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方法論記事

アンエクスビボモデル

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DOI:

10.3791/52205

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2015年2月5日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, University of Münster, 2Germany and Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Münster, 3Institute of Physiology I - Neuropathophysiology I, University of Münster

この記事について

サマリー

炎症性脱髄障害の皮質病変における脱髄とニューロンのアポトーシスのメカニズムに対処するために、異なる動物モデルが使用されます。ここでは、オリゴデンドロサイト特異的なCD8+ T細胞を脳切片に使用して、オリゴデンドログリアとニューロンの死をもたらすex vivoアプローチについて説明します。モデルの潜在的なアプリケーションと制限について説明します。

要約

ニューロンと軸索の破壊を伴うオリゴデンドロサイトの死は、多発性硬化症(MS)のような炎症性脱髄障害における皮質および皮質下の灰白質病変における典型的な組織病理学的所見です。これらの疾患では、主にミエリンおよびオリゴデンドロサイト関連抗原に対する推定特異性のCD8+ T細胞が見出されるため、灰白質病変におけるニューロンアポトーシスはこれらの細胞の副次的な影響である可能性があります。言及された病態生理学的プロセスの根底にあるメカニズムを研究するために、さまざまなタイプの動物モデルが確立されています。しかし、彼らはMSのいくつかの側面を模倣していますが、「側副神経細胞死」の正確なメカニズムと時間経過を解剖することは不可能です。このコースに取り組むために、ここでは、オリゴデンドロサイト指向性CD8+ T細胞攻撃後のニューロン損傷のメカニズムと時間応答を研究するためのプロトコルを示します。ミエリン鞘とオリゴデンドロサイトのみを標的とするために、in vitroで活性化されたオリゴデンドロサイト特異的CD8+ T細胞を急性単離脳スライスに転写します。定義された潜伏期間の後、ミエリンとニューロンの損傷をさまざまな関心領域で分析できます。このモデルの潜在的なアプリケーションと制限について説明します。

概要

多発性硬化症(MS)に苦しむ個人の灰白質病変における典型的な病理学的所見である、オリゴデンドロサイトの死とミエリン鞘の破壊は、典型的な病理学的所見です。皮質病変は、これまでに3つの異なるサブタイプ2に分けることができます:皮膜下病変、皮質内病変、白質皮質病変。白質プラークと比較して、浸潤物はCD8+ T細胞が優勢であることを特徴としており、灰白質の炎症におけるそれらの決定的な役割の可能性を示唆しています3。さらに、血液、脳脊髄液(CSF)、および炎症性病変内のオリゴクローナル増殖は、CD8+ T細胞自体に見られます4-6。

>jove_content<これに沿って、CD8+ T細胞は異なるミエリンタンパク質7,8に特異的であると仮定されます。実際、CD8+ T細胞は、MHC I発現を示すオリゴデンドロサイトおよびミエリン鞘9,10の近くに見られ、したがって、ミエリン鞘の喪失に関与している可能性がある。このプロセスは、中枢神経系(CNS)の灰白質1,2内の広範な「側副」ニューロンおよび軸索の損傷とともによく見られます。実際、オリゴデンドロサイトとニューロンの直接的および間接的な死は、CD8+ T細胞によって2つの異なるメカニズムを介して誘導されます:(i)パーフォリンとグランザイムの放出に続く細胞傷害性顆粒の形成による細胞膜の腫脹と破裂、および(ii)Fas受容体へのライゲーションまたはそれらの表面でのFasLの露出8,12,13。

言及されたプロセスの根底にあるメカニズムを研究するために、さまざまなタイプの動物モデルが確立されています。この点で、オリゴデンドロサイトやアストロサイトなどのCNSグリア細胞で発現が誘導された自己抗原に特異的なプライミングされたCD8+ T細胞を養子として移植して、その後の灰白質の「側副血行路」ニューロンおよび軸索死を分析することができます14,15。このようなin vivo実験を行うことは、MSのいくつかの病態生理学的側面を模倣するための大きな助けとなりますが、このアプローチは、軸索損傷とニューロンアポトーシスの根本的なメカニズムと動態を解決するのには適していません。

>jove_content<これらの制限を克服するために、オリゴンデンドロサイト指向CD8+ T細胞攻撃後のニューロン細胞死のメカニズムと時間経過を研究するためのex vivoアプローチが確立されました。オリゴデンドロサイト、したがってミエリン鞘産生のみが免疫細胞によって標的とされるべきであるので、MHCクラスI制限されたオボアルブミン(OVA)反応性OT−I T細胞が使用される16。これらの細胞は、続いて、オリゴデンドロサイト(ODC-OVAマウス)でOVAを選択的に発現するマウスから得られた脳切片に移されます17。

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プロトコル

マウスを用いた実験はすべて、それぞれの機関の動物管理使用委員会のガイドラインに従って行われるべきである。

マウスの実験のために1。一般的なコメント

  1. 病原体を含まない条件下でマウスを維持し、それらに食物と水を自由にアクセスできるようにする。
    注：免疫学的パターンは、年齢や性別に応じて変化することができますので、それは実験群における年齢および性別をマッチさせたマウスを使用することが重要です。

2. OVA特異的CD8 + T細胞（OT-I）の調製及び活性化

  1. 脳スライスを準備する前に、5日以下に説明するようにOT-I T細胞の刺激を実行します。
    注：5×10 5活性化エフェクターCD8 + OT-I T細胞（CD8 + T細胞はMHC-I分子の状況においてのみOVA 257-264ペプチドを認識するトランスジェニックマウス）は、スライス毎に必要とされる濃度5× 10 図5は、実験を選ばれました細胞は、同時に、スライスに移行し始めていることをいったん良好な細胞-細胞相互作用を有利にするために最適なものとして味方は、細胞の量は、単一の細胞が8,18をカウントできるように過剰反応を誘発するために高すぎない。
  2. OT-I T細胞を培養するための培地を準備します。 、5％ウシ胎仔血清（FCS）、10mMのHEPES、2mMのL-グルタミン、50μM2-メルカプトエタノール、1％非必須アミノ酸および25μg/ mlのゲンタマイシンを500mlのDMEMを補う。使用するまで4℃でメディアを保管してください。
  3. 参照16に従ってOT-Iトランスジェニックマウスの脾臓を削除します。準備中にそれらを転送します。
  4. 5分、4℃、300×gで70μmのストレーナーと遠心サスペンションを通じて脾臓をすりつぶすことによって、単一細胞懸濁液を生成します。
  5. 赤血球を溶解するために5分間、5ミリリットル塩化アンモニウム-カリウム（ACK）緩衝液（150mMのNH 4 Clを、10mMのKHCO 3、0.1mMのEDTA、pH7.3）中で細胞懸濁液をインキュベートする。
  6. incubati停止再度の10ml培地遠心分離機を持つに上記のように。
  7. 培地中で細胞懸濁液を希釈し、数値を計算する。プレート3×10 7細胞の密度で細胞/ウェルで12ウェルプレートプライムそれらインキュベーションによるOVA 257 - 264（SIINFEKL; 1nMの）およびインターロイキン2（IL-2）（500 IU / ml）のための5日。
  8. 4日後、500 IU / mlの濃度で再度のIL-2を追加する。
  9. 刺激に続いて、製造者の指示に従って負の選択ベースのマウスCD8 + T細胞単離キットを使用して、細胞懸濁液からのOT-I T細胞を精製する。精製は、CD4、のCD11b、CD11cの、CD19、CD45R（B220）、CD49b（DX5）、CD105、MHCクラスII、テル-119、およびTCRγに対する抗体のカクテルを使用して、すべての非CD8 +細胞の枯渇に基づいています/δその後、精製CD8 + T細胞の溶出に磁気カラムを使用して、破棄される。
    注：この。手順で重要なステップREが製造してによって示されている：それは塊の存在は、溶出ステップの間に列をブロックする可能性があるため、反応は、単一の細胞が関与することが重要です。サンプルおよび手順の純度は非特異的抗体バインディングを最小限に抑えるために氷上で行われるべきであるためにByotinカクテルを添加する前に細胞をカウントすることが重要である。

OT-I T細胞急性脳スライスとの共培養の調製

  1. 急性脳スライス19の製造の前に、200mMのスクロースを用いplacedine氷冷生理食塩水を調製し、20mMのPIPES、2.5mMのKCL、1.25ミリモルのNaH 2 PO 4、10mMのMgSO 4を、0.5のCaCl 2及び10mMデキストロースそして人工脳脊髄液（ACSF）125のNaCl、2.5のKClを使用して1.25のNaH 2 PO 4、24mMのNaHCO 3を、2mMのMgSO 4を、10mMのデキストロース2のCaCl 2、。使うによって7.35に各溶液のpHを調整するgのNaOHを。 ACSFのpHを調整する前に、溶液を、95％O 2および5％CO 2の混合物でバブリングされなければならない。
  2. 解決策を事前に冷却する。
  3. 8麻酔- （10週齢のマウスを、例えば、のC57Bl 5.0％イソフルラン、5.0％ハロタンまたは待ち ​​腹腔内を介して100mg / kgのケタミンおよび10mg / kg体重のキシラジンを注入を使用してコントロールまたは吸入トランスジェニックODC-OVAマウス17のような/ 6麻酔のための麻酔のレベルを評価し、一度にそれらを斬首するためにつま先のピンチを使用しています。制度的動物のケアに従ってマウスを安楽死させると安楽死のための委員会の基準を使用。
  4. 腹の位置にマウスを置く。駆除と矢状頭皮をカット。 、矢状頭蓋骨を開き、スクープの助けを借りてすぐに脳を除去し、接着剤を使用してビブラトームの板の上にそれを修正。
  5. 準備placedine氷冷生理食塩水でプレートを埋める。
  6. ビブラトームで300μmの冠状切片をカットします。
    注：この手順は、知られているnは、少なくとも8時間19-21の時間間隔内で機能的な細胞研究のための適切な実行可能な無傷の組織標本を得た。この期間の後、すでに6時間後に開始し、準備は品質の低下を示している事実、すなわち、活動電位発生と伝播などの基本的および機能的特性が変化する。
  7. 切片化した後、ACSFで満たされた12ウェルプレートの各ウェルに直ちにつのスライスを転送する。
  8. スライスごとに慎重に5×10 5 OT-I T細胞を追加します。
  9. インキュベーター（37℃、5％CO 2）中で、最大8時間スライスをインキュベートする。
  10. インキュベーション期間の後、収穫スライスおよびOCT化合組織-tekのを使用してそれらを埋め込み、液体窒素中でそれらを凍結する。 例えばへの更なる組織学的研究のために-20℃で保管してください（抗MAPIIまたは抗シナプトフィジン抗体を使用するなど、）ニューロンの構造を評価するか、アポトーシス（ 例えば、抗カスパーゼ3抗体を使用し、抗NeuNの抗体）を、標準的な手順に従って。

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結果

オリゴデンドロサイト特異的CD8 + T細胞による脳切片をインキュベートした後、希突起膠細胞、ならびに神経細胞（それぞれ図2Aおよび図1C）、アポトーシスを受ける。アポトーシス（ 例えば、カスパーゼ-3、TUNEL）の組織学的徴候が早いインキュベーションの3時間後に検出することができる。潜伏期間は準備と再現性のある結果の良い品質を保証するために、8時間より長くてはならない。アポトーシス細胞は髄地域で優勢ですべてのスライスの上に見つけることができます。構造的完全性およびアポトーシスニューロンスライスの代表的な組織学的染色は、 図1A-Cに示されている。

結果パラメータを評価するために重要であるインキュベーションの間の種々の時点がある。我々の研究室で行われる典型的な時間経過後に、すなわち、細胞 - 細胞相互作用は、時間0で、その後3,4および6時間（最大の相互作用が観察された）、分析パラメータを含む相互作用が開始されました。多くの場合、非常に簡単に説明されて適用することができる組...

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ディスカッション

別の動物モデルは、MSのような炎症性脱髄性疾患の病理学的特徴に対処するために、最後の数十年にわたって記載されている。 インビボでのマウス及びラットモデルは広く疾患の病態生理学的特徴を模倣するために使用される、すなわち、脱髄及び髄鞘再形成のプロセスの結果の分析炎症および神経変性の混在エピソードの。それにもかかわらず、唯一のex vivoでのアプローチは、正確な基礎となるメカニズムを分析することができます。

急性脳切片の調製物はまた、広く分布したモデルであり、信頼性が高く、複製可能と考えることができる。細胞間相互作用 - の単離およびオリゴデンドロサイト特異的免疫細胞のインキュベーションとの組合せでは、特にメカニズムおよび免疫細胞の攻撃および細胞の動態を研究するという点で、特定の実験的な問題に対処するために使用することができる。他のex vivoでのアプローチが知られており、広くている22を使用するが、すなわち、WTにおいてカスパーゼ3免疫反応性を検証する別の「排除」の同時染色を行うことにより、挑戦することがで...

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開示事項

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

この作業は、ミュンスターの学際的臨床研究センター (IZKF) (SEED 03/12, SB), Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB TR128, TP B6 to S.G.M. ME3283/2-1 to S.G.M.) とミュンスターのInnovative Medizinische Forschung (I-BI111316, SB and SGM.) の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
12ウェルプレートコーニング3513
2-メルカプトエタノールGibco31350-010
2-メチルブタンロス3927.1
70 & マイクロ;m ストレーナーファルコン352350
CaCl2Merck1.02382.0500塩化カルシウム
CD8+-隔離キットMiltenyi Biotech130-090-859
D(+)-グルコースメルク1.08337.1000
DMEMGibco31966-02137 °使用前のCウォーターバス
EDTAシグマE5134
FCSPAAラボラトリーズA15-151子牛血清
ゲンタマイシンギブコ15750-060
HEPES 1 Mギブコ15630-050
IL-2ペプロテック212-12
イソフルランアボット05260-05
KClメルク1.04933.0500塩化カリウム
KHCO3SigmaP9144炭酸カリウム
L-グルタミンGibco35050-038
MgSO4Merck1.05886.0500硫酸マグネシウム
NaClSigma31434塩化ナトリウム
NaH2PO4 * H2Oメルク1.06346.0500リン酸水素ナトリウム
NaHCO3Merck1.06329.0500炭酸水素
NaOHメルク1.09137.1000水酸化ナトリウム
NH4ClSigma213330塩化アンモニウム
非必須アミノ酸Gibco11140-050
OVA (257-264)GenscriptRP10611ovalbumin
PIPES SigmaP6757
スクロースMerck1.07687.1000
Tissue-Tek OCTSakura4583
胎児ナトリウム

参考文献

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