バークホルデリアsartisoli RP037-MCHEと全細胞バイオレポーターアッセイは、水飽和モデル系内の空気で満たされた細孔を橋渡し菌糸体により能動輸送後の細菌による分解に利用可能な有機汚染物質（ すなわち、フルオレン）の画分を検出するために開発されました。
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方法論記事
水不飽和システムにおける有機汚染物質の輸送および生物学的利用能を評価するために、全細胞バイオレポーターアプローチ
この記事について
サマリー
要約
汚染物質のバイオアベイラビリティは、土壌中での効果的な生分解の前提条件です。ただし、汚染物質の平均バルク濃度は、その可用性の適切な尺度ではありません。バイオアベイラビリティは、むしろ、化合物の微生物細胞への潜在的な物質移動(フラックス)の動的な相互作用と、微生物細胞が化合物を分解する能力に依存します。土壌の水が不飽和な部分では、菌糸体は、センチメートルの範囲で有機化合物を積極的に輸送および動員することにより、バイオアベイラビリティの制限を克服することが示されています。菌糸体による輸送の程度は化学的手段で容易に定量化できますが、細菌細胞への汚染物質のバイオアベイラビリティの検証には生物学的な方法が必要です。この制約に対処するために、モデル化合物としてPAHフルオレン(FLU)を選択し、空間的に分離されたFLU点源とFLU分解バイオレポーター細菌Burkholderia sartisoli RP037-mCheをPythium ultimumの菌糸体ネットワークでリンクする水不飽和モデル小宇宙を開発しました。バイオレポーターはPAHフラックスに応答してeGFPを発現するため、細菌のFLUへの曝露と分解は、共焦点レーザー走査型顕微鏡(CLSM)を介して小宇宙で直接監視できます。CLSMおよび画像解析により、菌糸体またはFLUを含まない対照と比較して、P. ultimumの存在下でのeGFP発現の有意な増加が明らかになり、菌糸体を介した輸送後の細菌に対するFLUのバイオアベイラビリティが示されました。CLSMの結果は、同一の小宇宙での化学分析によって裏付けられました。開発された小宇宙は、汚染物質のバイオアベイラビリティを調査し、それに付随して関与する細菌と菌糸体の相互作用を視覚化するのに適していることが証明されました。
概要
土壌は、高密度に細菌などの微生物1,2の広い範囲によって入力されます。しかし、この生息地の条件は特に水の利用可能3換算で、挑戦的である。細菌は、恒久的に異機種環境4に最適な条件を探索する必要がありますが、連続した水膜の不在は、自由に広げるために、それらを妨げる制限されたモビリティ5になるさ。また、溶質の拡散速度（ 例えば、栄養素）は、不飽和条件6の下に低下する。そのため、細菌や栄養素は、多くの場合、物理的に分離され、栄養のアクセシビリティは3に制限されている。結果として、連続的な水相を必要としない化学化合物のための輸送ベクターは、これらの制限を克服するのに役立つ可能性がある。実際には、そのような真菌および卵菌などの多くの微生物がそれによって達するとmobiは空気で満たされた孔隙を通して成長できるようにすること糸状成長形を開発したlizingも物理的な長距離での栄養素7と炭素質8物質を分離した。彼らは細菌9に糖及び他のエネルギー源を提供し、生物学的輸送ベクターとして作用することができる。菌糸生物における取り込みと輸送はまた、このようなピシウムultimum 10またはアーバスキュラー菌根菌11で中の多環芳香族炭化水素（PAH）などの疎水性有機汚染物質のために示....
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プロトコル
料理の調製、スライドとインキュベーションチェンバース
- 各小宇宙に次の材料を準備します。一つの大きなプラスチック製のペトリ皿の底部（D = 10cm）に、蓋と3空洞を有する1カウントチャンバースライドで（ステップ1.2を参照）、小さなプラスチック製のペトリ皿の底の（D = 5 cm）の修正1。
- ペトリ皿の底部の所望の数の（d = 5 cm）を取る。正確にスライド（26ミリメートルエッジ長）が合うようにのこぎりでつばの部分を削除します。システムを滅菌するため、70％エタノールのO / Nでペトリ皿の底と蓋を浸漬し、UV光下での流キャビネット中で少なくとも2時間のためにそれらを乾燥させる。また、2時間UV光にさらされていた密閉プラスチック容器、ペトリ皿に保管してください。
- 70％エタノールとを含むスライドの所望の数ワイプそれらを空気乾燥する。アルミホイルでスライドをラップし、可能な汚染を除去するために、450℃で5時間マッフル炉に入れます。
- 蓋付きガラスインキュベーション室を準備します。 70％エタノールで清掃し、流キャビネット内の少なくとも2時間のUV光にオープンチャンバーを公開。
注：蓋付き大型デシケーター（30 -1付近の直径）は、この目的のために使用することができる。各デシケーターは10縮図のセットアップまで収容することができる。
メディアと文化の調製
- 、....
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結果
ここに示す結果は、すでに15以前を発表されている。詳細な機構的および環境的な議論のための記事を参照してください。
CLSMを介して画像記録した後、最大強度投影は、サンプルの第1の視覚的印象を制御（ 図2）を得るために、各顕微鏡ソフトウェアまたはImageJをを用いて行うことができる。その後、データセットは、特定の可視化ソフトウェアによって意味のある特徴を示すために異なって投影することができる。ポジティブコントロール（CONのPOS）が空中コントロール（CONのAIR）のに対してのみ背景eGFP蛍光（ 図2B）を示す、明確なeGFPの誘導（ 図2A）を示している。試験サンプル（SAM）におけるeGFP蛍光はCON AIR、yに比べて上昇しているようら
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ディスカッション
提示縮図のセットアップは菌糸体による取り込みおよび輸送の後に生物を劣化させることに空間的に分離され、化学物質の生物学的利用能を研究するのに適して証明した。部分的に揮発性化合物の潜在的気相輸送が防止され、細菌のバイオレポーター細胞が重要なシステムの最小の妨害で、従って精巧なサンプル調製を必要とせずに可視化することができる。同時に、サンプルの化学分析が容易に得られる結果を良好に制御するために、総輸送の定量化を可能に行うことができる。しかし、いくつかの点を注意深く前および実験の実行中に考慮されなければならない。重要な点は、任意の細菌または化学的架橋汚染の自由微小生態系を維持することである。多くの微小生態系が並列で実行され、従って、（例えば、デシケーターなど）大きなインキュベーションチャンバーが必要とされるので、これは困難な場合があります。したがって、前のセットアップconstrucに慎重にすべての部品を殺菌することが重要であるる。別の重要な点は、マイクロコズムプラスチックペトリ皿のアプリケーションであってもよい。 PAHとバイオレポーターが直接接触し得ないが、PAHある量のプラスチック材料によって吸収されてもよい。これがもたらすであろうしかし.......
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開示事項
著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言する。
謝辞
ドイツ環境財団(DBU)からの資金提供が承認されました。著者らは、CLSM解析の技術的支援を提供してくれたUte Kuhlicke氏と、熟練した実験支援を提供してくれたBirgit Würz氏、Rita Remer氏、Jana Reichenbach氏に感謝します。著者らは、実りある議論とバイオレポーター株の提供について、Jan Roelof van der Meer教授とRobin Tecon博士に特に感謝します。これは、ヘルムホルツ協会の「環境中の化学物質」(CITE)研究プログラムに貢献しています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 共焦点顕微鏡 | Leica | TCS SP5X, LAS AF - Version 2.6.1; または同等のCLSM | |
| GC HP 7890シリーズGCおよびAgilent 5975C MSD | Agilent | と同等のGC/MSは | |
| GCキャピラリーカラムJ&;W 121-5522 | Agilent | ||
| コルク穴あけ機 | フィッシャー サイエンティフィック | 12863952 | またはその他の |
| カバー スリップ | マリエンフェルド | 107222 | 高性能、No.1.5H |
| GC/MS インスターツ | WICOM | WIC 47080 | |
| GC/MS バイアル 2 ml | WICOM | WIC 41150 | |
| スクリュー キャップ バイアル用蓋/セプタム | DIONEX | 49463 / 049464 | |
| GC/MSバイアル用蓋 | WICOM | WIC 43948/B | |
| 対物レンズスライド | Menzel | 通常の | |
| PDMSコーティングガラス繊維 | Polymicro Technologies, Inc. | V (PDMS) = 13.55 ± 0.02 &マイクロ;l m-1 | |
| ペトリ皿 小さい/大きい | Greiner | 633-102/628-102 | |
| スクリューキャップバイアル 40 ml | DIONEX | 48783 | 他のガラスバイアルを使用することができます |
| スクリューキャップバイアル 60 ml | DIONEX | 48784 | 他のガラスバイアルを使用することができます |
| アセナフチレン d08 | Dr. Ehrenstorfer | C 20510100 | |
| アセトン | カールロス | 9372.2 | |
| 活性炭 | シグマアルドリッチ | 242276-1kg | |
| アガロース | カールロス | 2267.4 | |
| フルオレン | フルーカ | 46880 | |
| マイシン硫酸カール | ロス | T832.2 | 50 mg L-1 |
| メタノール | カールロス | P7171 | |
| Minimal Medium: 100 ml Solution 1 + 25 ml Solution 2 + 5 ml Solution 3 ad. 1,000 ml aqua dest | |||
| Solution 1 | |||
| Ammonium sulfate | Carl Roth | 3746.1 | 5 g L-1 |
| 塩化マグネシウム x 6 H2O | カール・ロス | 2189.1 | 1 g L-1 |
| 硝酸カルシウム x 4 H2O | カール・ロス | P740.1 | 0.5 g L-1 |
| Solution 2 | |||
| 二ナトリウム | カール・ロス | P030.1 | 55.83 g L-1 |
| リン酸一カリウム | カール・ロス | 3904.1 | 20 g L-1 |
| Solution 3 (pH 6.0) | |||
| EDTA | MERCK | 二ナトリウム 1084180250 | 0.8 g L-1 |
| Iron(II) chloride x 4 H2O | MERCK | 1038610250 | 0.3 g L-1 |
| 塩化コバルト(II) x 6 H2O | カール・ロス | T889.3 | 4 mg L-1 |
| マンガン(II) x 1 H2O | カール・ロス | 4320.2 | 10 mg L-1 |
| 銅(II) カール | ・ロス | P023.1 | 1 mg L-1 |
| モリブデン酸ナトリウム x 2 H2O | カール・ロス | 0274.1 | 3 mg L-1 |
| 塩化亜鉛 | メルク | 1088160250 | 2 mg L-1 |
| 塩化リチウム | カール・ロス | P007.1 | 0.5 mg L-1 |
| >塩化スズ(II) x 2 H2O | Carl Roth | 4473.1 | 0.5 mg L-1 |
| >ホウ酸 | Riedel-de-Haen | 11606 | 1 mg L-1 |
| 臭化カリウム | カール・ロス | A137.1 | 2 mg L-1 |
| ヨウ化カリウム | カール・ロス | 6750.1 | 2 mg L-1 |
| 塩化バリウム | カール・ロス | 4453.1 | 0.5 mg L-1 |
| MMA | 最小培地 + アガロース 0.2% | ||
| フェナントレン D10 | Dr. Ehrenstorfer | C 20920100 | |
| Potato Dextrose 寒天: 24 g L-1 ブロス + バクト寒天 1.5%; pH 6.8 | |||
| ポテト デキストロース ブロス | Difco/ Beckton Dickinson | 254920 | |
| バクト寒天 | Difco/ Beckton Dickinson | 214040 | |
| 酢酸ナトリウム x 3 hydr. | カールロス | 6779.1 | |
| 硫酸ナトリウム | MERCK | 1066495000 | |
| トルエン | MERCK | 1083252500 | |
| mTY中:3 g L-1酵母エキス、5 g L-1 bacto トリプトンと 50 mM | |||
| NaCl 酵母抽出物 | Merck | 1037530500 | |
| Tryptone Serva | 4864702 | ||
| 塩化ナトリウム | Carl Roth | 3957.1 | |
| ImageJ (Logi ツール プラグイン | http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html と http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10 | ||
| Pythium ultimum株 67-1 | クリストフ・キール博士の研究室から入手。Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland | ||
| Burkholderia sartisoli RP037-mChe | Jan Roelof van der Meer教授の研究室から入手。ローザンヌ大学基礎微生物学部(スイス) |
参考文献
- Holden, P. A., Fierer, N. Microbial processes in the vadose zone. Vadose Zone Journal. 4, 1-21 (2005).
- Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. Prokaryotes: The unseen majority. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 6578-6583 (1998).
- Kieft, T. L....
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