肺気腫とタバコ煙曝露マウスにおける末梢気道リモデリングの自動測定

ないモデルが完全ヒト疾患^（2）のすべての機能を複製することができないので、COPDを研究するための動物モデルの使用は困難である。ほとんどの研究者は、それらの肺生理学、病理学、遺伝学、および代謝物のマウスとヒトの間の類似性のCOPDをモデル化するために、マウスを使用しています。また、マウスは勉強するのが比較的安価であり、肺気腫、小さな気道リモデリングの両方がCS曝露^（5,7-9）の6カ月以内に発症する。

タバコの煙によって誘発されるCOPD：いくつかの方法が、マウスにおいてCOPDを誘発することができる。ほとんどの研究者は、人間のCOPDの主な病因因子であるCS、にマウスを公開。 6ヶ月のCS曝露は、マウスにおいて肺気腫および小さな気道リモデリング（SAR）の開発を引き起こすが、誘導される疾患の重症度を検討マウス株に依存して変化する。 AKR / Jマウスはextremelであるのに対し、例えば、NZWLacZマウスは、CS誘発性肺気腫の発症に耐性である感受性の^y（10）。ほとんどの研究者は、多くの遺伝子標的マウスとしてのCS暴露モデルでC57BL / 6系統のマウスを研究この株でご利用いただけます。 CS暴露の6ヵ月後、肺気腫、小気道線維症は、野生型（WT）C57BL / 6マウスで開発し、両方の病変が重症度^（5,10）で比較的穏やかです。鼻専用および全身曝露：研究者は、CS暴露の2種類を使用しています。 1）それは、より労働集約的な方法であり：鼻のみの露光技術の主な欠点は、ということです2）マウスを、動物のストレス応答および温熱療法を誘導することができる小室^（11）に拘束されなければならない。 （本明細書に記載）の全身暴露の主な欠点は、それらの毛を掃除するとき、動物がニコチンとタール製品を摂取する（同様に吸い込む）ことができることである。全身CSに曝露されたマウスは、より低いヘモグロビンレベルを有し、鼻のみ^CS（12）に曝露した動物と比較して、体重の損失を減少させた。

肺機能検査（のPFT）：肺コンプライアンスとエラスタンスの措置がこの開発は比較的軽度肺気腫による6ヶ月間空気またはCSに暴露されたC57BL / 6野生型（WT）マウスでは、通常は似ています株は^{、CS（10）}に露出している。気腫性の破壊はより重篤である場合しかし、肺コンプライアンスと圧力 - 体積（PV）の左シフトの増加は、ループを検出することができる流れる。後者は、C57BL / 6 WTマウスよりもより重度の肺気腫型を持つCS曝露C57BL / 6系統の遺伝子標的マウスにおいて^{、CS（10）}の影響を受けやすいマウス株では、例えば、観察することができる^（13）、または^CS（14）の影響をより受けやすく、環境の変化にさらさCS曝露マウスで。このプロトコルは、組織における肺の弾性反跳（準静的肺コンプライアンスの増加[Cstに]の削減と削減を測定するための小動物人工呼吸器を使用していますエラスタンス[H]）、PVフローループ、麻酔したマウス^（15,16）における気道組織抵抗の変化。

肺気腫の措置：その分布が空間的に不均一であるため、CS-暴露C56BL / 6系統のマウスでの肺気腫の開発の分析は困難である。いくつかの異なる方法は、マウスの空域の拡大を定量化する。使用された最初の方法は、平均線インターセプトさ（L _{^M）（17）}であった。しかし、Lの_M法は（肺のすべてのセクションがランダムにサンプリングされていない限り）疾患の不均一性をキャプチャしない場合があり、その使用は、したがって、分析にオブザーバーバイアスを導入する可能性が遅く、手動のプロセスです。破壊的なインデックス^{[DI、（18）]}は、ヘマトキシリンおよびエオシン染色した肺切片の印刷されたデジタル化された画像の上に置か50均等に分配ポイントを持つ透明シートを使用して空域の拡大を定量化する。 PI法のスコア各ポイントのACを囲む領域この領域内の肺胞管と肺胞壁が破壊される程度にコーディング。 DI方式の主な欠点は、時間がかかり、他の方法^（19,20）よりも正確ではないということである。

このプロトコル措置はギルの染料で染色パラフィン包埋肺切片上歯槽弦長と肺胞の領域を意味する。形態計測ソフトウェアは、（組織は白色であり、空域が黒色である）は、バイナリ画像に肺切片の画像を変換し、によって識別領域内の各弦の長さを定量化し、水平線と垂直線（コード）の一様格子とソフトウェアを重畳する空域などのソフトウェア。この方法を使用して、標準化された、比較的自動化方法^（21）肺のすべての部分における肺胞の大きさを測定することが可能である。

小気道リモデリング（SAR）：ECMタンパク質沈着の増加（特にinterstitia小気道の周りのLコラーゲンは）CS-暴露動物で発生し、障害物を気流に貢献します。研究者は、肺気腫の開発^（22）と同じ頻度でCOPDの動物モデルでSARを勉強しません。 CS曝露マウスにおけるSARを定量化するために、このプロトコルは、パラフィン包埋した肺切片における末梢気道（気道300と899メートルの間の平均直径を有する）の周りに堆積されるECMタンパク質の層の厚さを測定するために画像解析ソフトウェアを使用してマッソン三色染色で染色。

プロトコルが完了するまでに25週間〜かかります。プロトコルは、24週間の空気や煙にマウスを暴露した。煙曝露の最後に、プロトコル対策肺マウスにおける機能、および肺を、一定の圧力まで膨張固定し、同じ日に除去される。追加の時間は、カットを埋め込み、かつ肺切片（2~3日）を染色し、（研究した動物の数に応じて2~4日）の画像をキャプチャし、分析する研究者のために必要とされる。このプロトコルは、マウスにおいて、年齢に関連した気腔の拡大を測定するために使用することができる。

このプロトコルで説明されているすべての手順は、ブリガムでの施設内動物管理使用委員会とウィメンズ病院/ハーバード大学医学部によって承認されている。

1.全身タバコ煙曝露

1. ヒュームフード内に設置します（ 図1を参照）、全身煙露光装置で煙にマウスを公開します。
   注：デバイスが自動的に車輪の研究タバコをロードし、Lタバコをights、および副流煙収集チャンバ内の副流煙を収集し、煙草を吐出する。マシンが主流と側流煙の混合物を作成するためにポンプによってタバコから抽出された主流煙と副流煙を兼ね備えています。混合および希釈チャンバー内のファンが外気と煙を混合し、露光室に煙を駆動します。
2. 露光チャンバ内（ 図1）を除去し、ケージの蓋なしでマウスを含む置きケージ。マウスは、それらのケージの中を自由に移動できるようにすると煙の曝露（〜1.75時間）の期間中、食料や水へのアクセスを持っている。
3. 排出されたタバコを消すためにタバコの室の下に水で満たされたバケツを置きます。ポンプを介してエタノール（100％）を実行し、デバイスに接続します。タバコのガーゼの自動化されたタバコのロード、ポンプのパフ、および加熱を開始するデバイスのマイクロプロセッサエレメント、上のスイッチティンワイヤー。
4. デバイスロード、ライト、一度に10タバコを吸うし、次に使用されるタバコを排出し、10タバコの新しいバッチでそれらを置き換え、この処理を繰り返す。各サイクルは、9分。
5. 5日目に最初の日に20本、二日目の40タバコ、三日目に60タバコ、4日目80タバコ、および100タバコから煙にさらすことで煙にマウスを慣らす。順応期間中は、苦痛の徴候を慎重にマウスを観察します。
6. 順化の5日後、5または6日、週ごと、日あたり100本としたマウスを公開6ヶ月間。煙曝露のこのレベルは、C57BL / 6野生型マウス（23,24）は、比較的控えめな気腔の拡大を誘導するために必要とされる。 6ヶ月間の周囲の室内空気へのコントロールマウスを公開します。その後体重上の煙の曝露の影響を評価するために煙順化と毎​​週の前に、マウスを計量。
7. 総浮遊粒子を監視最初の60タバコ後の露光チャンバー内の物質（TSPM）が燻製されています：
   1. ろ紙を秤量し、時限フィルタサンプラと乾式ガスメータに接続されているインラインフィルターホルダーにそれを置く。時限フィルタサンプラ濾紙を通して露光チャンバから空気を引き出し、ガスメータは、サンプリング中に空気の流れを測定する。
      注：露光チャンバ空気20 m ³のようなフィルタートラップの粒子状物質は、（乾式ガスメータで測定）は、フィルタを通過する。
   2. 前およびm当たりの量（mgで^）3空気をサンプリングした後、フィルタ重みの変化としてTPM数を計算します。理想的なTPM数は150〜200 mg / m3 ^である^。
8. タバコの全てが喫煙された後、露光チャンバからケージを除去し、20分間の苦痛の徴候についてマウスを観察する。
9. 各使用後に100％エタノールとポンプを清掃し、かつ促進するための機械隔週内のすべてのポートおよびロッドをきれいに空気循環とタールの蓄積を防ぐ。

2.肺機能検査（PFTS）および肺インフレ

1. 曝露の終わりには、生理食塩水200μlに腹腔内経路でケタミン（100mg / kgの）、キシラジン（10mg / kg）、およびアセプロマジン（3mg / kg）のカクテルを提供することにより、各マウスを麻酔（USPグレード）と乾燥からそれらを防ぐために、目に獣医軟膏を使用しています。動物が麻酔の外科的平面になるまで待って、つま先ピンチ方式を使用して評価する。
2. 気管に肌の前方を剃るし、エタノールに続いてヨウ素含有溶液を用いて地域を消毒する。オートクレーブ処理ハサミを使って気管に皮膚や皮下組織の前方を通じてミッドライン切開を行い、気管を露出させ鉗子で胸骨甲状筋を分離する。
3. オートクレーブtと共に気管の前部側面に気管切開を行い、気管に絹縫合後方の2インチの長さを渡すレイチェルはさみは、気管切開に気管カニューレ（18 G）を挿入し、縫合糸で固定します。
4. 気管カニューレを介して人工呼吸器のアダプターのYチューブにマウスを接続し、10ミリリットル/ kgおよび150呼吸/分の呼吸数の一回換気量を用いた機械換気を開始する。
   注：マウスが十分に正確なPFTの測定値を得るために麻酔されていることを確実にするために、この段階で重要である。動物は、麻酔の外科的平面にない場合麻酔マウスを再用量。 PFT操縦のすべての全体の時間は約7.5分であるので、麻酔の外科手術面が達成された後の麻酔薬をマウスにredoseすることが通常必要ではない。麻酔の導入から安楽死の合計時間は〜20分です。
5. 全肺気量（TLC）吸気容量（IC）を測定し、肺の無気肺を減らすために、ボリューム履歴の3倍に肺に空気を入れます。次に、perfor、広帯域周波数強制振動マヌーバ（クイックプライム3摂動続く呼吸器系のエラスタンス（Ersで）およびコンプライアンス（Crsの）を、単一周波数強制振動マヌーバ（スナップ-150摂動）をメートルおよび動的抵抗（R）を評価）及び中枢気道抵抗（R _n）は 、組織抵抗（G）、組織エラスタンス（H）との比G / N（）を測定する。最後に、ボリューム圧式流量操縦中に記録quasic静的コンプライアンス（C _目 ）。
6. これらの手技の各々を5回繰り返して（または整合性測定値が得られるまで、追加的な措置を実行する）と、TLCに測定値の各繰り返しの組の間に3回膨張させる。各マウスの各パラメータの平均値を記録します。
7. 人工呼吸器からマウスを外し、頸椎脱臼に続いてCO _{2ナルコーシス}とそれを安楽死させる[この安楽死の方法は、私たちの施設内動物管理使用委員会によって承認されている]。横隔膜をカット、オペアンプ正中線で胸部、およびEN肺を露出させ、前方リブを削除します。気管周囲の皮膚と皮下組織を解剖し、気管に絹縫合後方の第2インチの長さを渡す。
8. 肺膨張（ 図2）のための機器を準備します。
   1. 滅菌PBSに完全に500ミリリットルの円錐形の三角フラスコを¾埋めるゴム栓でそれを密封する、それを反転させて、リングスタンド上にサスペンド（リン酸緩衝生理食塩液pH7.4（PBS）のメニスカスは上記25センチメートルようなものであることマウスの心臓）。
   2. ゴム栓を通してフラスコにPBSにセット静脈寄付の一端を挿入します。その開口部をフラスコを残してPBSを交換する空気を可能にするために、PBSのメニスカスの上にあるように、ゴム栓を通してプラスチック血清学的ピペットの6インチの長さを挿入します。
   3. 与えセットのバルブを開き、システムが与えセットから空気を洗い流すためにかかわらず、PBSを実行します。
9. INTRを接続します気管カニューレに設定avenous寄付、バルブを開き、肺が完全に膨張するまで、PBSは重力により肺に流れることを可能にする。 、バルブを閉じて気管カニューレに外科用縫合糸の先端を使用して気管をオフにネクタイ、そしてカニューレを取り外します。
10. 鉗子で気管を持ち上げて、結び目に気管近位をカットし、気管や肺に結合組織後部を解剖。慎重に（それらをニッキングせずに）、肺を除去し、10％食塩水緩衝ホルマリンを含むチューブで肺を置く。 RTで肺O / N、および次の日を修正し、PBSで二回洗っ。
11. 、パラフィンで肺を埋め込む5μmの厚さの切片をカットしてから、下記のようにギルの染色液でセクションを染色する。

3.肺気腫

1. パラフィン包埋肺切片のギルの染色
   1. プラスチック製のラックにスライドを置き、オーブンで20〜30分間70℃でそれらをインキュベートする。
   2. スライドを脱pariffinizeキシレンの4変化のそれぞれで2分間、それらをインキュベートすることによって。
   3. 95％エタノールの二つの変更の各々に2〜3分間、続いて100％エタノールを2回交換し、それぞれで2~3分のためにそれらをインキュベートすることによってスライドを再水和し、その後2~3分間、PBSで二回スライドを洗浄するソリューションのそれぞれの変更のために。
   4. ギルのヘマトキシリン​​および変更されたハリスヘマトキシリン​​の1：1混合物中で18〜48時間のスライドをインキュベートします。
   5. 蒸留水五変化のそれぞれにおいて2分間、スライドを洗浄し、95％エタノールの二つの変更の各々に2~3分間、その後インキュベートすることによってスライドを脱水し、100％の2変化のそれぞれに2〜3分間続いエタノール。
   6. キシレンの4変化のそれぞれで2分間、それらをインキュベートすることによって、スライドをオフにします。
   7. 明確なマウンティングメディアでスライドをマウントし、その後の分析の妨げになるもの、気泡を導入することなく、カバースリップを追加します。
2. ランダム化画像収集：
   1. TIFFファイルとして白黒画像を取得する顕微鏡、20×対物レンズ、および高品質のデジタル画像を取得することができるカメラおよびソフトウェアを使用してだ。
   2. 肺の下に膨張した領域を避け、実験条件を知らされていないオブザーバーで、無作為化の方法で、マウスあたり〜20-30画像（X 200倍率）をキャプチャします。
   3. スライド上にマイクロスライド電界ファインダーをテープで固定します。フィールドファインダーは（垂直方向）の文字で標識された一連の正方形を含むグリッド（水平方向）数を有しており、各四角は、中央に十字（+）を有し、一つの文字で識別されそして数（ 例えば 、A1、A2、...... Z25）。
   4. ランダムに画像キャプチャのための正方形を選択する確率場ジェネレーターExcelスプレッドシートを使用してください。ランダム文字を作成するには、スプレッドシートのセルB1にEFGHJKLMNPQRSTUを入力します（研究者は、肺の上に重なる文字で識別正方形の範囲をカバーするために、この文字の範囲を調整することができます）。次に、[数式を追加= MID（$ B $ 1,1 + INT（RAND（）* LEN（$ B $ 1）]ランダムにランダムな文字の列を生成するために、C2、C3、C4とceteraにC1。コピーに手紙＆ペーストC1を選択するためにC1をセルに。
   5. 隣接する列の乱数を作成するには、（5-25スライド上の組織の典型的な範囲である）、D1に数式= RANDBETWEEN（5,25）を入力します。必要に応じて、肺の上に重なる番号で識別さの正方形の範囲をカバーするために、この範囲を調整します。
   6. D2、D3、D4エトセトラにコピー＆ペーストD1は次のことを含むランダム文字までの乱数列を生成する。このように、各行は、フィールドファインダー内の四角のラベルに対応するランダムに生成された文字と数字のペアが含まれ（ 例えば 、E17、H24を...。）。
   7. 顕微鏡のスライドを置きます。 4Xの顕微鏡の対物レンズを使用すると、フィールドファインダースライドで対応する四角形を見つける（ 例えば 、E17、H24 ...）と顕微鏡の視野の中心にこの広場を配置。
   8. 微視的の中心を合わせます選択された正方形の中心で「+」を持つフィールド。フィールドファインダーを削除20X顕微鏡対物レンズを使用して肺に集中し、グレースケールTIFファイルとして画像を取得する。肺組織のカバー<顕微鏡視野の50％場合は、次のランダムに生成された四角形を選択します。 〜20-30画像は各動物のためにキャプチャされるまで繰り返します。ファイルを認識するためのExcelのレポートマクロのために、動物のタグ番号で標識された単一のフォルダに各動物のためのすべての画像を保存します。

4.形態計測は肺気腫を測定するには

プロトコルは、空域の拡大を分析するサイオンイメージおよびカスタマイズされたマクロを使用しています。サイオンイメージはMacintoshオペレーティングシステムの下で実行され、元のNIH画像アプリケーションのWindows互換バージョンです。サイオンイメージは、Windows XPで動作し、「サイオンイメージ」の検索がへのリンクをユーザに指示しますWikiversity.org、経由まだオンラインで入手できますサイオンイメージの手動およびベータ4.0.2リリース。インストールとソフトウェアの動作は、オンラインサプリメント取扱説明書に記載し、以下に要約される。歯槽弦長マクロはNIH画像で利用可能なマクロから適応されました。

1. サイオンの画像解析のためのギルの染色肺切片のTIFF画像を準備します。
   1. サイオンイメージを起動し、オンラインのサプリメントに示すようにマクロをロードします。選択し、画像のTIFFファイルを開くには、 オープン明イメージ[1]マクロを選択します。次に、分析のためのイメージを準備するために画像編集ツールを使用します。
   2. 空域または組織のいずれかとして処理されるべき空域または肺胞の壁でないイメージの領域を強制的にペイントブラシツールを使用します。彼らは組織のように分析されるように、例えば、黒色気管支と血管を描く。彼らは空域のように分析していることに肺胞白のスペースを占有している炎症細胞（または粉塵）をペイント。
   3. 上のマウスポインタをクリックしてペイントブラシの色を選択しますLUTウィンドウの下部にある言葉ブラックまたはホワイト 。次に、ブラシツールをクリックします。ブラシツールのブラシのサイズ、ダブルクリックを変更し、適切なブラシのサイズを入力します。クリックして、構造物を選択した色を（上記の＃1を参照）ペイントする画像の上にマウスをドラッグします。
2. 空域の平均​​翼弦長を測定
   1. [2]空域弦の長さを測定するために、マクロ弦長空気を選択します。
   2. 画像の中央付近でマウスをクリックする最初によるしきい値の画像は、その後、閾値（情報ウィンドウに表示され、0から255までの数字を、）を調整するためにマウスを上下にドラッグします。しきい値を受け入れるために、マウスをもう一度クリックします。元の画像のように、肺胞壁同じ厚さを作るために、しきい値を調整します。
      注：これは、研究者がしきい値の下で、それによって生成され、元の画像には存在しない肺胞の壁に改行を作成しないことが重要です人為的に高い翼弦長の値。
   3. プログラムは自動的にシングルピクセル（8白画素に囲まれた単一の黒画素）を削除します。
   4. em>の4.2.4。 、ユーザーに再しきい値バイナリイメージを促すウィンドウを守ってマクロを継続する、またはマクロをキャンセルする。再びしきい値するには、プロンプトにyと応答して、[OK]ボタンを選択します。
   5. em>の4.2.5。 5ピクセル離れマクロによって作成されたラインと水平および垂直グリッドウィンドウを可視化。プログラムは、空域に重なる水平線と垂直線の長さを測定する。
   6. 任意のフォルダにファイルを保存し、それ以外はExcelのレポートマクロは形式が空域弦長は「CLa.txt」が付加された画像の名前です（ファイルを見つけることができませんデフォルト名を変更しないでください。
      注：プログラムは測定を行わなかった場合、閾値が低すぎることがあり（でなければならない> 1）。これは、より高い値を使用して、研究者の再しきい値画像を発生する場合。
   7. 全角> 4.2.7。肺胞面積の測定のために（加えて、長弦に）、追加を実行し[4]、[5]のマクロならびに。
   8. em>の4.2.8。すべての画像が分析されるまで続けます。
3. Excelのレポートのマクロを使用して結果を分析する
   1. 開いているExcelレポート20x.xls。必要に応じて手動で使用されているExcelバージョンでのデフォルトのセキュリティ設定に応じてマクロを有効に。
   2. マクロのウィンドウ内のマクロのリストを観察した（表1を参照のこと）。
      注：CL_Air_1は単一の動物（フォルダ）のための空域の弦の長さをレポートします。 CL_Air_Multiは、複数の動物（フォルダ）のための空域の弦の長さをレポートします。 AP_No_Edge_1が単一の動物のためのエッジに接触することなく、肺胞の面積を報告します（フォルダ）.AP_No_Edge_Multiは、複数の動物（フォルダ）のためのエッジに接触することなく、肺胞の領域を報告します。 AP_With_Edge_1は単一の動物（フォルダ）のためのエッジの連絡先と肺胞の領域を報告します。 AP_With_Edge_Multiエッジcで肺胞の領域を報告複数のフォルダのためのontacts。
   3. 複数のマウスからの画像に対応する複数のフォルダのための歯槽弦長の測定値を報告するCL_Air_Multiマクロを選択してください。プログラムは、選択したフォルダ内_CLa.txtファイルをすべて報告します。現在のフォルダのサブフォルダに移動または_CLa部分の名前を変更することで（必要に応じて）_CLa.txtファイルを省略する。
   4. ファイルウィンドウから、[OK]を（プログラムは、一度に複数の選択をサポートしていません）を選択し、次にフォルダを強調す​​ることで一度に一つのフォルダを選択します。各フォルダが選択されると、ワークシート上でそれを観察する。 「キャンセル」または続行するためにファイルのウィンドウを閉じる]を選択します。
      注：Excelのバージョンによっては、研究者がそれぞれのフォルダが選択された後に戻って1フォルダレベルをナビゲートする必要があります。
   5. すべて_CLa.txtファイルから組み合わせた弦長データの統計に続く各_CLa.txtファイルの統計情報を示す、フォルダごとに別のワークシートを観察します。
   6. スプレッドシートの名前を変更し、保存します。デフォルトのファイル名は_CLa.xlsを付加した親フォルダの名前です。別のマクロを選択する前に、ワークシートを閉じます。

5.小気道リモデリング

1. 染色および画像取得
   1. 市販のキットを使用してマッソントリクローム染色で肺切片を染色し、製造元の指示に従ってください。
   2. 顕微鏡で20X対物レンズを用いて画像領域内（堆積されるECMタンパク質の層であり、気道外青色層を含む）を完全に収容することができる両肺内のすべての気道の画像を取り込む。
      注：より大きな気道は、CS曝露マウスにおけるECMタンパク質沈着の増加に関連付けられていません。
   3. JPEGファイルとしてカラー画像を保存します。
2. 画像解析：イメージファイルを開きます画像解析ソフトウェアプログラム。
   1. 開いて、測定結果を記録するログファイルに名前を付けます。
   2. ライン描画ツールを選択します。気道の大きさを測定するために、気道の内腔（内径）を横断する4線を引くだけでは、これらの気道が分析で所望のサイズを有するものが挙げられる。次に、青色染色領域のエッジに気道を当接外膜層の縁から延びる（クロック数に相当する、気道内の位置）の厚さを測定するために気道を12の等間隔の線を引く取り囲ま気道の外側に堆積ECMタンパク質の層（ 図5）。気道が他の気道または血管と相互作用の領域を測定することは避けてください。
   3. 最初のログファイル内の内径線の全てを記録し、その後、気道周囲の​​青ECM層の厚さを測定する12のラインを記録する。
   4. 次の画像を開き、画像を閉じます。
   <動物のためのすべての画像を1つのフォルダに記録されたまで、李は>これらの手順を繰り返します。
   5. 次の動物から肺切片に撮影した画像を含む次のフォルダのためのステップ5.2で始まる。実験動物のすべてから肺切片における気道のすべての分析を完了した後にプログラムを終了します。
   6. 4内径測定し、Excelスプレッドシートにデータ·ログ·ファイル内の各マウスについて、各気道のために記録12 ECMタンパク質層の厚さの測定値を入力する。各動物の直径​​およびECMタンパク質層の厚さの測定値を平均化する。
   7. ミクロンのピクセルからの測定値を変換します。
   8. グループその内径サイズに応じて、気道（ 例えば 、300〜399ミクロン、400〜499ミクロンなど）の煙曝露マウス対空冷用の類似のサイズを有する気道の周りと比較するECMタンパク質層の厚さの測定（ 例えば 、 300から899ミクロンの直径を有する気道。
   9. （間質コラーゲンおよび基底膜タンパク質を含む）の個々のタンパク質のために、免疫染色肺切片を必要とし、この方法を使用して、目的のタンパク質の付着を定量化するための同様の分析を実行する場合。

このプロトコルは、CSのために、マウスの全身暴露から始まる。 TPMのデバイスと監視の適切な監督やメンテナンスは、一貫性のある喫煙曝露（ 図1）を確保カウントします。研究者は、膨張装置を用いて、肺膨張手法を実践することをことが重要です

このプロトコルは、CSのために、マウスの全身暴露から始まる。 TPMのデバイスと監視の適切な監督やメンテナンスは、一貫性のある喫煙曝露（ 図1）を確保カウントします。注意深く肺膨張膨張装置を用いる技術（ 図2）とは、空域の拡大の正確な分析のために十分に膨張した肺切片を得るために、膨張後に肺を除去し、研究者の実践することが重要である。図3Bは不十分膨張した肺を示しているのに対し、図3Aはよく膨張した肺を示しています。図3Cは、閾値処理のために調製し、膨張肺切片の画像を示しているTEP（肺胞腔内マクロファージが白く塗られており、血管や気管支がgenerateに黒塗りされている。閾値化ステップは、肺胞腔内の全ての画素が白である、二値画像および肺胞ではない肺の領域内の全ての画素を作成（図3D）黒である。図3E及び3Fは、垂直方向と水平方向の歯槽和音はそれぞれ、マクロが生成することを長さを示している。

肺機能検査（6ヶ月間CSに曝露したC57BL / 6 WTマウスにおいて発症軽度肺気腫と一致する肺の弾性収縮力の適度な損失を反映してループの圧力容積（PV）の左側の適度な（統計的に有意ではない）シフトを示し図4A）。 PVループの有意な左シフトのみCSまたはCS曝露C57BL / 6 WTマウスよりもより重度の肺気腫の表現型を有するCS曝露遺伝子標的マウスにおける効果に非常に敏感であるマウス系統において観察される。

イチジクURE 5は、CS-暴露した動物における末梢気道の周りのECMタンパク質の沈着の増加を示した6ヶ月間の空気（ 図5A）またはCS（ 図5B）に暴露されたC57BL / 6 WTマウスのマッソンの三重染色した肺切片。 図の代表的な画像を示している図5Cは、画像解析ソフトウェアプログラムは、所望の内径を有する気道の周囲のECMタンパク質の沈着を定量化する方法を示す。 図5Dは、CS曝露C57BL / 6 WTマウスにおける300から899ミクロンの直径を有する気道周囲のECMタンパク質沈着の分析を示す。

図1.全身シガレット露光システムの漫画。煙曝露装置は煙曝露チャンバーに接続されている。煙は副流収集チャンバから引き出され、煙から引き出されるポンプによるタバコ、および両方の煙試料を混合し、希釈された外気と混合し、希釈室（左）で、その後煙曝露室に流入される。研究者は、露光室（右）におけるそれらのケージにマウスを置く。マウスをケージ内で自由に動くことができる、および煙曝露の持続時間の間、食物および水へのアクセスを持っている。

ネズミの肺の図2.インフレ。研究者は、滅菌PBSでフラスコを埋めるゴム栓でシールして、それを反転し、それをリングスタンドを用いて動物の心臓部上25cmの距離を確保。静脈寄付セットは、気管カニューレを介して肺にPBSを提供します。カットダウン血清学的ピペットをゴム栓を通して挿入され、これがluにドレインをPBSの体積を置き換えることをフラスコに空気を可能にする重力によるマウスのNGS。

図3.肺気腫分析。（A）は Gill's染色の代表画像は6ヶ月間、空気またはCSに曝露されたマウスからの肺切片を膨らま示し、黒い矢印は、血管や肺胞マクロファージを示している。 （B）は、分析のためには適していない下に膨張した肺の代表的な画像を示す。 （A）は、「前」、および（C）を示している研究者は、二値画像を生成するための準備を代表肺切片の「後」の画像を示している。 （A）及び（C）の黒矢印は血管のいずれかを示す（研究者の黒塗料（C））または肺胞マクロファージ（研究者は、白色塗料（C））。 （D）<研究者がしきい値ステップを実行した後に/ strong>のバイナリイメージを示しています。 （E）及び（F）は、水平および垂直肺胞コードは、それぞれの研究者によって生成される長さを示している。すべての画像の倍率は400ミクロンを表すxの200のスケールバーは、（A）に示されている。

図4肺胞弦長及び圧-容積曲線（A）は空気中に露出C57BL / 6 WTマウスにおける肺胞弦長の典型的な分析を示した（n = 13）またはCSた（n = 24）、6ヶ月。アスタリスクは、p <0.001を示している。 （B）は、6ヶ月間空気（N = 13）またはCS（N = 14）に暴露されたC57BL / 6 WTマウスで実行典型的なPVループを示しています。データは平均+ SEMとして表される。

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図5.小気道リモデリング（SAR）査定。 （A）及び（B）は、6ヶ月間空気（A）またはCS（B）に曝露したC57BL / 6 WTマウスからのマッソントリクローム染色した肺切片の代表的な画像を示す。 （C）は、画像解析ソフトウェアは、CS曝露マウスにおけるSARを解析する方法を示している。 （D）は、6のための空気にさらさC57BL / 6 WTマウスにおける300〜899メートルた（n = 11）またはCSた（n = 16）の直径を有する小気道周囲に堆積外マトリックスタンパク質層の厚さの典型的な測定値を示すヶ月。データは、平均値として表される+ SEMアスタリスクは、p <0.05を示す。

スケールバーは、各肺の部分の画像に表示されます。

開示すべき利益相反はありません。