入してください。このプロトコルは、シーケンスを使用して5'-NH 2 - （CT）10 - （CAGT）5 -3 '（ 表1参照）。ポリ-CTリンカーは、糖衣の奥深くに埋もれ機能へのアクセス性を向上しますが、すべてのアプリケーションのために必要とされない場合があります。 DNA合成へのアクセスがある場合は、適切な5 'アミノ修飾剤（5'アミノ修飾因子C6）を使用してアミノ修飾DNAを産生する。
  2. 10 mg / mlの濃度で、乾燥ジメチルスルホキシド（DMSO）中のBG-N-ヒドロキシスクシンイミド（BG-NHS）を溶解する。
    注：BG-NHSは、空気から水を吸収し、反応性NHS-エステルの加水分解につながり、特に、DMSO、ジメチルホルムアミド（DMF）のような吸湿性の溶媒中であろう。 BG-NHSは、最高のお店です乾燥剤を含む第2の容器内に、独自のバイアル内の粉末として-80℃でのD。バイアルを開く前に室温に温まる。代わりに、すぐに使い捨て用乾燥極性溶媒中にBG-NHSエステルをアリコートし、-80℃で凍結、あるいはステップ2.2におけるアミンDNAと完全に反応する。
  3. HEPES中でアミン末端DNA（4 - （2 - ヒドロキシエチル）-1 - ピペラジンエタンスルホン酸）緩衝液（pH 8.5）、水、ステップ2.1からDMSO中BG-NHSとを混合することによって反応する。 （CT）10 - - 20μlの0.5MのHEPES pHが8.5で緩衝化（CAGT）5 58μlの脱イオン水に典型的には2 mMのNH 2の2μlのDMSOに10 mg / mlのBG-NHSを20μl反応する。 1.5mlのマイクロチューブ内で反応を行う。反応が急速に進行し、NHS-エステル加水分解と競合しなければならないように素早く混ぜる。
  4. 完全な混合を確実にするために5〜10分間超音波処理。 RTで〜1時間インキュベートする。 BGの化学量論比：DNAは、反応を完了させるために変更することができる。
  5. は100mMトリエチルアミンアセテート（TEAA、pH7）でに標準NAP5カラムを用いて反応を脱塩。
  6. 30分かけて8％と95％のアセトニトリルの間でアセトニトリル（ACN）勾配：100mMのTEAAを実行して、逆相HPLCによって未反応アミン-DNAからBG-DNAを精製する。未反応のアミン-DNAはBG-DNAの前に溶出します。コニカルチューブ中のBG-DNA画分を収集する。
    1. 標準のオリゴヌクレオチド精製用のC 18のZORBAXカラムと、以下の勾配を使用します。
      0→15分：8→30％ACN;
      15→21分：30から90パーセントACN;
      21→25分：90→8％ACN;
      25→30分：8％ACN;
  7. 液体窒素中で凍結し、収集したフラクションを凍結乾燥。脱イオン水中にDNAを再懸濁。残留TEAAを除去するためにさらに2回凍結乾燥、余分な注意が必要になります。残留TEAAは、より高い濃度では細胞に対して毒性であり得る。
  8. 目の側面を洗って確認しながら、水中で凍結乾燥したBG-DNAを再懸濁電子管、および〜25μMの原液に希釈する。 4℃で分注し店。サンプルは、顕著な劣化なし〜9ヶ月間保存した。

一価量子ドットと3ラベリング生細胞

  1. 任意に、カゼイン（0.5％）またはウシ血清アルブミン（BSA、1〜3％）のような試薬を用いた撮像実験に直前MQDSを不動態化する。
  2. 全反射蛍光（TIRF）-qualityガラス上のSNAP-タグ付きタンパク質を発現する細胞をプレート。この実験では、SNAP-タグ付きNotch1受容体と高品質のガラス表面に発現するU2OS細胞株を使用しています。
  3. 細胞はガラス（〜24時間）に装着した後、増殖培地を除去し、PBSで洗浄し、PBSの〜100〜150μlあるいは〜1μMのBG-を含む細胞培地で室温で10〜30分間、細胞をインキュベート上記のステップ2.6からのDNA。
  4. BGとのインキュベーション後、慎重にPBSまたは細胞培地で細胞を洗浄。目で〜5〜10分間細胞をインキュベート電子化MQDSは、ステップ1.2.9で生産（および必要に応じてステップ3.1で不動態化）。
  5. 必要に応じて、結合していないMQDSを洗浄し、画像化と文化の両方のための適切な緩衝液/メディアに細胞を返す。溶液中の未結合のMQDSが分析中に検出できないようにバウンドMQDSに比べて非常に急速に拡散したとしてTIRFモードで画像化されるべきであった細胞については、最終洗浄段階は、多くの場合、不要であった。

4。顕微鏡と分析

  1. 画像TIRF顕微鏡を用いて細胞。
    注：スコープは、分離可能な励起および発光フィルター、またはカスタムのQDフィルターキューブを持っている必要があります。 QDは、低波長レーザー（405または488 nm）を持つ最高の興奮している。異なる直径の量子ドットは、典型的には、大きなストークスシフトに関連した、特徴的な発光波長を持っている。
  2. 生細胞の基底面を画像化しつつあるためMQDSの明るさ、TIRFの高いフレームレートで画像を収集。
    注：別の方法として、単一分子ダイナミクスはFolloのことができますスピニングディスク共焦点顕微鏡を使用して他の焦点面で結婚。自動化された単一粒子追跡ソフトウェアを正確に明るく光安定MQDSを追跡する時、一般的に成功している。

結果

有機から水相へのQDの相転移は、MQDSの製造のために重要であるが、コンディショニング及びQD固有の両方であり得る。セクション1.1における相転移は、 図3の最初の2つのバイアルのようにきれいな表示されます。転送がよりバイアル3のように表示された場合は、1つが異なる条件で再度試してみてください。

量子ドットは、それらが非包まれた量子ドットとは別にゲル上で移行する必要が負に帯電したDNAで被覆されている一度。コントロールとして開封された量子ドットの一定分量を使用して、第二の、より速く移動するバンドは、 図2Bの第一のゲルに見られるように、ptDNAを添加すると表示されます。 MQDSの完全な形成は、不動帯の損失、および図2Bの最後のゲルに見られるように、モバイル帯にその崩壊で実証されている。あなたのMQD産物の一部が開封された量子ドットから分離単一のバンドとして移動する場合は、あなたのMQDSは、一価およびrであるさらなるステップで使用するのにeady。

細胞標識は、選択した標的に特異的であるべきであり、タンパク質の発現レベルとMQD濃度に依存すべきである。 MQD濃度およびMQDパッシベーション両方の実証最適化は、多くの場合、どのようなアプリケーションに必要とされる。 図4Bは、0.5 nMのから10 nMの濃度範囲MQDSでSNAP-タグ付けされたNotch受容体を発現しているU2OS細胞を標識することを示しています。

figure-results-1
図1 MQDSの標的化モジュール。MQDSは、さまざまな標的化分子によって官能のssDNAにハイブリダイズする。ベンジルグアニン-連結されたDNAは、SNAP-タグ付き融合タンパク質をMQDSをターゲットにしています。その他の5 '修飾とDNA配列は、他の生体分子のさまざまなMQDSのターゲティングを可能にする。/files/ftp_upload/52198/52198fig1highres.jpg "ターゲット=" _ブランク」>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

figure-results-2
MQDSの生産のための図2のスキーム 。 （A）有機相QDはptDNAで包まれたmPEGチオール及びTBABで処理することにより水相に移し、カルボキシPEG6アルカンチオールで不動態化されている。代表TEM画像をそれぞれ、有機QD545、QD585、及びQD605です。 （B）実験的に上記二つのステップで量子ドットとptDNA間の相互作用の化学量論を決定するための方法。 1（QD：ptDNA）QD＆ptDNA化学量論は、経験的に、最終的な反応化学量論が1であるような濃度測定によって確認される。 ptDNAのモル数の初期値は、量子ドットの割合を乗じて：MQD、実際のボリュームのafことで調整 1達成するために必要なモル数得TER共役：1共役をこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

figure-results-3
図3 MQDSの生産のための実験の詳細。（A）が成功の代表的な写真や相間移動に失敗しました。 QDは、視覚的に濃密有機相および低密度水相との間で転送する必要があります。不完全な相分離は、転写不良を示している。 （B）ptDNAアルカン-PEG-チオールに置き換えることができる。右ゲルデータはptDNAのかなりの割合が過不動態化による量子ドットから変位された反応を表している。es.jpg "ターゲット=" _ブランク」>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

figure-results-4
生細胞上の図4のラベリングSNAP-タグ付きタンパク質を、（A）図BG-目標とMQDとSNAP-タグ付き受容体の発現を実証し、添付ファイルおよびラベリング。 （B）は、さまざまなMQD濃度で構築SNAP-ノッチ-mCherryを発現する細胞の代表的なラベリング。 PEG12で不動態化MQDSはmCherryを、特定のラベルを示すと共局在。下部ラベリング密度（<0.5 nM）を、一般に、単一粒子追跡のために好適である。スケールバーは10μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

ディスカッション

MQD設計のモジュール性は、実験的な柔軟性の度合いの増加を可能にする。例えば、MQDS各種の迅速複数の標的の同時イメージングを可能にする独特な色で製造することができる。一本鎖DNA標的配列は、タンパク質に糖12、脂質をMQDSを指揮し、13面ができます。酵素タグの数は、複数のターゲットが差をターゲットMQDSと同時に画像化することができるように、直交反応性を用意しています。 SNAPタグと標的化することに加えて、CLIPタグ、HALOタグを使用してMQDSおよびビオチン化タンパク質と標的タンパク質の標識化も成功した。このプロトコルは、これらのMQDSと生細胞上の表面受容体の特異的標識を示したが、プロトコルは簡単に​​別のコンテキストの数に適合させることができた。

定義された原子価でMQDSを製造する際に重要な方法論的な洞察が〜50ホスホロチオエート連結されていること塩基は量子ドットをラップ（したがって同時に結合する二つの分子を防ぐ）する必要があります。ポリ-S 50シーケンスは、再現可能かつ安定ライフテクノロジーズから605 nmの量子ドットを結合した。この製品は廃止されているが、立体排除戦略は異なるサイズ、形状、スペクトル特性を有する他のベンダーの同様の製品に一般化である。

ptDNA包装されたQDの効率および安定性は、QDの表面の化学的性質および構造に大きく依存する。そのため、プロトコルの成功は、量子ドットの商業的供給源や化学構造に依存する。このプロトコルの目的のために、差の三つの主要な点は、QDのさまざまな商業的供給源との間に存在する：相間移動のために必要な条件の違い;最初のPEG-チオールリガンドの強さの差はptDNAによる変位を妨げる可能性が、結合;露出したCdSeコアの量の差、どの缶ルのmPEGチオール相間移動条件下によるQDのクエンチング広告。

出版物のように、MQDSの生産のための最良の構造を持つQDは4-10 nmの545、585、605＆625 nmの（ 図2A）の発光スペクトルとライフテクノロジーズ社から購入したCdSe / ZnSのコア/シェル量子ドットである。 「ビビッド」製剤（545、605、 等 ）に基づいて、量子ドットは、MPEGチオールの添加によりクエンチし、この用途には適していません。アルドリッチ·海洋ナノテクからのQDはうまく動作しますが、より長い相間移動工程およびトリオクチルホスフィンオキシドによる前処理を必要とする。このプロトコルは、ライフ·テクノロジーズからのQDに最適化されています。

量子ドットをラップするために使用されるポリホスホロチオエート配列が標的に鎖がハイブリダイズしうる先の（ACTG）5の配列を含む、ネイティブ20-merのDNAテールで終了します。このシーケンスは、それが二次構造をほとんど有して、便利で、hybridiz残るPBS中で37℃でエド。 DNA合成へのアクセスがある場合、ptDNAはC 8カラムを使用して合成し、次いで逆相高速液体クロマトグラフィー（HPLC）により精製することができる。 ptDNAは、ネイティブ骨格と同等のオリゴヌクレオチドよりもHPLC上で、後に溶出する。私たちは通常、5 '、DMTは精製後に私たちのホスホロチオエートオリゴヌクレオチド上の保護基を残す。

ptDNA包装された量子ドットの不動態化は、通常、量子ドットのコロイド安定性を向上させ、大部分の実験的なアプリケーションのためにバックグラウンド結合を減少させるために必要とされる。プロトコルは、量子ドットを不動態化するPEG-レイヤーを使用しています。より長いPEGは両方とも大きいけれども、追加のPEGユニットを有するカルボキシPEGアルカンチオール（（CO 2 H）CH 2 O（CH 2 CH 2 O）12 C 11 H 23 SH は 、カルボキシ-PEG12アルカンチオール）は、有意に減少し、バックグラウンドを提供一般的に、より高価。カルボキシPEGアルカでコーティングMQDSねチオールリガンドは、例えば、リン酸緩衝食塩液および培養培地などの生理的緩衝液中で非常に安定している。 4℃でMQDSの長期保存（> 8ヶ月）の有意な凝集またはptDNA剥離11を示さなかった。実験によっては、単独のQDのPEGの不動態化は必ずしも十分MQDSの非特異的結合を減らすことはありません。それは〜50％MQDSの見かけの流体力学的半径を増大しても、実質的に、使用前に20分間、3％BSAを含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中で細胞とMQDS両方をインキュベートすると、細胞への非特異的結合を減少させる。 0.5％のカゼイン不動態化はさらに、非特異的結合を減少させるが、それは、BSAよりも大きい程度には明らかにサイズが大きくなります。

MQDSに相補的なDNA鎖の5 '末端は、異なる生体分子の数の標的化可能にするために改変することができる。共有結合的にタンパク質を修飾するために利用可能確立された技術の数、lはあり一本鎖DNA（一本鎖DNA）とipids＆糖類。一本鎖DNAが細胞外に提示されている限り、それは、可溶性MQDSにアクセス可能である。上記の配列とMQDSは急速に細胞培養条件下でその相補的DNA鎖とハイブリダイズする。セルの厚さであり、負に帯電した糖衣上記の結合配列を高めるようにptDNAとターゲティング配列との間10-20xポリ - （CT）スペーサーは、標的に効果的に行うために必要とされる場合がある。このプロトコルのために、私たちは両方のMQDSにハイブリダイズし、共有結合的に迅速かつ特異的標識のためにSNAP-タグタンパク質に自分自身をリンクします（CAGT）5の相補配列とBG-DNAを作製することにしました。よくアミノ修飾オリゴヌクレオチドに他のNHS-エステルを結合するための同様のプロトコル機能。

単一分子イメージングのための標識の低密度は、典型的には、個別の分子を解決するために必要とされる。不動態化剤を含むPBS中〜0.5nmの最終的なMQD濃度良好な標的である。しかし、これらの高希釈を、時には下で標識細胞をもたらした。この場合は、標識の最適密度が観察されるまで、追加のMQDを添加することができる。 0.5 nMのMQD（ 図4B参照 ）、標的細胞の基底面で〜20 MQDSの取り付けをもたらしたSNAP-タグ付きヒトNotch1の場合には、> 10 nMのMQDの濃度は、高密度のラベリング細胞を作り出した。 MQDSによる細胞標識はプレートされた細胞の密集度の非常に依存していた。過度にコンフルエント細胞は、その基底面にラベルを付けていない。

要約すると、一価およびモジュールのQDを生成する簡単な方法を説明した。これらMQDSライブU2OS細胞上のNotch受容体を画像化することによって実証されるように、生細胞イメージングの幅広い用途において有用性を見出す。 MQDSの適用は、この特定のケースに限定されるものではなく、潜在的に他のタンパク質、核酸、および酵素のような他の細胞標的のために拡張することができる。

開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

DOD W81XWH-1023年10月1日（ZJG）、システムおよび合成生物学のためのUCSFのセンター（ZJG）、NIH 5R21EB015088-02（YJ）およびNIH 1R21EB018044（ZJG＆YJ）からの助成金のP50のGM081879提供された資金。 DSはヒューマン·フロンティア·サイエンス·プログラムによる索引懲戒ポスドク研究フェローシップによってサポートされていました。

材料

Analysis Software
この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
mQD Production
Phosphorothioate DNA:
(A*)x50-(ACTG)x5IDTほとんどのDNA合成会社
Quantum Dots:
QDots 525, 585, 605 & 625InvitrogenQ21791MP (545), Q21711MP (585), Q21701MP (605)QD625 のカスタム QD 合成。
QD610オーシャンナノテクQSP-610-10 
QD 610 ラムダアルドリッチ731854
クロロホルム、99.8%ACROS67-66-3
テトラブチルアンモニウム ブロマイド、98.0%シグマ アルドリッチ426288
mPEG チオール [2,5,8,11,14,17,20-ヘプタオキサドコサン-22-チオール]、MW 354.5、95%ポリピュア11156-0695
HSC<サブ>11EG<サブ>6CO<サブ>2H [HS-(CH2)11-(OCH2CH2)6-OCH2CO2H]ProChimiaTH 003-m11.n6-0.1
ホウ酸、99.5%Sigma-AldrichB0394
酸化ナトリウム、99.0%ACROSS / 4845
塩化ナトリウム、98%Sigma-Aldrich310166
Agarose LEU.S. Biotech SourcesG02PD-125
タノールSigma-Aldrich459828
BG-DNA Production
Amine DNA:
(CAGT)5-NH2IDTN/AほとんどのDNA合成会社
(CAGT)5(T)40-NH2>IDTN/AほとんどのDNA合成会社
NHS-GLA-BenzylguanineNew England BiosciencesS9151
DMSOSigma-AldrichD8428
HEPES バッファーSigma-Aldrich83264
NAP5 カラムGE Healthcare17-0853-01
C18 カラム
アセトニトリル
Mammalian Cell Culture &
SNAPタグ付きタンパク質を発現するNew England BiosciencesE9100S
McCoys 5AUCSF 細胞培養施設U2OS培養
ウシ胎児血清UCSF細胞培養施設U2OS培養に特化した
施設 PBSUCSF細胞培養施設
Nunc Lab-tek II Chamberedカバーガラスサーモフィッシャー サイエンティフィック155409
マトリプレート 96ウェルプレートブルックスライフサイエンスシステムMGB096-1-2-LG-L
BSA
5% アルカリ可溶性カゼインEMD ミリポア70955すべてのカゼインが同じ
(Optional) DNA Synthesis Reagents
5'アミン修飾剤 C6Glen ResearchOct-06
dA-チオホスホロアミダイトGlen Research10-700<
FIJIhttp://valelab.ucsf.edu/~schindelin/
RyTrack.pro http://sun.iwu.edu/~gspaldin/rytrack.html
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参考文献

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