このプロトコルの目標は、COPDのマウスモデルにおける慢性肺の病状を定量化する自動化された方法を提供することです。このプロトコルには、マウスをタバコの煙(CS)にさらすこと、肺機能の測定、肺を膨らませること、および形態測定法を使用してマウスの肺気腫と小さな気道リモデリングを測定することが含まれます。
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この記事について
サマリー
要約
COPDは、2020年までに世界で3番目に多い死亡原因になると予測されています（1）。 COPDの動物モデルは、疾患プロセスに寄与する分子を特定し、COPDの新規治療法の有効性をテストするために使用されます。 研究者は、げっ歯類、モルモット、ウサギ、犬など、さまざまな種を使用したCOPDの多くのモデルを使用しています(2)。 しかし、最も広く使用されているモデルは、マウスをタバコの煙にさらすモデルです。 マウスは、ゲノムを容易に操作して、個々のタンパク質を欠損または過剰発現する動物を作製できるため、COPDをモデル化するのに特に有用な種です。 タバコの煙に曝露された遺伝子標的マウスの研究は、COPDのさまざまな肺の病状に対する個々の分子の寄与に関する貴重な情報を提供してきました（3-5〉。ほとんどの研究は、COPDの特徴である気流閉塞に寄与する肺気腫の発症に関与する経路に焦点を当てています。 しかし、小さな気道線維症もヒトのCOPD患者の気流閉塞に大きく寄与しています(6)が、煙にさらされた動物におけるこの病変の病因についてはほとんど知られていません。この知識のギャップに対処するために、このプロトコルでは、煙にさらされたマウスの肺気腫の発症と小さな気道線維症の両方を定量化します。このプロトコルでは、全身曝露技術を使用してマウスをCSに曝露し、マウスの呼吸力学を測定し、マウスの肺を標準圧力まで膨らませ、肺をホルマリンで固定します。 次に、研究者は、肺切片をギル染色で染色して平均肺胞索長を測定するか(肺気腫の重症度の読み取りとして)、マッソンのトリクローム染色で小さな気道の周りの細胞外マトリックス(ECM)タンパク質の沈着を測定する(小さな気道線維症の読み取りとして)。これらの肺の病状の両方に対する分子経路の影響の研究は、COPDの病因の理解を深めることにつながります。
概要
ないモデルが完全ヒト疾患（2）のすべての機能を複製することができないので、COPDを研究するための動物モデルの使用は困難である。ほとんどの研究者は、それらの肺生理学、病理学、遺伝学、および代謝物のマウスとヒトの間の類似性のCOPDをモデル化するために、マウスを使用しています。また、マウスは勉強するのが比較的安価であり、肺気腫、小さな気道リモデリングの両方がCS曝露（5,7-9）の6カ月以内に発症する。
タバコの煙によって誘発されるCOPD：いくつかの方法が、マウスにおいてCOPDを誘発することができる。ほとんどの研究者は、人間のCOPDの主な病因因子であるCS、にマウスを公開。 6ヶ月のCS曝露は、マウスにおいて肺気腫および小さな気道リモデリング（SAR）の開発を引き起こすが、誘導される疾患の重症度を検討マウス株に依存して変化する。 AKR / Jマウスはextremelであるのに対し、例えば、NZWLacZマウスは、CS誘発性肺気腫の発症に耐性である感受性のy（10）。ほとんどの研究者は、多くの遺伝子標的マウスとしてのCS暴露モデルでC57BL / 6系統のマウスを研究この株でご利用いただけます。 CS暴露の6ヵ月後、肺気腫、小気道線維症は、野生型（WT）C57BL / 6マウスで開発し、両方の病変が重症度（5,10）で比較的穏やかです。鼻専用および全....
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プロトコル
プロトコルが完了するまでに25週間〜かかります。プロトコルは、24週間の空気や煙にマウスを暴露した。煙曝露の最後に、プロトコル対策肺マウスにおける機能、および肺を、一定の圧力まで膨張固定し、同じ日に除去される。追加の時間は、カットを埋め込み、かつ肺切片（2~3日）を染色し、（研究した動物の数に応じて2~4日）の画像をキャプチャし、分析する研究者のために必要とされる。このプロトコルは、マウスにおいて、年齢に関連した気腔の拡大を測定するために使用することができる。
このプロトコルで説明されているすべての手順は、ブリガムでの施設内動物管理使用委員会とウィメンズ病院/ハーバード大学医学部によって承認されている。
1.全身タバコ煙曝露
- ヒュームフード内に設置します（ 図1を参照）、全身煙露光装置で煙にマウスを公開します。
注：デバイスが自動的に車輪の研究タバコをロードし、Lタバコをights、および副流煙収集チャンバ内の副流煙を収集し、煙草を吐出する。マシンが主流と側流煙の混合物を作成するためにポンプによってタバコから抽出された主流煙と副流煙を兼ね備えています。混合および希釈チャンバー内のファンが外気と煙を混合し、露光室に煙を駆動します。 - 露光チャンバ内（ 図1）を除去し、ケージの蓋なしでマウスを含む置きケージ。マウスは、それらのケージの中を自由に移動できるようにすると煙の曝露（〜1.75時間）の....
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結果
このプロトコルは、CSのために、マウスの全身暴露から始まる。 TPMのデバイスと監視の適切な監督やメンテナンスは、一貫性のある喫煙曝露（ 図1）を確保カウントします。研究者は、膨張装置を用いて、肺膨張手法を実践することをことが重要です
このプロトコルは、CSのために、マウスの全身暴露から始まる。 TPMのデバイスと監視の適切な監督やメンテナンスは、一貫性のある喫煙曝露（ 図1）を確保カウントします。注意深く肺膨張膨張装置を用いる技術（ 図2）とは、空域の拡大の正確な分析のために十分に膨張した肺切片を得るために、膨張後に肺を除去し、研究者の実践することが重要である。図3Bは不十分膨張した肺を示しているのに対し、図3Aはよく膨張した肺を示しています。図3Cは、閾値処理のために調製し、膨張肺切片の画像を示しているTEP（肺胞腔内マクロファージが白く塗られており、血管や気管支がgenerateに黒塗りされている。閾値化ステップは、肺胞腔内の全ての画素が白である、二値画像および肺胞ではない肺の.......
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ディスカッション
ほとんどの研究者は、マウスを使用して、ヒトの病気に存在するCOPDにおける主要な慢性肺病状と異常な肺生理学(空域拡大、SAR、および肺コンプライアンスの増加)をモデル化しています。 これらの慢性疾患プロセスにおける目的の分子の活性を包括的に評価するには、肺気腫の発生とSARの両方に対する目的の分子の影響を評価するための包括的なアプローチがマウスで必要です。
このプロトコルには、いくつかの重要なステップがあります。まず、タバコの煙にさらされている間は、タール生成物がデバイス内に堆積し、肺疾患を誘発するのに十分ではないCS曝露を引き起こす可能性があるため、少なくとも週に一度は機械を清掃することが不可欠です。第二に、空域の拡大を正確に測定するには、肺をよく膨らませることが不可欠です。 胸部からの除去中に肺に傷がつくと、肺葉が収縮し、空域のサイズが過小評価されます。 したがって、肺を保護するために、はさみの先端が見える場合にのみ組織を切断します。第三に、肺気腫発生を正確に分析するために、肺セクションの肺胞壁をギル染色で暗く染色し、画像取得の露光時間を最適化して、画像の理想的な閾値を確保し.......
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開示事項
開示すべき利益相反はありません。
謝辞
私たちは、フランチェスカPolverino MD、この記事への彼女の貢献のためのブリガム·アンド·ウィメンズ病院での研究員、そしてまたモニカ八尾、BS、およびケイト·ライデル、ネズミ畜産とタバコの煙にマウスを曝露との援助のためにBSに感謝したい。
この作品は、公衆衛生局、国立心臓、肺、血液研究所補助金HL111835、HL105339、HL114501、客室乗務員医学研究所助成＃CIA123046、ブリガム·アンド·ウィメンズ病院·ラブレース呼吸器研究所コンソーシアム、ケンブリッジNIHR医学によってサポートされていました研究センター。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 全身煙曝露装置 | ティーグエンタープライズ | TE-10z | マウスの慢性肺疾患を誘発する慢性煙曝露 |
| 研究タバコ | ケンタッキー大学 | 3R4F 参照タバコ | |
| Pallflex®エアモニタリングフィルター、Emfabフィルター TX40HI20WW、25mm | ポールコーポレーション | 7219 | TPMの測定用 |
| 25mmフィルターホルダー | ポールコーポレーション | ||
| フィルターサンプラー | インターマティック | メタルT100 | |
| ガスメーター | AEM | ガスメーター G1.6;G2.5;G4 | |
| 用気管カニューレ 18ゲージ | Labinvention | 肺機能の解析 | |
| 機械式人工呼吸器 | Scireq | FlexiVent | |
| ギルのヘマトキシリン溶液 | Sigma-Aldrich | GSH316 | 鰓染色用、ヒュームフード下での作業 |
| ヘマトキシリン溶液、ハリス修飾 | Sigma-Aldrich | HHS16 | |
| Cytoseal-60 | Thermo Scientific | 8310-16 | |
| Micro-Slide-Field-Finder | Andwin Scientific INC | 50-949-582 | 肺気腫の解析用 |
| サイオンイメージプログラム | オン株式会社 | ||
| メイソンのトリクローム染色 | Sigma-Aldrich | HT15 | 小さな気道線維症の分析用 |
| MetaMorp オフライン バージョン 7.0 | Molecullar Devices LLC | 31032 |
参考文献
- Murray, C. J., Lopez, A. D. Measuring the global burden of disease. N. Engl. J Med. 369, 448-457 (2013).
- Wright, J. L., Cosio, M., Churg, A. Animal models of chronic obstructive pulmonary disease. Am. J Physiol Lung Cell Mol. Physiol. 295, 1-15 (2008).
- Hautama....
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再版と許可
