高分子の3次元再構成のための試料調製のプライマーおよび高品質データ収集：クライオ電子顕微鏡ののいいことといけないことをやる

サマリー

この論文は、高分子のほぼネイティブな状態の高品質な顕微鏡画像を取得するために使用されるクライオ電子顕微鏡法について説明しています。この方法は、高分子の3D再構成を生成するために考案された単一粒子アプローチを使用したさらなるコンピュータ化された処理に適した画像を生成します。

要約

クライオ電子顕微鏡法(クライオ電子顕微鏡)は、支持体上の試料の薄層を瞬間凍結し、その後、透過型電子顕微鏡(TEM)によって凍結した状態のサンプルを視覚化します。これは、非常に少量のタンパク質で、選択したバッファー内で、染色を使用せずに達成できるため、高分子の構造と機能の相関関係を決定するのに非常に役立ちます。この手法は、単粒子画像処理と組み合わせることで、精製された高分子の3D構造決定に広く有用であることがわかっています。

ここで提示されているプロトコルは、クライオEMの実行方法を説明し、最も一般的に遭遇する問題の原因を合理的なトラブルシューティングのために調べます。これらすべてのステップに従うことで、高品質のクライオEM画像を取得することができるはずです。この技術には、電子顕微鏡装置とガラス固化装置へのアクセスが必要です。コンピュータ化された画像処理には、3D再構成の概念とソフトウェアに関する知識も必要です。重要なことは、高品質の結果は、構造的に無傷の高分子の均一な集団につながる適切な精製条件を見つけることにかかっているということです。 >jove_content<高分子を可視化するクライオ電子顕微鏡の能力と、単一粒子画像処理の汎用性の組み合わせは、大きなタンパク質や高分子機械のほぼネイティブな状態での構造決定、3D差分マッピングによるそれらの複数の成分の同定、X線構造のドッキングによる擬似原子構造の作成に非常に成功していることが証明されています。過去30年間にわたるクライオ電子顕微鏡装置と画像処理技術の絶え間ない開発により、原子分解能レベルでde novo 3D再構成を生成する可能性が生まれました。

概要

cryoEMの目標は、それらの天然の水和状態で巨大分子の電子顕微鏡像を得ることである。ガラス化した水に高分子の埋め込みによって、凍結、水和サンプルを直接TEM装置に導入し、可視化することができる。ガラス化は、凍結フラッシュ（10,000 ^Oの C /秒）によって達成、水の結晶化せずにサンプルを凍結し、凍結中の分子の再配列が重要であることを保証する。周囲のバッファについてのサンプルの電子散乱の過剰は、あらゆる汚れ¹が存在しない場合に巨大分子を参照するには小さいながらも十分なコントラストを提供しています。コンピュータ化された画像処理は、その後、巨大分子の3次元構造を再作成するために使用することができる。 〜500 kDa-マルチMDA範囲の大きな高分子は、（電子顕微鏡データバンク（EMDB）エントリの80％以上に相当）cryoEMのための理想的なサンプルです。これらは、タンパク質、タンパク質複合体、タンパク質 - 核酸cを含むomplexes、および膜タンパク質は、脂質二重層に埋め込まれた。これらの高分子は、（PDBデータベースに2％未満のエントリで）結晶化しにくく、まだそれは、X線結晶学またはNMRによって解決小片がcryoEMによって作成された3Dエンベロープにドッキングすることができ、多くの場合そうである。一方、cryoEMによって解決最大の構造の一部が薄切片のTEM ²によって完全な細胞内で識別可能である。したがって、cryoEMが効果的に細胞内と原子構造間のサイズと解像度のギャップを埋める。

CryoEMは汚れ除外の領域が強く対比「負」の画像^3を作成し、それによって巨大分子が脱水重金属汚れの層に囲まれてネガティブ染色のより古典的な方法（NS）、より優れた高分子の天然の構造を反映している。両方の場合において、電子ビームは、ここで、sは、粒子と呼ばれる、巨大分子の2次元投影画像を生成するHAPEは、電子ビームに対する巨大分子の配向に依存する。多くの粒子が、少なくとも〜1,000のない上限は、信号対雑音比（SNR）の平均も、信号を増加させるために、粒子の空間的配向パラメータを見つけるために「単粒子解析」（SPA）はソフトウェアをコンピュータ上で解析することができる逆投影^4-7による巨大分子の3次元構造を再作成する必要がありました。 NSは、高いSNRで、予備試料の特徴付けのために使用され、 新規の三次元再構成を生成する。その解像度はめったに重金属粒の脱水とサイズによって課されている20オングストローム、超えない。一般に、cryoEM次元構造決定のために、低解像度の3D再構成は、最初NSから取得され、次いでcryoEMはさらに、その内部構造を見るために、その天然の水和状態で巨大分子を研究するために、この低解像度の最初のマップを改善するために使用されその解像度を向上させる。ノーTEそのNSモデルが歪んでいた（最も一般的な例は、脱水⁸起因する平坦化されている）とcryoEM粒子が低いSNR、その後歪みが低SNRで一般的なcryoEMモデル（モデルバイアスアーティファクト、に運ぶことができるがあった場合データセット^9）。構造的なゆがみはNSとcryoEM原料粒子間及び生cryoEM粒子および平坦化方向に直交する3次元モデルの対応する突起間の不一致をもたらす。 3Dモデルは、連続した洗練サイクルを受けるなどのモデルバイアスはそれ自体で解決することがあります。その3Dモデルからの生cryoEM粒子と対応する突起間の対応関係の欠如が検出されるであろう、発生してはならないし、デノボモデルはcryoEMデータから構成されるべきである。良い方法は、可能な限り最高のcryoEMモデルを選択するいくつかの可能な3Dボリュームを生じ得る角度再構成アルゴリズム^10を使用し、NS 3Dモデルを使用することができそれは、さらに洗練された¹¹になります。より良い戦略は、（議論の専用セクションを参照してください）​​cryoEMデータセットのSNRを高めることである。

精製された巨大分子の生化学的品質は、最終的な結果で最大限の影響力を持っています。巨大分子、組織から精製されるか、または異種系において発現は、高純度を有し、構造的に無傷であることが必要である。これは、凝集体を形成するべきではないどちらもそれが分解しなければならない。特定のコンホメーションを定義するには、調製条件は、均一な立体配座状態を促進すべきである。複合体を研究するために、それはそうでなければ固定剤が正常より低い親和性相互作用^12,13を安定化するために使用されており、それらのk _Dは、nM範囲にあることが最適である。

未処理cryoEM画像は、寸法上の貴重な情報、概要、アグリゲーション/多量、均質性の状態、およびmacromolecuの内部構造をもたらすル。それにもかかわらず、技術の可能性を大幅に画像処理によって強化される。 3D構造は、巨大分子の全体的なアーキテクチャ、リガンド及びサブユニットの3D位置、立体構造変化を明らかにし、X線結晶学またはNMRによって決定原子構造のドッキングを可能にします。解像度が増加すると、3D再構成の情報量が段階的に増加させる。一般的に15〜20Åの分解能は原子構造の明確な結合を可能にする、9-10オングストロームのαヘリックスで5Åでそれを識別することが可能である、棒として表示されているβシート、及び3.5オングストロームより良いの解像度で、原子モデル^14を構築することが可能である。

少なくとも0.05ミリグラム/ mlの3-5μlの一つTEMグリッドを調製するのに十分であるように、サンプルの比較的少量のSPAを使用して有益な画像と3次元再構成を得るための可能性は、cryoEM魅力的な手法にする。最低限のインストゥルメンタル要件cryoEMために自家製又は市販冷凍プランジャ、そのポンプステーション、グロー放電装置、及び蒸発器を有する超高真空、画像記録媒体及び低用量キット、クライオホルダー電子顕微鏡である。 TEMでの非必須しかしさらなる望ましい特徴（すべての近代のTEM内に存在する）は、CCDカメラまたは直接電子検出器、電界放射電子銃（FEG）、エネルギーフィルタリング、および高スループットのデータ収集ソフトウェアである。原則として、このソフトウェアは、しかし、増加したデータストレージの必要性及びそれに続く教師後処理時間が必要で考慮しなければ、単一cryoEMセッション¹⁵万の粒子の数千の収集を可能にする。コントラスト伝達関数（CTF）の補正と組み合わせFEGはαヘリックスを視覚化するのに十分な解像度に達したほとんどの3D再構成の基礎となる。その時点で、解像度のレベルはまた、サンプルに依存する：10Åの分解能に達すること、膜タンパク質のためのあまり一般的であるかのに対し、対称性の高い順序は、原子分解能がより実現可能である存在です。直接電子検出器の最近の開発は、低（4×）またはcryoEM電子密度マップの品質は、これらのX線回折データ^16,17から導出一致しない対称性を有する巨大分子のための原子分解能を可能にした。

技術の機能を説明するための具体例としてはcryoEMが彼らの構造決定の継続チーフ役割を持っている巨大分子の4つの重要なタイプのためにここに提供されている。 60倍と忠実なと再現可能なアライメントを可能にする、その大きなサイズによって、データセットが増加し、その二十面体の対称性を有する（i）は、いくつかの正二十面体ウイルスの構造はSPA ¹⁸に続くcryoEM近く-原子分解能に解決されています。私たちは、cryoEMによる及びcryoEM / X線HYによるため、近接原子構造正二十面体ウイルス、アデノ随伴ウイルス（のAAV）、のクラスの例を示しているBRIDの方法は^19,20存在する。 （II）らせん構造を持つ高分子は、微小管、フィラメントおよびウイルスが挙げられる。螺旋軸に沿ったそれらの繰り返し単位は、螺旋幾何²¹に適合SPAのより複雑なバージョンによって分析することができる。例では、タバコモザイクウイルス（TMV）、cryoEM ²²により原子レベルの分解能に解決されたRNAウイルスを示す。 （iii）の大型の可溶性タンパク質が十分に研究されている。これらのうち、対称的な多量のシリンダを形成する巨大分子は、しばしば、サブナノメートルの分解能^23,24で解か定期的なアーキテクチャを構成している。ここでは、KLH、ハイブリッド分子モデルがcryoEM / X線結晶学のハイブリッド法²⁵から作成された無脊椎動物酸素運搬体の画像を示す。 （iv）の膜タンパク質は、タンパク質の重要なクラスである。これらは、ヒトゲノムによってコードされるタンパク質の約1/3を構成する、まだそれらは、trを伴う複雑に構造的に特徴付けることが困難である合わせた任意の構造技術によって解析された構造の1.5％未満を構成するansmembraneドメインの安定化^26、。それらの構造決定におけるcryoEMと3D再構成の役割は、リアノジン受容体（RyRの）、筋収縮および脳シグナル伝達において重要な大きな真核細胞内Ca ²⁺チャネルを用いて例示されている。現在までの最高解像度cryoEM構造は、10Åの分解能で、二次構造^27を明らかにする。

プロトコル

1.クライオホルダーの準備およびメンテナンス

注：ドライポンプステーション、ターボポンプステーションと1つ以上のコールドステージコントローラからなるが、主に3つの目的のために使用した：a）それは、それらが使用されていないときにクライオホルダを格納するための安全な場所である。所有者を格納するための正しい方法は、真空下駅でそれらを残すことである。 b）は、液体窒素デュワーから取り出し、クライオホルダの先端が露出したときに発生する霜や湿気の蓄積を蒸発すること。これは、ウォームアップサイクルで達成される。 C）ゼオライト乾燥剤を再生するために、とcryoholderデュアーで高真空を達成すること。これは、低温電子顕微鏡法を行う際に、一定の温度を保持する必要がある。

1. ウォームアップサイクル。
   1. ポンプ場のポンプポートのいずれかにクライオホルダーを挿入します。ホルダーの真空バルブの下に金属コンセントに避難管の1をフック。作る駅（V1、V2、およびV3）上及びクライオホルダー上のすべてのバルブが閉じていることを確認してください。
   2. コー​​ルドステージコントローラをオンにして、制御コードを介してホルダーに接続します。ターボポンプ場の電源スイッチをオンにします。
   3. コー​​ルドステージコントローラ内のウォームアップサイクル·オプションを起動します。ターボポンプ場における真空は10 ^-3トルまたはより良いを読み取ると、バタフライバルブV2を開き、真空が安定するまで待ってから、バタフライ弁V1を開きます。
   4. ホルダー内の温度が20℃以上で安定するまで約30分間ウォームアップサイクルを実行します。 [閉じるV1、およびサイクルを停止します。
2. ゼオライトサイクル。 4時間とO / N CryoEMセッションの前に、そして週に一度使用しない場合においてゼオライトサイクルを実行します。
   1. ゼオライトサイクルオプションを起動し、1〜2×10 ^-4トルの範囲で、良好な真空を達成するために必要な時間を選択し、したがって、長いホールド時間。真空10 ^-3に^達するとトールは、デュワー排気バルブ、V3を開きます。ポンプステーションは、その後ホルダーに行を避難されます。真空が安定するまで待ちます。
   2. クライオホルダーのバルブを開きます。ホルダーのバルブは、V3、V2、および最終的にV1：サイクルが完了すると、それらがオープンされた逆の順序で弁を閉じる。ターボポンプ場とコールドステージコントローラの電源を切り、コールドステージコントローラとターボポンプ場からクライオホルダーを外してください。

2.グリッドの準備

1. クリーニング。
   注：商業ホーリーグリッドを使用する際には、製造工程で使用された残留ポリマーを除去するために、使用前にそれらをきれいにすることが推奨される。一番下に敷設ろ紙の5層のガラスシャーレにこれを行います。
   1. ホーリー炭素側を上にして濾紙上にグリッドを配置します。
   2. ガラスパスツールピペットを用いて、数滴Oで紙を濡らすグリッドの周りにFクロロホルム、彼らは単に浮動開始するまで。
   3. ヒュームフードO / Nでわずかに開いた蓋をペトリ皿をカバーしています。
2. NOTE：氷層に直接穴あきカーボングリッド内の小孔を横切って形成することができるように薄いカーボン担体（2.2〜2.3ステップ）を省略することができる。
   1. ピンセットを使用して、2つの新たな表面を露出するために雲母の一部を切断する。ペトリ皿に白い紙に雲母フェイスアップの新たな露出面を配置します。
   2. カーボン蒸発器のベルジャーでペトリ皿を置きます。真空は、2×10 ^-6トル未満になるまでのシーケンスをポンプダウンし始める。炭素棒の表面上の不純物を揮発させ、被覆されたペトリ皿で​​予備蒸発を行う。その後ベルジャーを放送し、ペトリ皿からカバーを取り外します。
   3. 真空はカーボンの薄層（〜5 nm）を持つマイカは10 ^-6トルとコートを下回るまでポンプダウンシーケンスを実行します。炭素中に眼の保護を使用して、蒸発。マイカシートの下に置かれていた紙に生じた闇に炭素膜の厚さを監視します。
3. TEMグリッドに炭素薄膜を転送します。
   1. 被覆された雲母の0.5×1cmの部分をカットし、ろ過し、脱イオン水の平らな表面上に炭素から浮上。平らな水面を取得するために、光学レンズペーパーを使用してください。ピンセットを使用して、浮遊炭素層の上面に接して、グリッドの穴あきカーボン側を入れて、それを拾う。
   2. グリッドの十分な数が用意されるまで、ステップ2.3.1と2.3.2を繰り返します。
4. グロー放電。
   NOTE：グロー放電は、親水性にグリッドの天然に疎水性炭素被覆層に変換する。この手順はオプションです。
   1. 炭素側はパラフィルムで覆われた7.5×2.5センチのガラススライド上に上向きにグリッドを配置します。グロー放電装置のチャンバにそれを置き、チャンバーを閉じます。
   2. ポンプ25ミリアンペアで20秒、7×10 ^-2ミリバールのためのベルジャーとグロー放電。
      注：この時間の間に光紫色の輝きが見えるようになる。グリッドとのスライドガラスを削除し、1時間以内にそれらを使用し、そうでなければ、彼らは再び放電グローする必要があります。

3.サンプルプランジ凍結

注：液体窒素とエタン飛沫から保護するために、この機器を使用する際、安全メガネと適切な靴を使用してください。

1. プランジ​​凍結装置の電源をオンにします。蒸留水で加湿器リザーバーを記入してください。所望の温度に設定された相対湿度及びブロット時間の条件を急落、ブロット力と吸着時間（22°C、95％、2秒、ここに示した例における2及び40秒）。新しいブロッティング濾紙を置きます。
2. 安定性（約10分）達成されるまで液体窒素で外側容器を充填することによってエタン容器を冷却する。液体窒素はboilin停止するとGは、内側チャンバー内エタンタンクからのチューブの先端を配置し、非常にゆっくりとバルブを開きます。内室にエタンを液化して、上から1ミリメートルにそれを埋める。エタンを凍結しないでください。注意：エタンが極めて引火性と爆発性のある。
3. ピンセットは、装置の凍結プランジ内に整列していることを確認します。
4. 湿度の電源をオンにします。ピンセット上にグリッドをロードし、ホーリーグリッドの炭素表面（鈍い側）にサンプルの3-5μlのをロードします。薄い液体層を達成するためにグリッドに吸着し、ブロッティングを行うために、サンプルを待ちます。
5. 液体エタンにそれを沈めることで、グリッドをフラッシュ凍結。着実にピンセットを保持する液体エタンからピンセット·グリッドアセンブリを取り外し、液体窒素で外室に移す。液体窒素中に浸漬し、小さなグリッドボックスにグリッドを転送します。貯蔵タンクのいずれかへの転送中に液体窒素中ですべての時間をガラス化したサンプルを維持することを確認してくださいまたはクライオホルダーに。
   注：グリッドボックスは、少なくとも1年間の大容量（35〜50 L）、液体窒素デュワー内に格納することができる。収納に便利な、彼らは2と50ミリリットルファルコンチューブに配置することができます上部とデュワーの口から引き出すことができる、そのキャップに添付釣り糸で穴を掘削。

4. TEMにクライオグリッドを転送

1. クライオ転送ワークステーションにクライオホルダーを挿入します。挿入中にホルダーの先端を傷つけないように注意してください。任意の光学レンズペーパーでそれを削除がある場合は、ルーペを使ってロッドとクライオホルダーのOリング上の小さな繊維や粉塵の存在を確認してください。
2. クライオホルダーのデュワー、液体窒素で、ワークステーションの容器を埋める。ワークステーションが付属して閉じ込められたロートを用いて液体窒素をこぼさないようにしてください。
3. 温度を監視するためのコールドステージコントローラにクライオホルダーを接続し、液体窒素＆＃を追加し続ける160、温度が約-194℃で安定するまで。液体窒素のレベルがワークステーション容器とクライオホルダーデュワー内の両方の真空シールのレベルの下にあることを確認します。グリッドピンセット、クリップリングとワークステーション上のクリップリングツールの平滑末端を事前に冷却する。また、大規模なピンセットのセットと、液体窒素で満たされた別のデュワーでドライバーを事前に冷却する。
4. すぐに大規模なピンセットを使用してワークステーションでの液体窒素に凍結し、水和グリッドを含む低温グリッドボックスを転送する。ドライバーで低温グリッドボックスを開き、凍結された水和したグリッドを取り、試料ホルダースロットに配置します。
5. グリッドの上にクリップリングを置き、静かにそれがしっかりと所定の位置に固定されるまでクリップリングツールの平滑末端でそれを押してください。クライオシャッターを閉じます。ワークステーションからツールや低温グリッドボックスを外します。
6. ミニするために、顕微鏡コンソールにホルダーとグリッド全体のワークステーションを移動室内空気中のグリッドの転送時間をマイズ。
7. 以前に充填され、少なくとも20分間冷却された液体窒素、とTEM抗contaminator締めくくり。 -60℃に顕微鏡ステージをプレチルト。
   注：ホルダは、エアロックの中に挿入されるように、これは、液体窒素の損失を最小にする。
8. 顕微鏡の事前ポンプエアロック·サイクルを開始します。電子銃にバルブが閉じていることを確認します（それはFEG TEMである場合は特に）。ポンプ前エアロックシーケンスはクライオホルダーを挿入する前に（約2分）を終了するのを待ちます。
   注：これは消滅しているステージ上の赤い光で示されます。
9. エアロックにホルダーを挿入し、90°時計回りに回転させる。温度を監視するためにクライオホルダーにコールドステージコントローラコードを接続します。赤色光が消えるまで、再び待機し、TEMのハイテクにホルダーを挿入するために戻って0°位置にステージとホルダーの両方を回転させるGH真空コラム。
10. 温度が決して、結晶氷の形成を回避するために-160℃以上になっていないことを確認してください。
11. クライオホルダーのデュワーを補充。ホルダーが熱平衡化し、TEMの真空が画像を記録する前に回復するまで45分 - 15を待ちます。
12. 液体窒素のバブリングが検出された場合には、液体窒素の充填高さを変更し、または穏やかに綿棒でバブリング原点に触れる。

5.低線量データの収集

注：低用量のデータ収集技術は^/Å2 20電子への曝露を制限することにより、試料に電子線損傷を最小限に抑えるために使用される。これは、3つの構成の間で交互にすることにより達成される：高倍率（〜150,000X）と小さい視野、および「露光」で、低倍率（〜5,000倍）、ビュー、「フォーカス」の幅広い分野で、「検索」、所望の最終マグニ付きfication及び関心領域を含むが記録される。モード間でのビームブランク。

1. TEMおよび低用量プログラムを設定
   1. クライオシャッターを撤回し、カラムバルブを開きます。
   2. 舞台を中心に、15°±段階を揺するためにアルファワブラーを使用してユーセントリックの高さ（Z）を設定します。ステージが揺れている間に目立った動きがなくなるまでのZ位置を調整します。低用量のプログラムをアクティブにして、各モードの検出器を選択します。
   3. 露出モードでは、炭素を有さないグリッドの領域を見つける記録する領域が完全に照明されるように、最適なコンデンサ絞りとスポットサイズを選択することによって、照明を調整します。 overcondensation方向にビームを広げるようにしてください。
   4. 検索モードでは、より高い倍率で容易に識別されます小さな機能を見つける。露光モードでは、ジョイスティック（のxyステージコントローラ）でこの機能をセンタリング。偉業あれば低倍率で起動しますUREは視野にありません。
   5. 検索モードでは、低用量のxy画像シフトコントロールを使用して、フィールドの中央には、この機能をもたらす。 （ - 3ミクロン0.5）露出モードに移動し、それが記録されるエリア外になるまで、ジョイスティックを使用して傾斜軸に沿って機能を移動します。モードを集中し、XY画像シフトコントロールを使用して機能を中央に移動します。特徴は視野にない場合に低倍率で起動します。
   6. 常に中心としたビームにしてください。
2. データ収集
   1. クライオシャッターを撤回し、カラムバルブを開きます。低用量プログラムを起動します。
   2. 検索モードでは、薄い、均質な氷を含むグリッドの正方形を識別する。
   3. 適切な穴を選択し、フィールドの中央に配置します。モードを集中し、画像の焦点に切り替えます。 4.5ミクロン - 0.5間の画像アンダーフォーカス。
   4. 露出モードに切り替えて、画像を記録する。
   5. 5.2.3-5.2.4モードを検索し、手順を繰り返して切り替えます。記録する前露光良い穴を避け、グリッドの正方形を横切って移動する。
   6. グリッドの正方形を終了し、別の良い1に移動する。
   7. 高さ（Z）を再調整し、データ収集を継続する。

結果

図1に概説すべてのプロトコルステップを慎重に実行が凍結し、水和、非染色高分子の可視化を可能にします。異なる構造的特徴を持つ4つの代表的試験片の結果を示す。 NSとcryoEMの方法により得られる、それらの顕微鏡画像（ 図2）と比較される。 AAV5の（i）のNS画像は約130Åの直径のウイルス様粒子を明らかにする。フルと空の構造の共存はそれぞれ、（ステインエントリが許可されていることを）破壊し、構造的に無傷でキャプシドに相当する。 CryoEMを均一空の構造を示す。確かにこれらのウイルス粒子は遺伝物質^28が含まれていません。 cryoEMが自分の正二十面体の形を反映して、主に六角形の粒子を示すのに対し、NSが優勢な丸い粒子を示す。 （II）の両方が見える23Åの螺旋の繰り返しで、多くの場合、長い0.1ミクロンより180オングストロームの直径と可変長の螺旋TMVショーの棒の画像を、NS中​​とcryoEMで。 40Å中央チャネルは、NS画像内の汚れとcryoEM画像内の空で満たされている。 （III）ネイティブKLH、8 MDAのdidecamerは、350オングストロームの直径と400オングストロームの長さの特性樽で組み立てる。 NSとcryoEMはKLHの長方形の側面図と円形のエンド意見を明らかにした。両方の技術は、6つの対称軸に垂直な条線と各階層内の等間隔の形態学的単位を明らかにした。 CryoEMは空の内部構造を明らかにする。 （iv）のリアノジン受容体、2.26 MDAの大きい四量体の細胞内チャンネルは、275のx ^275Å2の正方形として見られる。そのような中央断面とNSによる汚れの蓄積など、及びcryoEM低い密度領域としてマニフェスト中央うつ病などの複雑な表面の特徴。 NSは、すべての4つの試験したサンプルにおいて同様のコントラストを示しているが、cryoEMパネルの比較が、この膜タンパク質を可溶化する界面活性剤の存在下にのRyR1の低いSNR（コントラスト）を露出させる。

結晶質の氷、氷汚染、非点収差、ウェブ様構造（ 図3）：cryoEMアーティファクトの典型的な例は、RyR1のために示されている。その原因と予防は、さらなる議論の項に記載されている。

凍結された水和のRyR1のSPAおよび三次元再構成は、タンパク質のホモ四量体の組織（ 図4A）を反映し、その四重対称構造を、明らかにしている。細胞質ドメインは、275 X 275 X ^120Å3の正方形の角柱を形成し、足場のような構造を形成するいくつかの再現性の球状ドメインが含まれています。膜貫通ドメインは、115 X ^115×60Å3最大寸法が小さいテーパー正四角柱を形成している。 10Åの分解能ではαヘリックス（ 図4B）を可視化することが可能である。 3D差分マッピングは、この場合には、12 kDのタンパク質consideをFKBP12の3次元差分マップを重要なリガンドの位置を明らかにすることができるRyR1の赤色サブユニットは、RyR1の（ 図^4C）29に重畳される。最後に、コンフォメーション変化は、巨大分子の動的なビューを提供します。この場合、以前クローズまたはオープンどちらの条件において安定化のRyR1は、閉鎖から開放状態（ 図^4D）27質量転座を明らかにする。

クライオ電子顕微鏡技術の図1のフロー図。図は、プロトコルの主なステップを強調しています。

様々な試料のNSとcryoEMの2の比較図。 （A）AAV5、正二十面体ウイルス。（B）TMV、らせん状ウイルス。挿入図は23Åの螺旋の繰り返しを示している。（C）ネイティブKLH。（D）のRyR1。代表ビューは（F、四重ビューとs、側面図）をハイライト表示さ​​れます。全ての試料は、低用量条件下で200 kVの加速電圧下50,000Xの同じ倍率で画像化される。スケールバーは10nm。すべてのNSサンプルはカーボン担体上にあり、cryoEMサンプルA、C、Dはquantifoil上に薄い炭素上にあり、cryoEMサンプルBはquantifoil穴の真上にある。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

のRyR1 cryoEMサンプルに共通cryoEMアーティファクトを示す画像図3.ギャラリー。 （A）結晶氷。（B）アイス汚染（矢印）。（C）、乱視。非点収差、画像内RyR1sはかろうじて見える。右の挿入図は、電力SPECTを示しています非対称のトーンリングとのイメージのラム酒。左の挿入図は、参考のために非乱視画像のパワースペクトルを示している。（D）は、Webのような構造。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

リアノジン受容体の4 CryoEMと3D再図。 （A）isosurfaceの表現（B）原子座標とcryoEMエンベロープとの間の良好な一致を示すのRyR1のN末端^​​30の結晶構造のドッキング。矢印は、構造体から突出して2つのαヘリックスを指す。矢じりは、イオンチャネルのポアを囲む4ヘリックスのいずれかを示している。点線は、膜の境界を示している。（C）のRyR1と3D見よFKBP12リガンド（オレンジ色）のカチオン。（D）オープン（黒メッシュ）配座に閉じた（オレンジ色）から行く中のRyR1の構造変化。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

ディスカッション

SPA続いTEMは、所与の巨大分子のために、低解像度の3D構造は、第higher-が続いてもよいNSデータから決定され、一般的に、ミッド2014年EMDBで2000エントリに近づいて、多くの巨大分子の3D構造が寄与してい解像度cryoEM 3D構造。最初の3D再構成を容易にNSによって提供分子境界の高コントラストが、後で、完全に水和した状態で巨大分子、およびより高い解像度を達成する可能性の内部構造をマッピングする能力でcryoEMによって精製される。 cryoEMの別の利点は、巨大分子の崩壊につながる可能性が脱水ストレスの排除である。また、可能な表面吸収の影響を排除し、高分子が溶液中で採用ホメーションを示すカーボン担体を省略できる可能性がある。クライオネガティブ染色、cryoEM及びNSの組み合わせは、完全にhydは高コントラストを与える染色自体が巨大分子³¹の完全性を妨害する可能性があるため、評価試料ともSPAを使用して3D再構成をもたらすことができるが、しかし、それはより少ない頻度で部分的には、10未満EMDBのエントリで、使用されてきた。 3D再構成を助長する他の二つのTEM技術は、2D電子線結晶学と電子線トモグラフィーである。 2次元電子線結晶学は、平面または管状の結晶が必要です。結晶の電子回折は、潜在的に、原子分解能³²に至る3次元再構成のために使用される。ビトリファイドまたは伝統的に固定した標本の電子線トモグラフィーでは、高分子またはサブ細胞成分は、単数形のオブジェクトを再構築することができるという利点と、その後の断層復興³³のためのTEMの内側に回転させられる。現状では、この技術は^{、40〜34,35〜20}オングストロームの範囲の解像限界を有する。すべてのこれらの分子のTEM技術の中で、NSとcryoEMデータのSPAは最も広くなっている使用。プロトコルは、ここに示したSPAの分析に適しcryoEM画像を取得するに専用されている。それにもかかわらず、プロトコルのほとんどはまたcryoEM 2Dの結晶断層サンプルに適用可能である。

成功cryoEMセッションは多くの重要なステップの組み合わせの成功に依存します。心に共通cryoEMアーチファクトの説明を続けると、それらを回避する方法の重要な側面は、以下の段落に記載されている。このセクションでは、SPA法を用いた高品質の3D再構成を得るために、データ収集のガイドラインが記載されている。

氷の結晶質への移行は避けてください。中央の側面サンプルはTEM観察を通してクライオ急落の瞬間からガラス状態に滞在する必要があることです。したがって、液体エタン中に試料を急落した後、全ての後続ステップは、液体窒素（-196℃）又は液体ヘリウム（-269℃）の温度で行われる。 -135℃以上に加温することで硝子体に水を変換する結晶性の水;その後、巨大分子再配列が行われてもよいし、水の結晶が画像（ 図3A）を支配する。サンプルは捨ててください。取り扱いピンセットが不十分前ならば偶然のサンプルウォームアップは、クライオプランジングは、TEMに（gridboxで保護されている場合でも）コンテナ、および/またはクライオホルダーの挿入の間に凍結されたグリッドの移動が遅すぎる場合に発生する、または可能性があり冷却された。クライオ転送時のTEMにおける重要な真空劣化（冷たいサンプルは暖かい入ってくる空気をトラップし）、サンプルを温めることがあります。最後に、過剰照射の試料は、結晶氷への移行につながる可能性があります。

氷の汚染を最小限に抑えます 。少量のサンプル（3-5μL）をTEMグリッドに適用さを考えると、蒸発が緩衝成分（塩、洗剤）を集中するため、多量体状態の損失を含む巨大分子整合性に影響を与える可能性があります。高い相対湿度（RH）の微小環境またはチャンバ回避sのこの問題。代わりクライオプランジングが十分に換気され 、環境低温室で行うことができます。クライオプランジRH後に自身がコールドトラップとして作用する低温グリッドとして、氷の汚染、または低温グリッド上の周囲の湿度の凝縮を防ぐために可能な限り低くすべきである。アイス汚染は高コントラスト、〜5 nmおよび妨害またはさえ完全に画​​像をブロック数ミクロンの間の範囲の大きさの無い部分構造を有する粒子で構成されています。空気転送時の低温グリッドに向けて/呼吸を話して、空気ドラフトを避け、周囲のRHを減らす。 （白懸濁粒子として見える）凝縮水とのオープン液体窒素容器も廃棄されるべきである。

巨大分子の向き/ビューを最大化します。サンプルのサポートについては、なされるべき選択は、真のホーリーグリッドとホーリーグリッド上に薄い炭素の間にある。これは、サンプルが炭素孔対炭素膜の上に広がる方法は、（i）、（ii）の利用可能なサンプルconceに依存ntration、裸の穴（約0.02〜2μM）から画像上の同様の粒子密度のために、炭素担体よりも100倍高い濃度を必要とすること、及び（iii）高分子の配向の分布がどのようにランダムである。炭素親水性となるようにグロー放電を、注意、すべての3つの面で重要な効果を有し、これは、サンプル依存すること。高解像度の3D再構成を改良する際再発ビューランダム円錐再建による初期構造決定のために望ましいが、巨大分子の配向については、高分子のビューのランダム性が望ましい。この例では、RyR1のは大好きな「4倍」ビュー（ 図2D）と炭素と相互作用し、配向のランダム性と高い解像度³⁶ホーリー·グリッドが必要です。

SNR。SNRを増加するための最良の戦略は、ノイズのバックグラウンド源を減少させることで最大化する 。過度の氷厚さ及び（存在する場合）をサポートし、タンパク質は、余分なノイズが追加さ埋め込むために必要とされるものを超えた炭素膜の厚さ。したがって、氷の厚さは、ブロッティング時間、圧力、相対湿度、およびフィルター紙の品質を制御することにより、必要最小限に低減されるべきである。カーボン担体の場合は、薄い（〜5 nm）のカーボン膜が厚く、穴あきカーボン膜上に積層されている：サンプルは薄いカーボンで覆われた穴の上に結像されている間厚いホーリー炭素は機械的な抵抗を提供する。一方で、その非常に薄い氷の点に注意して、および/ ​​または炭素は、Web（ 図3D）になることができます簡単に壊れてサポートすることがあります。 SNRを最大化するために、不要な緩衝液成分は避けるべきである。膜タンパク質のために、洗剤は対照的に大きな打撃を与えた（ 図2D、右側のパネルを参照してください）かかり。表面張力を減少させることによりさらに界面活性剤は、サンプル支持体上に広がっている方法を変更します。いくつかの膜タンパク質は、detとに加えて、脂質の存在を必要とするさらにコントラストを低下させるergent、。これを克服するために、サンプルは、単に凍結急落³⁷の前に低い界面活性剤濃度で脂質なしで緩衝液中に希釈することができる。新しい代替洗剤¹⁶および膜貫通ドメイン成分を安定化するナノディスク³⁸の使用はcryoEMによる撮像膜タンパク質のための成功したアプローチであると思われる。

高品質の画像のために努力し、CTF補正のために準備する。ビトリファイド標本がなくはあり指していないもので、CTF、周波数に強度を関連付ける機能は、いくつかのゼロ遷移を持って十分な画像（位相）のコントラストを生成するために、高いデフォーカス値を必要とする情報。 CTF補正は、低解像度の3D再構成のために必要ではないが、より高い解像度を目指すとき、3Dオブジェクトの正確な表現を回復するために、異なるdefociの画像は、計算CTF補正を行うことができるように、収集される必要がある。CTFの決定及び補正は、主要なSPAソフトウェアパッケージ^4-7に含まれています。詳細は別の場所で³⁹見つけることができます。最適CTF補正のため、defociの範囲を使用。良い戦略は、3-4デフォーカス値の間で交互にある。値は、巨大分子のサイズに依存（大きいサイズが少なく、デフォーカスを必要とする）、氷/カーボンの厚さ（シンナーサンプルが少ないフォーカスを必要とする）、及び電圧（低電圧が少なく、デフォーカスが必要です）。 200 kVの場合、値の良い出発範囲は2.5、3、3.5と4μmのデフォーカスである。 CTFは、逆格子空間表現、パワースペクトルにおいて、高および低強度の環（トーンリング^40）を交互として現れる。パワースペクトルを表示する解像度の可能性を明らかにする。最も広い可視のトーンリングの周波数は、達成可能な解像度の事前推定最も近い。パワースペクトルは、定期的にチェックし、乱視（非円形）のトーンリングされるべきである（ 図3C）は、客観的なスティグマを修正する必要があります。トーンリングは、少なくとも所望の解像度まで表示されるはずです。

このプロトコルを使用して得られたcryoEMデータセットを直接3D再構成を生成するために、SPAによって処理することができる。でも、理想的なサンプルで、3D再構成の品質がTEM機器の性能仕様の、画像処理に依存するであろう。これらの両方の前線の継続的な改善をし、最近開発された直接の電子検出器への特別な言及に、より一貫して、原子分解能での3D再構成を得る可能性は、それが今までにあったより近いです。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
エタン	エアガス	371745	純度99.99%非常に重要で、不純物はグリッド上に高コントラストの汚染物質を引き起こす可能性があります。注意:可燃性
液体窒素	エアガス	27135	99%純度。注意: 冷蔵室で液体窒素を取り扱うと、警告サインなしに窒素が酸素を置き換えるため、深刻な窒息の危険があります。
デュモン No. 5 耐磁性ピンセット	テッド ペラ	5326
マイカ シート、1 x 4 cm	テッド ペラ	54
グラファイト ロッド、シャープなサイズ 1/8" 直径 x 2 ¼”ロングチップ 0.039インチdia neck type	Electron Microscopy Sciences	70220-45
350 ml cryo-dewars	Pope	8600
Cu 400 mesh holey grids クォンティフォイル	ォンティフォイル	Q10525
Cu 400 メッシュ 穴あきグリッド Cフラット	プロトチップス	CF-1.2/1.3-4C
グロー放電装置	電子顕微鏡 科学	モデル E7620
ターボポンプステーション	ガタン	モデル 655
カーボンエバポレーター	デントン バキューム	モデル 502B
フリーズプランジャー	FEI	Vitrobot Mark IV
透過型電子顕微鏡 200 kV	FEI	モデル Tecnai F20
CCD カメラ 4k x 4k	Gatan	UltraScan 4000 UHS
画像処理ソフトウェア CTFFIND3/CTFTILT			http://grigoriefflab.janelia.org/ctf
画像処理ソフトウェア EMAN			http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2
画像処理ソフト Spider			http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html
画像処理ソフト Freealign			http://grigoriefflab.janelia.org/frealign
3D可視化ソフトウェア Chimera			http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/
Native Keyhole Limpet Hemocyanin	Biosyn