このプロトコルは、遺伝子組み換え、注射可能なスフェロイドを使用した細胞移植システムについて説明しています。細胞スフェロイドをマイクロパターン化した培養プレート上で培養し、遺伝子導入後にポリプレックスナノミセルを用いて回収します。このシステムは、移植された細胞からの宿主動物への長期にわたる導入遺伝子発現を促進しながら、細胞の本来の機能を維持します。
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この記事について
サマリー
要約
細胞移植の治療効果を改善するために、遺伝的に改変された、注射可能なスフェロイドの移植システムを開発しました。細胞スフェロイドは、感熱性ポリマーでコーティングされたマイクロパターン上でプレート培養系で調製されます。スフェロイドの数は、ポリエチレングリコール（PEG）マトリックスによって被覆されている非接着性領域によって囲まれ、定期的に二次元的に配列された直径100μmの細胞接着領域に対応する、プレート上に形成されています。スフェロイドは、容易にプレートの温度を低下させることにより液体懸濁液として回収することができ、その構造は、ウェル（27 G上の）十分に大きな口径の注射針に通して維持されます。遺伝子改変は、球状構造を破壊することなく細胞に遺伝子を導入することが可能である元の非ウイルス遺伝子キャリア、ポリプレックスナノミセルを用いた遺伝子導入によって達成されます。プリムのためのアルブミンの発現によって示されるように、ルシフェラーゼを発現する遺伝子でトランスフェクト進肝細胞スフェロイドは、ルシフェラーゼは持続、保存肝細胞機能と共に、移植動物において得られます。このシステムは、間葉系幹細胞を含む種々の細胞型に適用することができます。
概要
細胞移植療法は、様々な難治性疾患を治療するために広く注目を集めています。移植された細胞によって分泌される生物活性因子の活性及び半減期は、細胞移植システムの改良された治療効果のために不可欠です。移植前の細胞の遺伝子改変は、生物活性因子の分泌などの細胞機能を調節して操作するための有益な技術です。これは、細胞死または細胞活性の喪失を回避するための細胞のための良好な微環境を維持することも重要です。細胞間相互作用が十分に保持された3次元（3D）スフェロイド細胞培養物は、（初代肝細胞のアルブミン分泌を改善し、間葉系幹細胞の多系列分化を促進するために、例えば、この目的のためにMSCを約束しています）1-7。
spheroiのこの研究では、新規な組み合わせシステムD培養および遺伝子トランスフェクションは、遺伝的に改変された細胞移植のためのプラットフォームとして機能するように使用されます。スフェロイド細胞を作成するための、マイクロパターン培養プレート上でスフェロイド培養系を用いています。これらのプレート上で、100ミクロン直径の細胞接着領域が規則的に二次元的に配列され、PEGマトリックス3によって被覆された非接着性領域によって囲まれています。細胞の十分な数を播種することにより、直径100μmの3Dスフェロイドのアレイは、マイクロパターン培養ベッドに対応して形成されています。
スフェロイドは、感....
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プロトコル
すべての動物実験は、東京大学の動物実験委員会、東京、日本の承認を得て実施しました。
1.細胞の調製
- 初代肝細胞の場合は、変更された二段階コラゲナーゼ消化プロセス13,14によってラットから肝細胞を単離するためのプロトコルに従ってください。
- イソフルラン吸入麻酔下でのスプラーグドーリー（SD）ラット（雄、5週齢）を麻酔。チャンバーのためにイソフルランを提供するために、麻酔装置に接続されたチャンバ内にラットを置きます。眠りに落ちる後のラットを取り出し、マスクを使用して換気を手術台の上に置きます。ラットの条件をチェックすることにより、0.7リットル/分 - イソフルランが0.4で約フロー制御。 8グラム/ L塩化ナトリウムからなる特殊な溶液（NaCl）で、400 mg / Lの塩化カリウム（KCl）、78ミリグラムで肝門脈のスプラーグドーリー（SD）ラット（雄性、5週齢）の肝臓を灌流/ Lリン酸二水素ナトリウム二水和物（のNaH 2 PO 4·2H 2 O）、151 mg / Lのリン酸水素二ナトリウム十二し（Na 2 HPO 4·12H 2 O）、2.38グラム/ Lの2- [4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジニル]エタンスルホン酸（HEPES）、190 mg / Lのエチレングリコール四酢酸（EGTA）、350 mg / Lの....
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結果
ガウシアルシフェラーゼを発現するpDNAの遺伝子トランスフェクションは、ポリプレックスナノミセルまたは対照脂質ベースのトランスフェクション試薬12を使用して、肝細胞またはMSCのことで形成された球状体で実施しました。対照試薬が大幅にトランスフェクション（ 図3）の翌日の構造を破壊し、一方ナノミセルは、マイクロパターンプレート上の非トランスフェクトスフェロイドと比較スフェロイド構造はほとんど変化を誘導しませんでした。ナノミセル、一貫性のアルブミン分泌およびトランスジーン（ガウシアルシフェラーゼ）式を用いてトランスフェクションした後だけでなく、ほぼ月に維持しました。コントロール試薬を用いた場合に導入遺伝子の発現の程度はナノミセル（ 図4）12から得られたものと同様であったものの、全くアルブミン分泌は観察されませんでした。
感熱マイクロパターンプレート、3Dのを使用して、スフェロイド回復中スフェロイドのtructureはよく初代肝細胞と冷却プレート（ 図5）
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ディスカッション
このプロトコルでは、遺伝子導入及びスフェロイド回収工程中のスフェロイドの3次元構造を維持することが重要です。細胞が細胞死または細胞活性の損失を回避することが有利な微小環境を維持するために不可欠です。従来の単層培養中の肝細胞が急速に数日12を播種した後、それらの分泌能力を失いつつ例えば、アルブミン分泌、肝細胞の代表的な先天性機能は、よく、肝細胞スフェロイドに保存されます。 for MSCSは、スフェロイドが大幅脂肪生成および骨形成に関与する遺伝子の発現レベルの増加と、脂肪細胞または骨芽細胞への分化のその効率を向上させ、ダウンレギュレーション遺伝子のMSC自己再生表現型4を維持します。
遺伝子導入のために、様々なトランスフェクション試薬は、脂質ベースのもの（ 図3、4）を含む、以前に試験されました例えば、ポリエチレンイミンなどのポリマーベースのもの、。残念ながら、試薬のいずれも、回転楕円体の構造を破壊することなく、成功した遺伝子導入を提供しませんでした。導入遺伝子の発現があってもマイクロパターンプレート上の残.......
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開示事項
著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。
謝辞
私たちは深く感熱マイクロパターン培養プレートと同様に科学的助言を提供するための東洋合成工業、東京、日本の博士武池谷と技術スタッフに感謝します。また、動物実験での技術支援のためにさんさとみ小倉さん沙鈴木さんあすか三好さんとかつえ森井に感謝します。この作品は、財政的に日本学術振興会科研費科学研究費補助金によって部分的にサポートされていた、イノベーション（COI）プログラムのセンターと独立行政法人科学技術振興機構（JST）からのS-イノベーションプログラム、およびJSPSコア - のコアプログラム、A.先端研究ネットワーク。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Pen-Strep-Glut | GIBCO | ||
| デキサメタゾン | 光純薬工業 | 041-18861 | |
| チンアミド | 和光純薬工業 | 141-01202 | |
| ハンク緩衝塩・L-アスコルビン酸 2-リン酸 (Asc-2P) | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| ヒト上皮成長因子 (hEGF) | 東洋紡PT10015 | ||
| セル型マルチウェルプレート | 東洋合成 | PP-12 | |
| 感熱性細胞培養プレート (Upcell) | CellSeed Inc | .マイクロパターン化されたアーキテクチャは、感熱プレート(東洋合成によるカスタムビルド)上に構築されています脂質 | |
| ベースのトランスフェクション試薬(FuGENE HD) | Promega | E2311 | |
| Renilla Luciferase Assay System | Promega | E2810 | |
| pGL4 Luciferase Reporter Vector | |||
| luciferase | New England BioLabs | N8082S | |
| マウスエルトロポエチン発現ベクター | Origene | MC208445 | |
| pCAG-GS | 提供:発生生物学研究センター多能性細胞研究室 理研 | ||
| em>Escherichia coli DH5α コンピテントセル | 宝 | 9057 | |
| エンドトキシンフリープラスミドDNA精製システム | 日本ジェネティクス | NucleoBond Xtra EF | |
| コラゲナーゼ | 和光 純薬工業 | 639-00951 | |
| トリプシン阻害剤 | GIBCO | R-007-100 | |
| ルミノメーター | プロメガ | GloMax™ 96 マイクロプレート ルミノメーター | |
| IVIS イメージングシステム | Xenogen Corp. | Xenogen IVIS in vivoイメージングシステム | |
| 血液サンプル分析装置 | Sysmex | pocH-100i 全自動血液分析装置 |
参考文献
- Landry, J., Bernier, D., Ouellet, C., Goyette, R., Marceau, N. Spheroidal aggregate culture of rat liver cells: histotypic reorganization, biomatrix deposition, and maintenance of functional activities. J Cell Biol. 101 (3), 914-923 (1985).
- Yuasa, C., Tomita, Y., Shono, M., Ishimura, K., Ichihara, A.
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再版と許可
