マウス骨格筋におけるDNA損傷の検出と分析その場で TUNEL法を用いた

サマリー

このビデオでは、マウス骨格筋の解剖、組織処理、切片化、および蛍光ベースのTUNEL標識について説明しています。また、TUNELラベリングの半自動分析の方法についても説明します。

要約

末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ (TdT) デオキシウリジン三リン酸 (dUTP) ニックエンドラベリング (TUNEL) は、TdT酵素を使用して、タグ付き形態のdUTPを細胞内の二本鎖および一本鎖DNA切断の3'末端に共有結合的に結合する方法です。これは、DNA損傷と細胞死をin situで検出するための信頼性が高く有用な方法です。このビデオでは、マウス骨格筋の解剖、組織処理、切片化、および蛍光ベースのTUNEL標識について説明しています。また、半自動のTUNEL信号定量法についても説明します。本来の正常な組織の特徴と組織処理条件は、TdT酵素がDNAを効率的に標識する能力に影響を与えます。組織処理は、TUNELシグナル検出を妨げる望ましくない自家蛍光を追加する可能性もあります。したがって、その後の定量に最適なS/N比が得られる組織プロセッシングおよびTUNEL標識法を経験的に決定することが重要です。ここで説明する蛍光ベースのアッセイは、デジタルチャネル減算によって自己蛍光シグナルを除外する方法を提供します。TUNELアッセイは、適切な組織処理技術およびコントロールとともに使用され、組織のアポトーシスを検出するための比較的迅速で再現性のある定量的な方法です。病理学的メカニズムとしてのDNA損傷とアポトーシスの確認、罹患細胞タイプの特定、およびin vivoでの治療効果の評価に使用できます。

概要

ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TdT）dUTPニック末端標識（TUNEL）は^12,23を破る二本鎖及び一本鎖DNAの3 '末端へのdUTPを付加するTdT酵素を使用するプロセスである。アポトーシスとDNA損傷を検出するためのTUNEL法は、最初にGavrieli らによって20年以上前に報告された^{。1,12,24。}それ以来異なる組織標本^7,23,27,40で評価し、最適化されています。 TUNELは、虚血誘導性のニューロン^6,14,29及び心筋^43,44の細胞死、興奮毒性神経細胞死^30,31、および関節炎の治療³⁹においてバイオマーカーとしての研究に使用されている。また、様々なヒト癌において予後因子および腫瘍細胞マーカーとして使用されてきた^{2,3,15,32,37,38,42。}

代替的な方法は、DNA損傷および細胞死の検出のために存在するが、それらは技術的な課題と警告している。サザンブロッティングはquantifするために使用することができるYのDNA全組織溶解物における損傷^7,9-11が、この方法は、細胞のレベルの分解能を提供し、定量化が困難であるされません。コメットアッセイは、細胞^4,20,28,36から保存核を抽出する必要が別の細胞に基づいた方法である。コメットアッセイは、培養された単離された細胞にうまく機能するが、それは、骨格筋組織^8,21から無傷の核を調製するためにはるかに困難である。サザンブロットと同様に、コメットアッセイは、全筋肉組織ホモジネートからの細胞型特異的な情報を提供しない。 TUNEL法の別の方法としては、一本鎖DNA ^25,33,41に対して、又はDNA損傷応答及び細胞死経路（ 例えば、p53は、H2AX、カスパーゼ^{）13,17,22,40}に関与するタンパク質に対する抗体を用いた免疫組織化学である。このような抗体ベースの方法は、高いシグナル対バックグラウンド比を得るために、抗体の完全な特徴付けおよび優​​れた抗体の特異性を必要とする。場合であってもスペックIFIC抗体は、抗原回復手順^34,35を介して標的タンパク質の変性を必要とすることが、存在する。私たちはここで議論したように、容認できないほど高い自己蛍光における筋肉組織結果の抗原検索。代替方法とは異なり、TUNEL、高い信号及び低いバックグラウンドを有するDNA損傷の検出、単純陽性および陰性対照を用いて試験することができる優れた特異性、抗原回復、および細胞レベルの分解能を必要としない、良好な組織浸透を達成する。代替の方法は、通常、一晩のインキュベーションを必要とするのに対し、また、TUNEL法は、完了するのに約4時間かかります。

我々は謝-Liおよび同僚¹⁶によって生成された脊髄性筋萎縮症^（SMA）10のマウスモデルにおける骨格筋細胞死を研究する。筋肉におけるアポトーシス細胞を定量するために、我々は、異なるskeleにわたってロバスト働く組織調製、染色、および定量化の方法を開発したマウスでの異なる発生時点での境筋肉群。我々は、市販のTUNEL標識キットと市販の画像解析ソフトウェアを使用。また、正常に脊髄¹⁰で免疫蛍光染色と組み合わせて、TUNELアッセイを使用している。

ここに記載される方法は、骨格筋における組織病理学、疾患のメカニズム、老化のメカニズム、および発生（前および出生後）、細胞死を評価する研究者のために有用である。 TUNEL法は、細胞のサブセットのみが、影響を受けた細胞レベルの分解能が必要であるモデル系におけるDNA損傷および修復および細胞死の研究のために特に有用である。

このビデオでは、解剖、組織の処理、切片、およびマウス骨格筋の蛍光ベースのTUNEL標識を説明しています。また、半自動TUNEL信号定量する方法を記載する。

プロトコル

注：このプロトコルで説明されているすべての動物手順は、健康²⁶の国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関する指針の推奨に従って行った。プロトコル（MO13M391）はジョンズホプキンス大学動物実験委員会によって承認された。

1.新生児マウスの犠牲、解剖、および固定

1. CO ₂吸入によって新生児マウスを生け贄に捧げる。
2. すぐに膝上後肢を切断。約生後7日目までは、足の骨は、大きな実験室のハサミや鋭利な刃でカットスルーとクライオスタットで、その後のセクションにするのに十分なソフトです。
3. 15mlチューブ中でリン酸緩衝食塩水（PBS）中の氷冷4％パラホルムアルデヒドを10mlの後肢を置く。
4. 浸漬は4℃で4-24時間、ホルムアルデヒド中で後肢を修正。胚組織は数時間を必要とする固定のS。
   1. これはTUNELアッセイの効率を低下させる可能性がある、24時間よりも長い固定をしないでください。
5. ショ糖溶液中に浸漬することにより後肢をCryoprotect。
   1. 同一の15mlチューブにPBS中の10％スクロースにパラホルムアルデヒドを変更し、4℃で一晩インキュベートする。
   2. PBS中30％のショ糖への変更は、4℃で、またはチューブの底に後肢沈むまで、一晩インキュベートする。組織は、スクロースに滅菌濾過されていることを条件とする、より長い期間、30％スクロース中に残してもよい。

2.組織の埋め込み

1. メディアを埋め込むで標識埋め込むの金型ハーフウェイを埋める。
2. 金型の一方の壁にできるだけ近いカット側で、包埋媒体の上に後肢を置きます。金型の外側に後肢の向きをマークします。
   1. いくつかの後肢を埋め込むと同じブロックにカット。しかし、それはすべてのホアヒンことを確認することが重要ですブロックdlimbsは肢の軸に沿ってレベルマッチングにセクションを取得するために、互いに平行に配向されている。
3. メディアを埋め込むと後肢をカバーしています。メディアを注ぎながら、後肢がずれた場合は、鈍先端が鉗子や爪楊枝で再配向する。
4. 少なくとも15分間室温で組織に浸潤する媒体を埋め込むことができます。
5. メディアを埋め込む凍結し、ドライアイス上で直接ドライアイス上またはイソペンタン中で金型を置きます。すべての回での金型のレベルを維持し、埋め込まれた組織の移動を避けるようにしてください。
6. 数ヶ月までのため、カットする直前まで、-80℃で凍結した金型を保管してください。

3.凍結切片組み込み手足

1. -20°Cに設定され、クライオスタットチャンバ温度、-18℃の物体温度。必要に応じて、オブジェクトの温度を下に調整します。
2. 少なくとも30分間、クライオスタットチャンバ内の組織ブロックを平衡化する。正しいブロックの一時eratureは、セクションの品質のために重要である。
3. 10μm以下の厚さで横断切片をカットします。厚い部分は、完全にTUNEL試薬によって貫通されることはありません。アンチロールプレート、ブレード、およびブレードの角度を使用します（通常は5°）はクライオスタットにお勧め。
4. 室温で、ゼラチンまたはvectabond被覆ガラススライド上にセクションを収集します。ドライアイス上でスライドボックスにすぐに配置します。腕の手の届くところにクライオスタットの近くに置かドライアイスで別々の容器にスライドボックスに保管してください。
   1. 100〜200ミクロンをスキップし、手足の長い軸を横断連続切片をカットします。各シリアルレベルで少なくとも3隣接するセクションを収集します。

市販のキットを用い後肢セクション4. TUNELアッセイ（室温でのすべてのステップ記述のない限り）

1. 室温と一晩乾燥するか、週末のセクションでスライドを解凍する。
2. immersinによってセクションを再水和gがコプリンジャー中で2×10分間、PBS中でスライドする。ラボの乾燥は、可能な限りセクションの周りにできるだけ多くの液体を除去し、拭く。
3. 透過性のセクション
   1. 非タンパク質分解、サポニンベースの市販の試薬または0.5％のTween20、PBS中の0.05％トリトンX100のいずれかを使用してください。
   2. 湿度チャンバ内にスライドを置きます。シンプルな湿度室は、箱の底をカバーするために追加されただけで十分な水との緊密な蓋付きの空のピペットチップボックス、です。
   3. セクションをカバーするためにスライド上のピペット十分な試薬（50μL、新生児マウスの手足で十分である）。繰り返し攪拌がスライドをリフトオフするセクションの原因となり、セクションに直接ピペットないでください。
   4. 鈍先端が鉗子を使用して、試薬の滴を広げ、完全にセクションをカバーする部分の上にパラフィルムの小さな長方形を配置します。すべての泡がパラフィルムの下で形成した場合、軽く乾いた、それを持ち上げて、再適用します。
   5. permeabiliでスライドをインキュベートカバーされた湿度室で1時間zation試薬。切片をスライドから持ち上げ始めた場合、透過処理時間が30分に短縮することができる。
   6. コプリンジャー2×5分でPBSでスライドを洗浄します。パラフィルムの長方形は、トップにフロートする必要があり、その後除去し、廃棄することができます。
   7. ラボを使用すると、可能な限りのセクションの周りにできるだけ多くの液体を拭いて乾かしてください。
4. TdTを媒介DNAブレークラベリング
   1. （50μlを新生児マウスの四肢のために十分である）組織切片をカバーするためにスライド上に1倍のTdTラベリングバッファー、ピペット十分なラベリングバッファを作るために、キットの指示に従ってください。 5分間の湿度チャンバー内でインキュベートする。また、コプリンジャーでのTdT標識バッファーでスライドを浸す。
   2. のTdT標識ミックスを作るために、キットの指示に従ってください。キットは、コバルト、マグネシウム、マンガンカチオンを含み、マンガンカチオンは、骨格筋、神経系のTISSを含め、様々な組織に適していますUEは、肝臓、皮膚、および骨。
   3. 陽性対照のために、TdTをラベリングミックスにDNアーゼ（キット中の標識「ヌクレアーゼ」）を追加します。あるいは、キットの使用説明書に従って、37℃で1時間ヌクレアーゼ緩衝液中のDNアーゼポジティブコントロールセクションを事前処置する。交差汚染を防ぐために離れて他の実験的な部分からのDNase溶液とDNase処理セクションを保管してください。
   4. ネガティブコントロールのために、ラベリングミックスからTdT酵素を省略します。
   5. ラボを使用して、可能な限りスライドからできるだけ多くのTdTラベリング緩衝液を除去するために拭く。スライド（セクションあたり50μl）上にピペットのTdT標識ミックスは、パラフィルムの新しい長方形でカバーし、1時間、37℃で湿度チャンバ内でインキュベートする。
   6. 1X停止緩衝液を作るために、キットの指示に従ってください。スライドからのTdT標識ミックスを除去するワイプ実験室を使用して、組織切片をカバーするために200〜300μlの停止バッファーを添加し、5分間加湿チャンバー内でインキュベートする。アル ternatively、コプリンジャーで停止緩衝液でスライドを浸す。
   7. PBSにスライド2×2分を洗ってください。ラボを使用して、可能な限りスライドからできるだけ多くのPBSを除去して拭いてください。
5. 蛍光標識
   1. DNA破壊でdNTPを標識するためにフルオレセイン標識溶液を準備し、キットの指示に従ってください。スライド（セクションあたり50μl）上にピペット溶液は、パラフィルムの新しい長方形でカバーし、そして20分間湿度チャンバー内でインキュベートする。
   2. コプリンジャーでPBS中で2分間洗浄スライド。ラボを使用して、スライドからできるだけ多くのPBSを除去して拭いてください。
   3. （100〜200μlをセクションをカバーするのに十分である）スライド上にPBSおよびピペット中1μg/ mlにヘキスト33258核染色を希釈する。 5分間の湿度チャンバー内でインキュベートする。
   4. PBSで5分間3回洗浄。
   5. 退色蛍光マウンティングメディアでカバースリップし、マニキュアとの縁をシールする。

jove_title "> 5。デジタル画像取得

1. DAPI、FITC、テキサスレッドフィルター（または同等品）と、従来の蛍光顕微鏡を用いて画像を取得する。ラベル付けが成功したと核（完全なまたは断片化）が標識したことを確認するために、より高い倍率の対物レンズ（20Xまたは40X）を使用します。 10倍の目的は、TUNEL陽性涙点の定量のために十分である。
2. 一つの画像に合わせて3つの別々の偽色チャネルとしてヘキスト染色、TUNEL染色、及び自家蛍光信号の画像を収集します。 TUNELのフルオロフォア標識が緑の場合、赤フィルタの画像自家蛍光信号、およびその逆。
   1. その後の閾値化と定量化のためのスライドの間の等価すべての画像の設定をしてください。各フィルタ、プリセットとレコード露光時間、ゲイン、ビニングのために（無ビニングがベストではない）;自動露出またはゲイン設定を使用しないでください。
   2. 最高のINTENの範囲をキャプチャします露出とゲイン設定を見つけるために試行錯誤を使用してくださいすべての染色スライド全体でsities。この意志バイアス定量として、取得された画像には飽和画素が存在しないことを確認してください。
3. 関心の全体の筋肉群の画像を取る。これは一緒に "ステッチ"される複数の画像が必要な場合があります。

6.画像解析

1. TUNEL染色のデジタル画像を分析するために、市販の画像解析プログラムを使用する。商用ソフトウェアを用いた解析は、ここに示されています。あるいは、NIHからのフリーソフトウェアImageJがTUNEL染色を分析することができる。
2. ヘマトキシリン​​およびエオシン（H＆E）とTUNEL染色切片に隣接する部分を染色し、従来の明視野顕微鏡でフルセクションデジタル画像を取る。定量化する解剖学的構造をトレースする解剖学アトラス^5,18,19と組み合わせてこのH＆E画像を使用してください。
3. TUNELチャネルは使用し、定量化する領域の輪郭をトレースし、手動でオフにしヘキストと指導のための自己蛍光チャンネル。マスク内にトレース領域に変換する（選択された画素の集合が、分析されるべき座標）。
4. TUNELチャネルをオンにします。画像解析プログラムにおける強度閾値関数を使用して、すべての自己蛍光信号を除外するために低い閾値を設定する。
5. 研究·セット内のすべての画像に同じしきい値設定を適用します。マスクに閾値化の選択を変換します。
6. 各画像には、筋肉の領域マスクとTUNELマスクを組み合わせる。新しい組み合わせのマスクのみトレース筋肉領域内TUNEL信号を表す。
7. トレース筋肉領域内TUNEL信号のオブジェクトとオブジェクト領域の数を決定するために組み合わせてマスク上にマスク定量を行う。 ImageJの中の粒子分析機能を使用してこれを実行します。

結果

成功した染色、TUNEL陽性シグナルは、強度しきい値を設定することにより、自己蛍光から分離するのに十分な明るすべきである。低倍率でのTUNEL陽性のオブジェクトは、骨格筋（ 図1A）で明るい不規則な断片として表示されることがあります。関与する細胞死のタイプはアポトーシス（ 図1B）である場合は、より高い倍率で、古典的なアポトーシス形態といくつかのTUNEL陽性のオブジェクトは、観察されるべきである。ポジティブコントロール（DNアーゼが追加された）部分（ 図1C）ですべての組織全体に均一に分布する、豊富なTUNEL陽性シグナルを示すべきである。ネガティブコントロール（反応から省略TdT酵素）は、低強度の背景と自家蛍光信号のみ（ 図1D）を得る必要があります。この組織は、正常なアポトーシス（ 図1A）の率が高く、皮膚は、全体の脚部における内部陽性対照を提供する。

レッド血細胞は、骨、および内皮細胞は、有意な自己蛍光シグ...

ディスカッション

マウス骨格筋におけるDNA損傷に関連するアポトーシスを検出し、定量的に分析する方法について説明する。手順は、組織採取、TUNEL染色、デジタル画像取得および画像解析を含む。一般的な組織学的部品やツールが必要であり、特別な商業TUNELキットが必要です。必要とされる必須の大きな装置品目はクライオスタット、デジタル画像機能を有する落射蛍光顕微鏡および画像解析のためのコンピュータシステムである。

実験者は潜在的な落とし穴に注意する必要があります。組織自己蛍光は、蛍光イメージングにおける主要な関心事である。 unperfused動物では、残りの赤血球は、かなり高い自家蛍光信号に寄与するであろう。内皮細胞はまた、かなりの自己蛍光であってもよい。そのため、自家蛍光がTUNEL陽性シグナルと間違えないことを確認することが重要である。この評価は、容易になしフルオロでチャネルの画像を撮影することによって達成されるuorophore、TUNEL陽性チャネルから比較可能な減算に使用する。このように、蛍光ベースのTUNEL法は、バックグラウンド染色のための内部統制を提供しない比色明視野顕微鏡法よりも優れて...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
4% Paraformaldehyde in phosphate buffered saline	Electron Microscopy Sciences	19202	ここで説明する手順では、粉末から新鮮な4%溶液を調製しました。任意の供給業者からのパラホルムアルデヒドを使用することができます。調製したホルムアルデヒド溶液は4°Cで保存する必要があります。Cであり、有効期限(最大数か月)以降は使用しないでください。パラホルムアルデヒドは発がん性物質であり、吸入や皮膚接触による毒素です。パラホルムアルデヒドを取り扱う際は、MSDSに定められた注意事項に従ってください。
スクロー	スシグマ	S0389	凍結前の組織の凍結保護に使用されます。どの供給者からのスクロースも使用できます。
O.C.T.化合物	Tissue-Tek	4583	凍結切片用の埋め込み培地。
クライオスタット	ライカ	CM 3050S	ここで説明する製剤には、ライカCM3050Sクライオスタットを使用しました。10 μ を切断できる任意のクライオスタット。mセクションを使用できます。
スライドガラス、25 x 75 x 1 mm	フィッシャー	12-552-3	スライドは、どのサプライヤーからでも使用できます。
ゼラチン	シグマ	G-9391	ゼラチンは、スライドガラスへの組織切片の接着を促進するために使用されます。スライドガラスをゼラチンでコーティングするには、2.75 gのゼラチンと0.275 gのクロムミョウバンを500 mlの蒸留水に溶解し、60°Cに温めます。C、スライドを数秒間浸し、乾かします。どのサプライヤーからのゼラチンも使用できます。あるいは、ゼラチンプレコートスライドを購入することもできます。
クロム(III)硫酸カリウム十水和物(クロムミョウバン)	シグマ	243361	クロムミョウバンをゼラチン溶液に添加して、スライドガラスへの組織接着を促進します。これは、吸入や皮膚接触による発がん性物質および毒素の可能性があります。クロムミョウバンを取り扱う際は、MSDSに定められた注意事項に従ってください。
Vectabond組織接着試薬	Vector Labs	SP-1800	スライドガラスへの組織接着性を向上させるためのオプションの基材です。ゼラチンコーティングされたスライドを代わりに使用することができます。
Tween20	Sigma	P9416	組織を透過処理するために使用される洗剤です。どのサプライヤーのTween20も使用できます。
Triton X100	Sigma	T8787	組織を透過処理するための洗浄剤です。どのサプライヤーのTriton X100も使用できます。
TACS 2 TdT フルオレセインin situ アポトーシス検出キット	Trevigen	4812-30-K	蛍光ベースのTUNELラベリング用の商用キットです。
DNase/ヌクレアーゼ	Trevigen	4812-30-K	(キットに付属)
DNase/ヌクレアーゼ緩衝液	Trevigen	4812-30-K	(キットに付属)
10x リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、pH 7.4	Amresco	780	洗浄および希釈用に1x PBSを製造します。任意のサプライヤーのPBSを使用できます。
DNaseフリー水	Quality Biologicals	351-029-131	どの供給者からの水も使用できます。
Hoechst 33258	Sigma	94403	核染料。任意の青色蛍光核染料を使用してもよい。DNA結合色素であるHoechstは発がん性が疑われる物質であり、皮膚接触を最小限に抑えるために保護具で取り扱う必要があります。
パラフィルムM	マルチプル	807	疎水性フィルムまたはカバースリップを使用することができます。複数のサプライヤーから入手可能です。
デジタルカメラ付き蛍光顕微鏡	--	--	赤、緑、青の蛍光を別々のチャンネルでデジタル的に捕捉できる蛍光顕微鏡であれば、どれでも使用できます。
Vectashield色あせ防止メディア	Vector Labs	H-1000	任意のサプライヤーからの色あせ防止メディアを使用することができます。
ガラスカバースリップ、No.1厚さ	Brain Research Labs	2222-1	どのサプライヤーからのカバースリップも使用できます。22 x 22 mmの最小サイズは、新生児マウスの脚部切片には十分です。
マニキュア	テッド・ペラ	114-8	カバースリップのシールに使用。どのサプライヤー(通常の小売業者を含む)からのマニキュアも使用できます。蛍光イメージング中に光を反射する可能性のある色や添加物を含むマニキュアの使用は避けてください。