磁気マイクロスフェアの眼注射によって誘発実験緑内障

サマリー

私たちは、緑内障をモデル化するために、ラットの眼に磁気マイクロスフィアを注入することにより、眼圧(IOP)の上昇を誘発する方法を提示します。これにより、強い圧力が上昇し、広範なニューロン死につながります。このプロトコルは、実施が簡単で、繰り返しの注入を必要とせず、安定した長時間の眼圧上昇を実現します。

要約

病態の理解と緑内障の新規治療の提供の進歩は、この疾患の優れた動物モデルに依存しています。ここでは、磁気マイクロスフェアを眼の前房に注入することにより、ラットの眼圧(IOP)を上昇させるためのプロトコルを紹介します。磁性粒子を使用することで、ユーザーはビーズを虹彩角膜の角度に操作することができ、海綿網からの流体流出を非常に効果的に遮断することができます。これにより、眼圧の上昇が長期化し、最終的には神経節細胞層(GCL)の神経細胞死や視神経の病理に至ります。この方法は、機械、専門的な外科技術、または完璧にするために何時間もの練習を必要としないため、簡単に実行できます。さらに、圧力上昇は非常に堅牢であり、プラスチックビーズを使用する他のモデルとは異なり、磁気マイクロスフェアの再注入は通常必要ありません。また、この方法はマウスの眼への適応にも適していると考えています。

概要

原発緑内障は、人生を変える失明と失明²につながる可能性が世界¹を通じて推定6050万人に影響を与える壊滅的な眼疾患である。病気のメカニズムの研究、および緑内障のための新規治療薬の開発は、病理学の特徴の一部を再現疾患の良いモデルに依存している。

我々はSamsel らの方法に基づいて、ここでラット緑内障モデルを提示する^。3この技術の全体的な目標は、前房内に磁性微小球を注入し、磁性リングを使用して眼における眼内圧（IOP）を増大させることで、ダイレクト虹彩角膜角にそれら。これは神経損傷と細胞損失につながる、IOPを増加させ、水性流出を、妨げる。プロトコルは、緑内障の単純な、誘導性のモデルを提供しようとするために開発された。

このプロトコルは、いくつかの利点を有し得る既存の技術上。そのようなDBA / 2Jのような遺伝子マウスモデルが開始するために、手順を必要としない、利用可能です。しかしながら、これらは、疾患の進行⁴の予測不可能な発現を有していてもよい。対照的に、外科的にげっ歯類においてIOPを上昇させるに頼るほとんどは誘導性モデルは、開始は、ユーザによって制御することができるという利点を有する。これらの方法のいくつかを含む⁵つ^の技術的に困難である、しかし、自分自身の欠点を有していてもよく、高められたIOP ^6を維持するために、複数の手順を必要とし得る。

対照的に、本稿で詳述誘導方法は、再注入のための最小限の必要性と圧力の安定した、強固な増加を生成する、単純な、効果的で、再現可能な技術である。加えて、高価な装置を必要としない、とだけ実行する基本的な外科技術を必要とする。このプロトコルは、より少ない技術的に要求の厳しい誘導性をセットアップしようとしている読者のために適切であるかもしれない彼らの実験室での緑内障モデル。

プロトコル

倫理声明 ：すべての動物実験は、施設内動物管理使用委員会（IACUC）に従って行われており、英国内務省のガイドラインと一致して承認された（ http://goo.gl/FLkirW 、最後の6月^番目の 10にアクセス、2014）と、眼科及び視覚研究（中動物の使用に関するARVO声明http://goo.gl/4LFOjDは 、最後の10 ^番目の 6月、2014年）をアクセスした。

1.高眼圧症の誘導

1. Samsel らの方法に基づいて、ブラウンノルウェーラットの前房内に常磁性ミクロスフェアの一側性注射を介して眼内圧（IOP）を上昇させることにより実験的緑内障を誘発する。これらは、検証される必要があるが^、3他の着色されたラットは、適切であり得るユーザーによる最初。
2. ハウス250〜300 gの女性食料と水を自由に摂取して、IOP ⁷日内変動を最小限に抑えるために一定の低照度環境でのEX-ブリーダーブラウンノルウェーラット（40〜60ルクス）。
3. ラットの眼⁹で使用するために較正されたリバウンド眼圧計を使用して、前麻酔ビード注射覚醒動物⁸ベースラインIOP測定を行う。 IOPは、5つの測定値の平均値とする。
4. 腹腔内に納入37.5 mg / kgをケタミン、および0.25 mg / kgをメデトミジン塩酸塩としたラットを麻酔し。動物の後足反射神経をテストすることによって麻酔の深さを確認し、ヨウ素アプリケーション（ステップ1.5を参照）、およびビーズ注入をポビドン前に（ステップ1.8を参照）。鎮痛のために0.5％のプロパラカイン塩酸塩を管理します。
   注：いずれかの段階で瞳孔を拡張しないでください。これは、ビーズが隅角に優れ落ち着く、とレンズへの結合を防ぐのに役立ちます。非手術反対側の眼に角膜の乾燥を防ぐために、眼軟膏を適用します。
5. W注射前に水¹⁰ 5分で5％ポビドンヨードと作動目を灰。
6. 5分後、滅菌ガーゼを使用してオフにポビドンヨードを吸い上げ、0.9％滅菌生理食塩水で目を洗う。滅菌生理食塩水の定期的なアプリケーションとの麻酔中湿った目を離さない。
7. 目の周りのトロイダル磁石を配置します。
8. 33 Gベベル針を使用して、前房内にハンクス平衡塩溶液（HBSS）で8μmの磁気マイクロスフェアを滅菌ガンマ線照射の30 mg / mlのを含む溶液25μlを注入。
   1. ビーズを調製するために、最終の30 mg / mlの溶液を作成する前に、1mlのHBSSで5分間、10,000×gで3回遠心分離し、再懸濁することにより洗浄する。全体の無菌状態を維持してください。
   2. 注射のために、アイリス外傷のリスクを最小限に抑えるために、アイリスに針を挿入しないように注意してください。これはに平行として、角膜表面に対して接線針を配向することによって防止することができますできるだけアイリス。これはまた、注射部位からのビーズの損失を最小限に抑えるのに役立つ。
      注：IOPを上げるために重要である隅角、周りにも分布を確実にするために急速にビーズを注入。また、ストアビーズ、針と磁性環別々ビーズは、それらが困難シリンジにロードし、注入すること、クラスターを形成せず、針が磁化されないように。
9. ビーズは小柱網から水の排水を妨げるために隅角に落ち着くことを保証するために1分後に注射のために所定の位置に針を残します。わずかに角度がビーズ後の針は、最初はIOPの一過性の増加を最小限に抑えるために、水の一部漏出を可能にするために定住している。手術の最後に最初のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で針を介してフラッシュし、その後、蒸留水、続いて70％エタノールは、別個の手順において、ニードルの継続的な使用を確保する。あるいは、使用することができます使い捨ての針正しいゲージと注射器の組み合わせが利用可能な場合。オプション：針はそれらの使用を延長するbevellerを使用して先鋭化することができる。
10. 必要であれば、この段階では、マグネットを削除し、不完全な被覆の領域にビーズを描画するためにそれを使用。
11. ビーズが隅角にうまく解決することを確認するために、さらに10分後に、注射のために目の周りの所定の位置に磁石のままにしておきます。
12. 0.25 mg / kgをatipemezole塩酸塩を用いて逆麻酔。
13. 感染を予防するために局所的に、例えばゲンタマイシン又はテラマイシンために、クロラムフェニコール、または他の抗生物質軟膏を管理、および鎮痛のための0.5％塩酸プロパラカイン。回復が完了するまで、そのような栄養補助食品または湿らせた通常の食事として、追加の栄養と暖かいボックスと電源に転送し、その後、彼らは動きを取り戻すまで、ヒートマットの上に回復する動物のままにしておきます。全身または局所鎮痛は、手術後の痛みの24時間の兆候を示す動物に与えられるべきである。 THESの場合Eの症状は治療にもかかわらず持続する、動物が人道的に殺処分されるべきである。
14. 無操作コントロールとして反対側の目を使用してください。
15. ビーズ投与後2〜3日ごとに、その後、ラットの目⁹で使用するために校正さリバウンド眼圧計を使用して2〜3日ごとにIOP測定を行う。
16. 1）IOPが5 mmHgのことで反対側の制御圧力以上に上昇した場合、および2）60 mmHgのを超えていない：研究で目を含むための基準とすることができる。
17. （通常は1週間後に注射による）ベースラインに圧力戻り、研究に含めるべきではない目は、しかし、それは、必要に応じて、高IOPを開発するために失敗するの目に再注入するビーズが可能である。
18. 実験の終了時にCO ₂窒息により動物を安楽死させる。
19. 眼および視神経を分析し、さらなる組織学的分析のために一晩、4％パラホルムアルデヒド（PFA）で固定する。

2. TUNEL Sを使用して、網膜神経細胞のダメージを評価するtaining

1. 製造業者の説明書に従って、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介dUTPニック標識（TUNEL）アッセイretinasuseホールマウント内のアポトーシス細胞を定量化する。
2. リン酸緩衝生理食塩水（T-PBS）中の0.3％トリトンX-100で3×5分間洗浄し、アイカップから網膜を解剖。
3. 2時間、3％のT-PBSで組織を透過性。
4. 37℃で1時間TUNEL反応液中でのインキュベーションの前に、10分間の平衡化バッファーで網膜を予め平衡化。
5. 5μMDAPIを含む0.3％T-PBSですすぎ、0.3％T-PBSで3×5分間組織を洗浄し、実装メディアにフラットマウント。
6. TUNEL陽性の核が20倍の倍率で神経節細胞層を通して10ミクロンのzスタックを取る共焦点顕微鏡を使用して定量化する。全体mounあたり12画像の合計を与え、網膜の遠い周辺部に半ば周囲には、視神経に近い所で、4花びらのそれぞれに3画像を撮影し、tは、約7000の細胞をサンプリングする。形態学的基準は、神経細胞からの非ニューロン（内皮細胞およびグリア）細胞を区別し。
7. 唯一のDAPIチャネルを使用して画像化する領域を選択して、処置群に捜査をマスクする。

3.トルイジンブルー染色を用いて視神経損傷の評価

1. 一晩4℃でカルノフスキーの溶液中で視神経を修正。
2. 1％（w / v）の四酸化オスミウムで2時間の試料を処理し、その後、100％エタノールで脱水する。
3. 30分間のプロピレンオキシドで視神経をインキュベートし、プロピレンオキシドの50:50混合物中に置く：アラルダイト一夜。
4. 60℃で一晩インキュベートし、100％アラルダイトこの溶液を、変更する。
5. カット半薄切片（0.75ミリメートルの厚さ）し、光学顕微鏡による検査の前に50％エタノール中の1％トルイジンブルー/ホウ砂（TB）で染色する。

4.統計分析

1. 統計的ANAを実施適切な統計ソフトウェアパッケージを使用して溶解する。ニューマン-Keulのポストホック検定を二元配置ANOVAは、IOPが経時的に変化するための統計的有意性を計算するために使用され得る。
2. 0.05未満のp値を有意とみなしてもよい。

結果

隅角への磁気ビーズの注入は常に最初の時点で容易に観察可能であった圧力で長時間堅牢上昇（ 図1）、3日後に注射を誘導した。さらに、圧力の増加は、実験期間を通して維持された、活動の時間経過は、18日後にポスト噴射を終了しているが、他の人は、圧力は、長期^3を持続することを報告している。平均IOPは対照実験の全長に亘って平均化、非ビーズ注射した眼は、ビーズを注入した眼のための40.5±2.8 mmHgの（P <0.001）と比較して、19.7±0.3 mmHgであった。さらに、ピークIOPは49.9±2.3 mmHgのに22.8±0.3 mmHgでから増加。

IOPの上昇が網膜神経節細胞の死につながるかどうかを決定するために、我々は、網膜上のTUNEL染色を行い、横方向視神経切片上組織学（ 図2）。網膜の私たちは、上昇したIOPでビーズを注射した眼でTUNEL染色（ 図2A）の増加を観察した。アポトーシス核の数は、高血圧網膜における24.5±0.5細胞（; P <0.05 図2B）に、反対側のコントロールで1.6±0.5細胞から、約15倍に増加しました。さらに、目にした磁気ビーズを注入したが、圧力を（これは虹彩角膜角の不完全閉塞する可能性が高い）は増加しなかった、TUNEL陽性細胞の数は、未注射のコントロール（P> 0.05）とは有意に異ならなかった。これは、細胞死は、磁気微小球の直接的な毒性によるものではない圧力が増加すると、に関連していたことを示唆している。最後に、緑内障モデルにおける視神経病理を調査し、これらの細胞プロセス（ 図2C）の変性を示し、軸索の多くでトルイジンブルーの蓄積を見た。

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前房への磁気マイクロスフェアの図1.磁気微小球を使用して、眼圧の上昇。注射は反対側のコントロール、非注射の目と比較して、眼圧（IOP）で堅牢な、大幅な上昇を誘導した。 Y軸の単位=水銀柱ミリメートル（mmHg）で。データ=平均±SEM。 * = P <0.001; N = 12この図は、フォクストンらから変更されている、アム。。 J. Pathol 182（4）：1379年から1390年。

神経節細胞層（GCL）中のニューロン死誘導される隅角に磁性ミクロスフェアの注射によるIOPの図2に昇格。 （A）コントロール（左）と緑内障TUNEL（緑によるアポトーシス核について染色（右）目から網膜の代表的な画像。IOPが上昇としてアポトーシス核の数が増加したことを示す白矢印）およびDAPI（青）、（B）GCLにおけるTUNEL陽性細胞の定量は、上昇したIOP（中央）と目を、と比較して有意に多くのアポトーシス細胞を有したことを示しコントロール（左）。対照的に、圧力（右）が上昇しなかったビーズを注入した眼において、TUNEL染色の有意な増加は観察されなかった。データ=平均±SEM。 * = P <0.05。 N = 7から8（C）代表視神経染色の画像、緑内障（右）から損傷を受けた軸索におけるトルイジンブルー蓄積の増加（黒矢印）を実証したが、制御できない眼（左）。。スケールバー=50μmである。この図は、フォクストンらから変更されている。、アム。 J. Pathol 182（4）：1379年から1390年。

ディスカッション

ここでは、眼の前房内に磁気ミクロスフェアを注入することによって、ラットにおいて上昇したIOPを誘導するための方法を実証する。この方法は、実施が簡単で、少し外科専門知識、または練習と洗練の時間を要する。さらに、この手順は有効である。稀圧力に強いロバスト上昇（約10％の再注入率）を誘導するために、ビーズの単回注射よりも多くを必要としない。これは、技術的に困難episceral静脈硬化症¹¹モデル、点字IOPを維持するために、複数の手順を必要とすることができ、レーザー光凝固プロトコル^6、などの既存の誘導可能な方法、オーバー利点を提供することができる。

しかし成功する方法ためには、注意する必要があるいくつかの小さな重要なステップがあります。第一に、それは、虹彩角膜角にビーズを描くように円環状の磁石を使用することが有用である。このステップはwher、オリジナルのプロトコルの変形である電子ビーズを前房内に注入し、その後、目³の周囲にフリーハンドを移動させた。トロイダル磁石を使用したマイクロスフェアは、最小限の手動の再分配を必要とする、角度の周りに均等に落ち着くべきであることを意味します。遅すぎるビーズは主に不完全な被覆、および潜在的に無圧力上昇につながる、角度の一方の側に蓄積される - 第二に、注射の速度が高速である必要があります。一般的に言えばしかし、この方法は、ユーザが容易におそらくIOP上昇の度合いを変更しようとする、そのような微小球粒子のサイズまたは体積を変化させるように、プロトコルに変更を加えることができることを十分に簡単である。

しかし、この方法の一つの潜在的な欠点は1つが、症例の約5~10％で、我々は60 mmHgの上に上昇した観察高血圧の程度をほとんど制御を有することである。 IOPの過度の上昇は、網膜組織にとって非常に破壊的であることができ、メカニズムやバイオを研究すること挑戦的な細胞死のLOGY。しかし、この方法は、薬理学的に¹²に操作することができる網膜および視神経、の両方において、一貫性のある神経病理を生じる。これは、緑内障を治療するための新規治療薬を開発するためのモデルは魅力できる。ビーズが隅角に導かれているのでさらに、これは、網膜や視神経乳頭のライブイメージングのための無料の視線を残します。我々は、このモデルが適合され、マウスを含む他の種における将来の用途のために使用されることを期待している。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
250 - 300gの女性、茶色、ノルウェー、元ブリーダー、ラット、	ハーラン、英国	、203
トノラブ、リバウンド、眼圧計	、チオラット	、TV02
ケタセット(ケタミン)、	フォートドッジ、動物衛生	BN1000118	、37.5 mg/kg
ドミター(塩酸メデトミジン)、	オリオンファーマ	、140-999	0.25 mg/kg
ポビドン、ヨウ素、	エコラボ	BN4369LE10	5% in H2O
Minim's Saline Solution	ボッシュロム	PL00033/5017
トロイダル磁石	スーパーマグネティー	R-10-07-03-N
磁気微小球	Bangs Laboratories	UMC4N/9692
HBSS	Invitrogen	14025
33 G 斜め針	ハミルトン	7747-01	カスタムニードル
ルアーチップシリンジ	ハミルトン	80601
アンチセダン (アチペメゾール塩酸塩)	オリオンファーマ	141-003	0.25 mg/kg
クロラムフェニコール軟膏	メディコム	18956-0005
チューネル染色キット	プロメガ	G3250
トリトン X-100	シグマ-アルドリッチ	T8787
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Vectashield 封入剤	Vector Labs	H-1000