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方法論記事

マクロファージコレステロール枯渇との食作用への影響

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DOI:

10.3791/52432

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2014年12月19日

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Genetics and Microbiology, Stony Brook University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

この記事では、マクロファージをCryptococcus neoformansに感染させるためのプロトコルについて説明します。また、マクロファージからのステロールの枯渇方法についても説明します。これらのプロトコルは、in vitroで真菌感染症を研究し、そのような感染症におけるステロールの役割を調べるためのガイドを提供します。

要約

クリプトコッカス属、クリプトコッカスの病原性真菌によって引き起こされる生命を脅かす感染症である。感染は、肺深部に複製することができる胞子の吸入時に起こる。マクロファージによるクリプトコッカスの食作用は、疾患が致死髄膜脳炎を引き起こす中枢神経系に拡散することができる方法の一つである。したがって、 クリプトコッカスおよびマクロファージとの間の関連の研究では、感染の進行を理解する上で重要である。本研究ではCでマクロファージ感染性を研究するためのステップバイステップのプロトコルについて説明in vitroでのネオフォルマンス 。このプロトコルを使用して、宿主 - 病原体相互作用のホストステロールの役割が検討されている。メチルの異なる濃度 - シクロデキストリン（MCD）は、マウス細網肉腫マクロファージ様細胞株J774A.1からコレステロールを枯渇させるために使用された。コレステロール枯渇を確認し、商業的にご利用でき、両方を用いて定量した電子コレステロール定量キット、薄層クロマトグラフィー。コレステロール枯渇細胞は、リポ多糖（LPS）およびインターフェロンγ（IFNγ）を使用して活性化し、1のエフェクター対標的比での抗体-オプソニンクリプトコックス·ネオフォルマンス 、野生型H99細胞を感染させた：1。感染細胞をC.とのインキュベーションの2時間後にモニターしたネオフォルマンスおよびそれらの食作用指数を算出した。コレステロール枯渇は、食作用指数の有意な減少をもたらした。提示されたプロトコルは、実験室環境での感染過程の開始を模倣し、感染性に対するホスト脂質組成の役割を研究するための便利な方法を提供する。

概要

食作用は、細胞外のエンティティは、宿主細胞によって内在化されるプロセスである。これは、病原体に対して防御する免疫系の武器庫で重要な武器ですが、プロセスは、多くの場合、内在化および体1全体に拡散を可能にするために、病原体によって打倒することもできる。食作用は、宿主細胞の細胞骨格の再編成を経由して添付ファイルや飲み込みにつながるいくつかのシグナル伝達事象によって媒介される。 「プロフェッショナル」食細胞が病原体を巻き込むとファゴソーム2を形成し、添付ファイルや葉状仮足の形成のために知らせるために侵入病原体の表面にオプソニンを認識して結合することができる。いわゆる「プロ」食細胞の中では、マクロファージである。マクロファージは、ほとんどの、探し出しおよび疾患を引き起こす物質を排除し、損傷組織を修復し、炎症を媒介含む保護機能を遂行高度に特殊化した細胞である食作用1,2のプロセスを介してこれらの。

クリプトコックス·ネオフォルマンスクリプトコッカスとして知られている重大な疾患を引き起こす病原性酵母の種である。 クリプトコッカス胞子はホストによって吸入され、通常は無症候性である肺感染症につながるされている。これは、露光が極めて一般的であると考えられている。ブロンクス·レバノン病院センターの小児伝染病から61子どものサンプルクリニックは、非感染し、感染大人3すべての調査対象者は、クリプトコッカス多糖類glucuronoxylomannanと他の研究に対する抗体を持っていたが、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）の両方で有病率を示していることがわかった4。肺胞マクロファージは、肺感染への応答の最初の行であり、ほとんどの場合、成功して病原体をオフにします。しかし、免疫無防備状態の個体（ 例えば、HIVおよびAIDS患者）において酵母は、マクロファージ内で生存することがある。これらの中で例は、マクロファージが病原体の複製のためのニッチとしての役割を果たすことができると、疾患を5致命的になり、中枢神経系（CNS）への普及を容易にすることができる- 8。 11 -それは、マクロファージはあっても「トロイの木馬」モデル3,9を経由して、血液脳関門を通過するために酵母を支援し、髄膜に直接酵母を配信することができると考えられている。したがって、食作用のプ​​ロセス、特にクリプトコッカス感染において、それに影響を与える要因を理解することが重要である。

15 -他の病原体システムでの以前の研究は、食作用12でプレーする重要な役割を持つとコレステロールによって形成されたコレステロールと脂質ラフトを指す。コレステロールは、哺乳動物細胞中で最も豊富な脂質種であり、25を含む-哺乳動物の細胞膜16の50％。これは、BIOPの調節に役割を果たすことが見出されている彼らの剛性17を変更することにより、膜のhysical性質。コレステロールおよびスフィンゴ脂質は一緒に脂質ラフトとして知られている膜内の脂質マイクロドメインを形成する。 18 -脂質ラフトは、カベオラの形成、ならびに16シグナリングの特定の種類の単離されたドメインを提供することに関与することが見出されている。サイズが小さいために、それは、生体内で脂質ラフトを研究することは困難である。脂質ラフトの役割を研究するための1つの有用な方法は、それらの成分を変化させることである。メチルβシクロデキストリン（MβCD）は、哺乳動物の膜からコレステロールを枯渇させることが見出されており、一般的に脂質ラフト18の役割を研究するために使用される化合物である。

このプロトコルでは、宿主細胞膜からのコレステロール枯渇およびCを貪食する宿主細胞の能力に枯渇の影響を定量化する方法を提示in vitroでのネオフォルマンス 。この手順は、細胞培養物を利用するtechniq感染のモデルとしての細胞株（J774A.1）のような不死化マクロファージ上のUE。コレステロール枯渇は、ステロールのサイズに固有の疎水性コアを有し、かつコレステロールは、膜19の外に描画するためのシンクとして作用することができるMβCDに曝露することによって達成された。コレステロール枯渇は、市販のキットを用いて定性的に薄層クロマトグラフィー（TLC）20に続く改変ブライ-ダイアー脂質抽出を用いて定量した。 。23 -食作用は、マクロファージを活性化するためのインターフェロンγとリポ多糖のカクテルと混合したオプソニン化酵母の文化を持つ細胞株を感染させることにより測定したクリプトコッカスは glucuronoxylomannan（GXM）抗体21を使用してオプソニン化した。染色および顕微鏡実験は、食作用の程度を評価する細胞の視覚化および食作用指数の計算を可能にした。総合すると、このプロトコルD生理学的過程で脂質組成の変化を統合基本的な方法はescribes。

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プロトコル

MβCDとJ774A.1細胞の1コレステロール枯渇

  1. 無菌の生物学的安全キャビネット内で、10％ウシ胎児血清（FBS）および1％を補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）200μl中、96ウェル細胞培養プレートにウェルあたり10 5 J774A.1マクロファージ様細胞を播種ペニシリン/ストレプトマイシン（P / S）。 37℃でインキュベートし、5％CO 2 O / N。
  2. 細胞単層から培地を除去し、ろ過またはオートクレーブ処理された1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回細胞を洗浄。
  3. コントロールとして、所望の濃度（10 mM以下PBS中30 mM）のまたは1x PBSでMβCD溶液200μlを加え、振とうしながら37℃で30分間インキュベートする。手順の直後に市販のキットを用いて定量分析をRTで上清と予備を削除します。
  4. 1X PBSまたは無血清DMEMで細胞を2〜3回洗浄しpipettiによる感染または溶解細胞を続行薄層クロマトグラフィーまたはキットを用いた分析のために、脱イオンH 2 Oで2〜3回ngの。
    注：以下はコレステロール枯渇市販のコレステロール定量キットを使用することができる。詳細については、資料のセクションを参照してください。書かれたように、メーカーの指示に従ってください。

薄層クロマトグラフィー（TLC）により、コレステロール含有量の2観測

  1. 石油エーテルの溶液で1回、アセトンで二回TLC槽を洗浄：ジエチルエーテル：酢酸（65：30：1容量）。 （体積で1：65：30）溶液及び/ NがOを残す酢酸：ジエチルエーテル：石油エーテルでタンクを飽和させる。
    注：有機溶媒が常に蒸気の吸入を防ぐために、ヒュームフードの下で使用されるべきである。手袋と白衣を常に着用する。酢酸は強酸であると注意して使用する必要があります。
  2. 無菌のバイオセーフティキャビネットでは、6ウェルCE上ウェル当たり10 6 J774A.1マクロファージ様細胞を播種10％FBSおよび1％P / Sを補充したDMEM暖かいの5mlの容量でllの培養プレート。 37℃、5％CO 2、O ​​/ Nでインキュベートする。
  3. 、1.4より大きな井戸サイズを考慮するために適用可能な200μlのための1ミリリットルを代入する - 手順1.2に従うことによってコレステロールのマクロファージを枯渇。
  4. 、各ウェルにトリプシン-EDTAの500μl加え、37℃で3分間インキュベートし、静かにセルスクレーパーで細胞をこすり。
  5. 微量遠心管に移し、10％FBSおよび1％P / Sを補充したDMEM暖かいの追加の500μlを添加する。
  6. 300×gで5分間細胞をスピンし、上清を除去します。
  7. 細胞ペレットに10％FBSおよび1％P / Sを補足した暖かいDMEMの追加の500μLを加え、ピペッティングにより慎重に懸濁します。
  8. 細胞の10μlのを削除し、血球計数器上で細胞を数える。各試料からの細胞濃度を正規化し、ガラス管に等しい数の細胞を加える。
    注：このステップでは、1月より濃縮された最終的な脂質抽出物を得るために、同一の処置群からの細胞を結合するために選択する。
  9. RTで5分間300×gで遠心細胞および培地を除去します。
  10. メタノールと渦の2ミリリットルを追加します。その後、クロロホルムと渦の1ミリリットルを追加します。単相で確認して溶液を作製した位相状態を確認してください。
    注意：チューブを4℃CO / Nで保存することができる。
  11. RTで10分間1700×gで遠心分離し、上清を新しいチューブに移す
  12. のdH 2 Oの1ミリリットルが続くクロロホルムの追加の1ミリリットルを追加します。 30秒間ボルテックス二回。 RTで5分間1700×gで遠心分離する。
  13. 敏感なバランスにガラス管を秤量し、既知の重量のガラス管に下相を転送するために、ガラスパスツールピペットを使用する。
  14. 乾燥（約2時間）まで、遠心エバポレーターで脂質をドライダウン。乾燥した脂質とチューブを秤量し、乾燥脂質重量を計算する。
    注：ドライ脂質はTLCを実行する準備ができるまで-20℃に保存することができます。
  15. （ - 50μlの通常20）及びシリカTLCプレート上で希釈した脂質の負荷20μlの脂質の濃度を正常化するのに十分なクロロホルム中で乾燥した脂質を希釈する。標準としてクロロホルム20μlの希釈されたコレステロールの負荷20μgの。
  16. 飽和TLCタンクに乾燥したTLCプレートを追加し、プレートエッジの前に1センチメートルまで移行する溶剤が可能。タンクからTLCプレートを取り外し、それは約5分を乾燥させます。
  17. 移行を確認するために、ヨウ素蒸気タンク内に配置することによって、脂質​​を可視化する。取り外し、スポットが約10のためにフェードすることができます - フードの下で15分。
    注：ヨウ素は、吸入の危険性がある。ヒュームフードの下には、必ず使用してください。
  18. 脱イオンH 2 Oの60ミリリットル、硫酸の4ミリリットル、および塩化マンガンの630 mgのメタノール60mlを組み合わせることにより、中性脂質染色のためのソリューションを準備します。
  19. 注意深く、ゆっくりとトレイの中性脂質染色溶液にTLCプレートを浸し、シリカリットルを脱却することなく除去するAyerの。
    NOTE：中性脂質染色溶液を数回再使用することができるので、それは、トレイから取り出すことができ、後で使用するためにボトルに戻した。
  20. すべての気泡が消失するまでプレートを室温でボンネットの下に乾燥することができます。所望の色に160℃、char型に設定したヒートブロック上にTLCプレートを熱し。
    注：このようなビジョンワークスLSとしてデンシプログラムは、脂質サンプルを比較するために炭化したバンドを定量することができる。

C.とマクロファージの3感染ネオフォルマンス （H99）

  1. 無菌の生物学的安全キャビネット内で、DMEM200μl中、96ウェル細胞培養プレートにウェルあたり10 5種マクロファージ様細胞を、10％FBSおよび1％P / Sを補充した。 37℃、5％CO 2、5％CO 2、O ​​/ Nでインキュベートする。
    注：感染は、ガラスで行うことができますが簡単に画像化のための共焦点料理を底。すべての量は同じまま。
  2. C.の文化を育てるネオフォルマンス （H99）打たプレートから得られた1コロニーをYNBの10ミリリットルを接種し、振盪しながら30℃でO / Nそれをインキュベートすることによって。
  3. C.を洗うとカウントネオフォルマンス （H99）細胞。
    1. 遠心機C. 4℃で10分間、1700×gでネオホルマンス O / N培養物。
    2. メディアを取り外し、廃棄します。 1×PBSの5ミリリットルで細胞を洗浄。 4℃で10分間1700×gで遠心し。
    3. PBSを除去し、フィルター1×5mlのPBSで洗浄する。 4℃で10分間1700×gで遠心し。このステップをさらに2回繰り返します。
    4. PBSを除去し、1×PBS 5mlに懸濁します。
    5. 洗浄した文化の500希釈：1を取得するためにPBSで段階希釈を行います。
      1. 1:10希釈を得るために、1×PBSの900μlに元のサンプルを100μlを追加。
      2. 1：100希釈を得るために、1×PBS900μlの1:10希釈した試料を100μlを追加。
      3. 500 diluti：1を得るために、1×PBSの800μlに100希釈した試料：1の200μlのを追加します。上の
    6. 110μlのテイク：500希釈し、細胞数を計算するために血球計数器を頼りにしています。
  4. マクロファージを活性化し、Cをオプソニン化するための作業溶液を準備ネオフォルマンス。
    1. 990μlに10μlのを追加することによって、ストック溶液からのLPSおよびIFNγ100X希釈する。
      NOTE：LPS及びIFNγは貪食取り込みを増強するために使用されているが、食作用のために必要とされない。マクロファージの殺菌活性に関心がある場合は、感染前に振とうしながら37℃で活性化O / Nを行う。
    2. サンプルあたり希釈されたLPSの7.5μL、希釈されたIFNγの1.25μL、GXM抗体の1.25μLとCのボリュームを組み合わせる1.25×10 5個の細胞を与えネオフォルマンス文化 。 10％FBSおよび1％P / Sを補充したDMEMを有するサンプルの数を乗じた250μlの最大容積をもたらす。
    3. 振とうしながら37℃で20分間この溶液をボルテックスし、インキュベートする。
      注意：コレステロール枯渇は、（1.2ステップ - 1.4）オプソニン化工程と同時に行うことができる。オプソニン化細胞が最適にステップ3.4.3のインキュベーション後にはもう20分以上使用されるべきであるように、事前のワーキング溶液を組み合わせることにマクロファージを扱うようにしてくださいませ。
  5. マクロファージに感染する
    1. ウォッシュマクロファージ回無血清DMEMとし、オプソニン化C.200μlのを追加ネオフォルマンスを各ウェルに作業溶液。
    2. 37℃で2時間インキュベートする。
  6. 修正し、ステイン細胞
    1. メディアを取り出し、DMEMで細胞を2回洗浄する。
    2. 空気は、10分間、細胞単層を乾燥させ、細胞を固定し、氷冷メタノールの200μlを添加する。
    3. RTで15分間インキュベートし、残りのメタノールを除去。
    4. 10倍ギムザ200μlを加え、室温で5分間インキュベートする。
    5. オフキャップを脱イオン水とドライO / Nで3回 - 2を洗ってください。
      注：イメージングは​​次の日に行わまたは週のfollowiまで可能NG染色。
  7. 視覚化し、カウント
    1. 顕微鏡を使用して、データポイントあたり300個の細胞をカウントし（同じ治療回数ウェル当たり150の2がある場合）、感染したマクロファージおよび貪食さクリプトコッカス細胞の数の数に注意。
      注：でも、データポイントの利用ごとに条件あたり2プレートをサンプリング確保するために、プレート当たり3の非重複領域を選択して、面積当たり50細胞を数える。
    2. C.の平均数によって、感染マクロファージの割合を乗じることによって食作用指数を計算マクロファージあたりのネオフォルマンス 。 1×PBSの割合がコントロールを扱うように値を発現することにより貪食インデックスを正規化する。いくつかの試験は、食作用指数の傾向を決定するために、平均値および平均値の標準偏差を計算した後。有意性を決定するためにスチューデントt検定を使用する。
    3. 1,000倍または400倍の倍率での細胞の顕微鏡写真を取る。

4.トリパンブルーアッセイ

  1. 無菌の生物学的安全キャビネット内で、10％ウシ胎児血清を補充したダルベッコ最小必須培地（DMEM）5mlを、1％ペニシリン/ストレプトマイシンの容量で6ウェル細胞培養プレートにウェルあたり10 6個のマクロファージ様細胞を播種。 37℃、5％CO 2、O ​​/ Nでインキュベートする。
  2. より大きな井戸サイズを考慮するために適用可能な200μlのための2ミリリットルを代入する1.4 - 手順1.2に従うことによってコレステロールのマクロファージを枯渇。
    注：1×PBSで処理したコントロールだけでなく、以前の任意の治療に削られるコントロールを含めるようにしてください。
  3. 各ウェルに1×PBS500μlのを加え、穏やかにセルスクレーパーで細胞をこすり。微量遠心チューブに移し、軽くピペッティングして細胞を一時停止。
  4. 4％のトリパンブルーの1μlの細胞や汚れの10μlのを削除します。
  5. 血球計数器で細胞をカウントし、以下の式を使用して実行可能性を計算する：％の生存率= [1 - （ブルー細胞/全細胞）]未処理だったコントロールへ×100ノーマライズ値。いくつかの試験では、生存率の傾向を決定するために、平均値と標準偏差を計算した後。有意性を決定するためにスチューデントt検定を使用する。

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結果

コレステロール枯渇

1×PBS対照と比較してアンプレックスレッドコレステロールアッセイキットで、製造業者の指示に従って、プロトコルのステップ1.3で予約された上清の分析は、MβCD処理された試料中のコレステロール濃度の上昇をもたらす。細胞型およびMβCD濃度使用コレステロール枯渇に応じて変化してもよい。 10mMのMβCDで処理J774は、約50％の枯渇が観察された。枯渇は、ステップ1.4で回収した上清および細胞溶解物（ 図1）から得られた値を用いて算出することができる。

TLCを用いて解析し、細胞溶解物は、MβCD（ 図2A）の濃度を増加させることで処理した細胞におけるコレステロールの染色の顕著な減少を示す。 TLCのデンシトメトリー分析は、定量的アッセイ（ 図2B）と同様の傾向を示している。ブライ·ダイアーの方法は、粗製EXTを与えます総脂質のRACT、それがコレステロールの標準を利用して適切なバンドを同定するために、脂質の適...

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ディスカッション

哺乳動物細胞をプレーティングし、C.オプソニン化するとき、このプロトコルでの作業では、正確な細胞数を得ることが重要であるネオフォルマンス細胞 。これは試行間の変動を最小限に抑え、正確な1を確実に：研究を通してエフェクター比に1ターゲットを。これは、手順の間にRTで休んでオプソニン化酵母細胞または処理されたマクロファージ細胞を防ぐために、コレステロール枯渇および感染のタイミングを調整することも重要である。感染を開始する前に、長い待機期間は、抗体オプソニンの損失または枯渇コレステロールの補充につながる可能性があります。実験精度で行われた場合の結論は、食作用におけるコレステロールの役割について識別するためのデータ分析を可能にする。

技術の限界は、コレステロール枯渇は、細胞のようなマクロファージの食作用指数を低下させることによって、特定のメカニズムに関していかなる結論を防ぎ、そしてそれはefのかどうかは不明であるfectが原因コレステロールや、二次メカニズムに直接です。この静脈に沿ってさらに作業は、そのようなFcγ受容体などの食作用において機能することが...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この作品は、NIHの助成金MDPにAI56168、AI71142、AI87541及びAI100631によってサポートされていました。マウリツィオ·デルポエタは、感染症にバロウズウェルカム調査官である。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
クラスIIタイプA2バイオセーフティキャビネットLabconco3460009
J774A.1細胞株ATCCTIB-67冷凍入荷。ATCCの培養方法を参照してください。
ダルベッコS Modified Eagle MediumGibco11995-0654 °Cで37°Cまで暖かい。HI
の胎児のウシの血清のパフォーマンス プラスGibco10082-147-20度で凍結して保つ;DMEM
ニシリン-ストレプトマイシン(10,000 U / ml)Gibco15140-122DMEM
Isotemp細胞培養インキュベーターFisher ScientificModel # 3530
96ウェル培養皿Corning Inc. Costar3595
10x Phosphate Buffered SalineFisher Scientific BioReagentsBP39941倍に希釈し、使用前にろ過またはオートクレーブします。
メチル-β;-シクロデキストリンシグマライフサイエンスC4555-10G1x PBSに溶解して、10 mMおよび30 mMの濃度の溶液を作製
オービタルシェーカーLabline
Amplex Red Cholesterol Assay KitLife Technologies Molecular ProbesA12216コレステロールアッセイ用のすべての試薬はキットに含まれています。製造元の指示に従ってください。
96ウェル ブラックアッセイプレートCorning Inc. Costar3603
FilterMax マイクロプレートリーダーMolecular Devicesモデル F5
TLC チャンバーSigma-AldrichZ126195-1EA
クロロホルムSigma-Aldrich650498-4L
メタノールSigma-Aldrich34860-2L-R
TLC ペーパーWhatman3030917TLCタンクに必要なサイズに縮小
フードAIHA/ANSI規格に準拠した任意のヒュームフード
6ウェルプレートコーニング社 Costar3506
トリプシンEDTAGibco25300-054
セルスクレーパーCorning Inc. Costar3010
血球計算盤Hausser Scientific1490
遠心分離機ベックマン・コールターモデル アレグラ x-30R
Votexミキサーフィッシャー・サイエンティフィック12-812
バランスメトラー・トレドモデル#MS104S meaures 0.1 mg
ガラスパスツールピペットフィッシャーブランド13-678-20A
コレステロールアバンティ 極性脂質700000
SpeedVac濃縮器Thermo ScientificModel # SPD2010
石油エーテルFisher ScientificE139-1
ジエチルエーテルSigma-Aldrich309966
酢酸Sigma-Aldrich320099
TLC Silica Gel 60 with concentrating zoneAnalytical Chromatograhy Millipore1.11845.0001
ヨウ素チップSigma-Aldrich376558-50G
硫酸Sigma-Aldrich320501
塩化マンガンSigma-Aldrich244589
UVP EC3 Imaging SystemUltra-Violet Products Ltd.デンシトメトリー分析にVision Works LSソフトウェアを使用する
ガラス底共焦点皿MatTekP35G-1.5-10Cwww.glassbottomdishes.com
Cryptococcus neoformans (H99)デューク大学医療センターYNB
BD239210準備手順については、メーカーを参照してください。グルコース濃度は20 g / Lを使用してください。
リポ多糖類SigmaL4391-1MG1x PBSに溶解して、1 mg / mlストックを作成します。-20°Cで保管してください。
インターフェロンガンマシグマI4777は、0.1 mg / mlのストック溶液を作るために1x PBSに溶解
クロノキシロマンナン抗体(抗GXM)Arturo Casadevallの研究室からの贈り物 濃度は1.98 mg / ml
です GiemsaMP Biomedicals1945910.8 gのギムサを25 mlのグリセロールに溶解し、60 °Cに加熱します。Cを1時間。溶液に25mlのメタノールを加え、室温で少なくとも1ヶ月間熟成させます。
顕微鏡ZeissObserver.D1 顕微鏡 with AxioCam MRm for taking images
を使用する前にペの供給に使用 ヒュームから入手 をします グル

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