細菌、昆虫細胞およびプラントシステムズ：異なるバイオファクトリーでの組換えタンパク質発現の比較分析

Summary

この研究では、異なる生産プラットフォームにおける標的ヒト組換えタンパク質の発現が比較されました。私たちは、従来の発酵槽ベースの培養物と植物に焦点を当て、各システムのセットアップを説明し、報告された結果に基づいて、各プラットフォームに固有の制限と利点を強調しました。

Abstract

植物ベースのシステムは、高品質の、生理活性製品の柔軟な、低コスト生産のためのそれらの十分に立証された電位の結果として、組換えタンパク質の生産のための貴重なプラットフォームと考えられている。

本研究では、一過性で安定した植物に基づく発現系、伝統的な発酵槽に基づく細胞培養物（細菌および昆虫）で標的のヒト組換えタンパク質の発現を比較した。

各プラットフォームのために、我々は、セットアップ、最適化、製造工程の長さは、最終製品の品質及び収率を記載し、我々は、選択された標的組換えタンパク質に特異的な仮の製造コストを評価した。

全体として、我々の結果は、細菌は、不溶性の封入体中のその蓄積による標的タンパク質の生産に適していないことを示している。一方、植物ベースのシステムは、多目的プラットフォームトンである帽子は、バキュロウイルス/昆虫細胞系よりも低コストで選択されたタンパク質の産生を可能にする。具体的には、安定したトランスジェニック系統は、最終生成物の最高収率及び過渡発現する植物最速プロセス開発を示した。しかしながら、全ての組換えタンパク質は、植物ベースのシステムから利益を得ることができるが、ここで説明したように最高の生産プラットフォームは、ケースバイケースのアプローチを経験的に決定されるべきである。

Introduction

組換えタンパク質は、新興のバイオテクノロジーツールの助けを借りて、異種発現系で商業的に大量生産されています。異種発現システムを選択する際に考慮しなければならない重要な要素には、タンパク質の品質、機能性、プロセス速度、収率、コストなどがあります。

組換えタンパク質の分野では、医薬品の市場が急速に拡大しており、その結果、今日生産されているほとんどのバイオ医薬品は組換えタンパク質です。タンパク質は、細菌、酵母、カビ、哺乳動物、植物、昆虫の細胞培養物、ならびに植物系(安定形質転換または一過性形質転換)およびトランスジェニック動物で発現させることができます。各発現システムには固有の利点と限界があり、各ターゲット組換えタンパク質について、最適な生産システムを慎重に評価する必要があります。

植物ベースのプラットフォームは、安全で費用対効果の高い組換えタンパク質生産のための伝統的な発酵槽ベースのシステムに代わる重要な選択肢として生まれています。下流の処理コストは微生物や哺乳類の細胞に匹敵しますが、工場での商業生産に必要な初期投資が少なくて済むことと、広い面積での栽培によってもたらされる潜在的な規模の経済性が主な利点です。

私たちは、1型自己免疫性糖尿病(T1D)の主要な自己抗原の一つであるヒトグルタミン酸デカルボキシラーゼ(hGAD65)の65kDaアイソフォームの発現のためのバイオリアクターとして植物を評価しました。hGAD65は、疾患の進行を分類および監視するためのマーカーとして広く採用されており、T1D予防におけるその役割は現在臨床試験で調査中です。これらの試験が成功すれば、組換えhGAD65の世界的な需要は劇的に増加するでしょう。

ここでは、補因子PLP(ピリドキサール-5'-リン酸)をアルギニン残基(K396R)1に結合するリジン残基を置換することによって生成される変異体であるhGAD65の酵素的に不活性な対応物であるhGAD65mutの発現に焦点を当てます。

hGAD65mutは免疫原性を保持し、植物や昆虫の細胞では、野生型のhGAD65よりも最大10倍も蓄積します。hGAD65の酵素活性は、自身の合成を抑制するほど植物細胞の代謝を阻害する一方で、酵素的に不活性なhGAD65mutは植物細胞内に高レベルまで蓄積できるという仮説が立てられました。

hGAD65mutの発現については、植物バイオテクノロジーで広く使用されているさまざまな技術の使用がここで探求され、従来の発現プラットフォーム(大腸菌およびバキュロウイルス/昆虫細胞ベース)と比較されました。

この研究では、伝統的な植物ベースのシステムを含むhGAD65mutの発現のために開発された組換えプラットフォームがレビューされ、プロセス速度と収率、および最終製品の品質と機能性に基づいて比較されました。

Protocol

発現ベクターの1の構築

1. 商業的組換えクローニングシステム：
   1. 以前に²に記載^のように、適切なプライマーは、遺伝子の5 '末端にCACCクランプの付加が可能で、標的遺伝子（hGAD65mut）の完全長配列を増幅する。
   2. 1モル比のインサート：ベクター及び1μlの1.5を使用して、6μlの総体積で反応を組み立て（トポイソメラーゼが結合した）エントリーベクターに、方向性クローニングキットの仕様に応じて、ゲル精製した増幅産物をクローン塩溶液（0.2M NaClおよび0.01のMgCl _2）。室温（RT）で5分間インキュベートする。
   3. 化学的にコンピテントに反応全体を変換する大腸菌の細胞は、コロニーPCR ³でコロニーを得、方向クローニングキットの仕様および画面に従って前進M13を使用して、方向クローニングキットに含まリバースプライマー。 POからプラスミドを分離sitiveコロニーのプラスミドDNA調製キットの仕様および順序に従って挿入フォワードM13を使用し、変異³が存在しないことを確実にするためにリバースプライマー。
   4. 特定の宛先ベクターを用いてラムダリコンビナーゼクロナーゼII酵素（LR）により組換え反応を実行するために取得したエントリークローンを使用します。pDEST17細菌細胞における組換えタンパク質発現のために（pDEST17.G65mutが得られる）、（一過性または安定）は、植物にpK7WG2で^{4（Baculo.G65mut}生じる）、線状化ウイルスDNAをバキュロウイルス/昆虫細胞系において、（pK7WG2.G65mut生じる）。エントリーベクター100ngの、デスティネーションベクタの150ngのと10μlの最終容量で酵素ミックスの2μlの、クロナーゼキットの仕様に応じて、反応を組み立てます。室温で1時間のミックスをインキュベートする。
   5. 化学的にコンピテント大腸菌への組換え製品を変換するクロナーゼキット仕様に従って大腸菌細胞 。 PCR ³によりスクリーン得られたコロニーすべての形質転換反応に由来するコロニーのために同じ逆GAD65mut特異的プライマーを用いて、（5'-CACACGCCGGCAGCAGGT-3 '）と、以下の具体的なデスティネーションベクターフォワードプライマー：pDEST17用：5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'; pK7WG2用：5'-AAGATGCCTCTGCCGACAGT-3 ';バキュロ線状化ベクターのために：5'-AAATGATAACCATCTCGC-3 '。
   6. 商業少量調製のDNAキットを用いてプラスミドDNAを単離し、前のステップで説明したのと同じ特定のプライマーの組み合わせを用いて、PCR ³によって、標的配列の存在を確認する。
   7. 以下のステップで説明するように、組換えタンパク質の発現のために選択されたプラットフォームに応じて、異なる標的生物を形質転換するために得られたPCR陽性のプラスミドを使用する。
2. MagnICONシステム^5-7：
   1. 以前に詳細⁷に記載されるようにpICH31070.G65mutを得、3'-モジュールpICH31070中の標的遺伝子をクローニングする。使用してください具体的な反応サイクルを、次の80℃、37℃、50℃、5分で30分間インキュベートし、次いで、5分間。

2.組換えタンパク質発現

1. 細菌の細胞系：
   1. E.にpDEST17.G65mutトランスフォーム大腸菌 BL21（DE3）は、以下の導入遺伝子特異的プライマーを用いたコロニーPCRによってアンピシリン含有（100μg/ ml）を上に成長させ、標準的な技術およびスクリーニングコロニーをLB培地を使用して、エレクトロコンピテント細胞：5'-CTGGTGCCAAGTGGCTCAGA-3 'および5' -CACACGCCGGCAGCAGGT-3 '、58℃のアニーリング温度で20秒の伸長時間である。チューブプラスチックチップで細菌細胞を溶解した後、20μlの総容量でPCR反応を行う。
   2. アンピシリン含有（100μg/ ml）を3mlのLB培地中で37℃で一晩、単一のコロニーを接種する。
   3. 新鮮なLB培地100ml中の100（ampicill含む：細菌培養1に希釈で）0.8の最終OD ₆₀₀まで1-6時間、37℃でインキュベートする。
   4. 1mMの最終濃度でisopropil-β-D-1-tiogalattopiranoside（IPTG）の添加によって、組換えタンパク質の発現を誘導し、激しく37℃で3時間振盪しながら培養物をインキュベートする。
   5. 20分間4000×gでの遠心分離によって細胞を収集し、タンパク質抽出（ステップ3.1.1.1）のための細菌ペレットを使用しています。
2. バキュロウイルス/昆虫細胞系。
   1. シードヨトウガ （Sf9細胞）6ウェルプレートへの細胞（ウェル当たり8×10 ⁵細胞）と非補充したグレース昆虫培地2mlで二回洗浄します。
   2. 中滴下トランスフェクション混合物（5μlのLR組換え反応、6μlのCelfectin液と200μlの非補充したグレース昆虫培地）で取り外し、交換してください。
   3. 5時間、27℃でプレートをインキュベートする。
   4. 取り外して、新鮮なのSf-9 2mlのトランスフェクション混合物を置き換え組換えバキュロウイルスクローンを選択するために、10％ウシ胎児血清、10μg/ mlのゲンタマイシンおよび100μMガンシクロビルを補充00媒体。
   5. 27℃で96時間インキュベートした後、4℃で暗所に細胞と大きな破片とストアを削除するために4000×gで培地（V1ウイルスストック）、遠心分離機を収集します。
   6. シード1×10 10％のウシ胎児血清を含む2.5ミリリットルのSf-900培地中でウェルあたり⁶ Sf9細胞、10μg/ mlのゲンタマイシン及び100μMガンシクロビル、すべてのウェル中にV1のストック100μlの感染する。
   7. 27℃で3日間、細胞をインキュベート。
   8. 4000×gで収集し、遠心分離媒体。
   9. 4℃で上清（V2高力価のストック）を保管してください。
   10. シード1×10 10％のウシ胎児血清を含む2.5ミリリットルのSf-900培地中でウェルあたり⁶ Sf9細胞、10μg/ mlのゲンタマイシン及び100μMガンシクロビル、すべてのウェル中にV2の株式の25μlの感染する。
   11. 27℃で3日間、細胞をインキュベート。
   12. 4000×gで遠心分離により細胞を収集し、タンパク質抽出する（ステップ3.1.2。1）のための昆虫細胞ペレットを使用しています。
3. タバコベンサミアナ一過性発現系：
   1. N.を育てる温度範囲18〜23℃の中で、自然光の下で温室、中benthamiana植物 。アグロ感染のために4-5週齢の植物を使用しています。
   2. 13時間日/ 11時間の夜の光周期で22℃の人工気象室でagroinfected植物を保管してください。
   3. 商業的組換えクローニングシステム：
      1. アグロバクテリウム菌株EHA105エレクトロtumefaciens細胞に以前に^8に記載され^ているようpK7WG2.G65mutを紹介し、2の後、LB培地を含むリファンピシン（50μg/ ml）を、ストレプトマイシン（300μg/ ml）をし、スペクチノ（100μg/ ml）を上に成長したコロニーをスクリーニング以下の導入遺伝子特異的プライマーを用いたコロニーPCR ⁸ 28℃でのインキュベーションの日：5'-CATGGTGGAGCACGACACGCT-3＆＃8217。 5'-CACACGCCGGCAGCAGGT-3 '、58℃、50秒の伸長時間のアニーリング温度を有する。総量20μlでPCR反応を行う。
      2. 28℃で2日間を含むLB培地リファンピシン（50μg/ ml）を、ストレプトマイシン（300μg/ ml）を、およびスペクチノマイシン（100μg/ ml）を30mlの細菌を接種する。
      3. 浸透緩衝液10ml中で20分間再懸濁ペレット（10mMのMES、10のMgCl _2、100μMのアセトシリンゴン、pHは5.6）のために4000×gでの遠心分離によって細菌を収集します。 OD ₆₀₀値を測定した後、同じ緩衝液中に希釈することによって0.9に調整。
         注：3 N.浸潤するために必要な総容量benthamiana植物を30 mlである。
      4. N.におけるアグロバクテリウム懸濁液を浸透させるために2.5ミリリットル無針注射器を使用してくださいアナタバコの葉。慎重にゆっくりと注射器から懸濁液で葉のパネルを注入する。 3拡張したLに潜入工場ごとに庇と三重の3つの植物を使用しています。
         注：健康と安全上の理由から浸透処理中に目の保護具を着用してください。
      5. 2日間アグロ浸潤葉を収集し、感染後（dpi）で、液体窒素中で凍結する。 -80℃で保存の植物組織。
   4. MagnICONシステム：
      1. 5 'モジュール（pICH20111）、3'モジュール（pICH31070.G65mut）、およびインテグラーゼモジュール（pICH14011） - - A.でMagnICONベクトルを紹介標準的な技術を用いてGV3101株ツメファシエンス 。含有するLB培地上で生育したコロニーを、画面を50μg/ mlのリファンピシン及び各ベクターに特異的なプライマーを用いたコロニーPCRにより、適切なベクター特異的抗生物質（pICH20111及びpICH14011、50μg/ mlのカナマイシンpICH31070ためのための50μg/ mlのカルベニシリン）、。
      2. 別途3 A.接種ツメファシエンスを含むLB培地5ml中に株を、50μg/ mlのリファンピシン及び適切なベクター特異的抗生物質そして28℃で一晩振る。
      3. ペレットを一晩細菌の20分間4000×gで遠心分離することによって文化や10mMのMES（pH5.5）に10 mMのMgSO ₄を初期の細菌培養物の二つのボリュームで再懸濁します。
      4. 3ベクターを含む細菌懸濁液を等量混合し、Nの注射器浸潤用サスペンションミックスを使用アナタバコの葉。工場ごとに3つの拡張した葉を潜入。
      5. 4 dpiでアグロ浸潤葉を収集し、液体窒素中で凍結する。
      6. -80℃で保存の植物組織。
4. タバコ安定した発現系：
   1. 成長し、Nのin vitroでの小植物を維持固体植物培養培地にタバクム（VAR Sr1が。）（4.4グラム/ Lムラシゲ·スクーグ- MS -培地ビタミンは30g / Lスクロース、pH5.8の、7グラム/ Lの植物寒天を含む）25の気候室内で制御された条件下で16時間/ 8時間の日/ NIとの°CGHT政権。
   2. Aの前培養を開始しますツメファシエンス EHA105は（100μg/ mlのスペクチノマイシン300μg/ mlのストレプトマイシン、リファンピシンを50μg/ ml）を適切な抗生物質を液体YEB培地5ml中に発現ベクターpK7WG2.G65mutを保有し、オービタルシェーカーセットにおいて28℃で一晩増殖200 rpmで。
   3. 細菌培養されるまで、（100μg/ mlのスペクチノマイシン、300μg/ mlのストレプトマイシン、リファンピシンを50μg/ ml）をYEB培地+抗生物質中で50ミリリットルのアグロバクテリウム培養に接種し、24時間成長する前培養の1ミリリットルを使用してください飽和（OD 0.5〜1.0の₆₀₀値）。
   4. 液体植物培養培地50ml中で20分間再懸濁ペレットのために4000×gでの遠心分離によって細菌を収集します。完全に抗生物質を除去するために二回、この手順を繰り返します。
   5. in vitroでのタバコ植物からの最初の健全な完全に展開された葉を取り、約1cm角にそれらをカット。
   6. 転送葉片深いペトリ皿に細菌懸濁液を含有し、20分間、暗所で残す。
   7. 懸濁液から葉片を取り出し、滅菌ろ紙上で乾燥したブロット。
   8. を1.0μg/ mlの6-ベンジルアミノプリン（BAP）および0.1 / mlのナフタレン酢酸（NAA）を含有する固体の植物培養培地に向軸側と葉片（葉の上面）を配置し、制御されたの気候室で2日間プレートをインキュベート条件（25℃、16時間の日/ 8時間の夜）。
   9. 媒体と接触する背軸面（葉の下面）と（1.0 / mlのBAP、を0.1μg/ mlのNAA、500 / mlのセフォタキシム、100μg/ mlのカナマイシンを含む）固形培地上に転送葉片。
   10. シュート形成を誘導するために16時間/ 8時間昼/夜政権と25℃の人工気象室で2〜3週間のプレートをインキュベートします。サブカルチャー1.0 / mlのBAPを含有する新鮮な固体植物培養培地に葉の外植を転送することにより、2週間毎に、0.1 / mlのNAA、500/ mlのセフォタキシムおよび100μg/ mlカナマイシン。
   11. シュートは500 / mlのセフォタキシムおよび根形成を誘導するために、100μg/ mlのカナマイシンを含む固体培地を含むマゼンタボックスに転送するときに現れる。 1〜2週間、25℃で16時間の日/ 8時間の夜の光周期との苗木をインキュベートする。
   12. ときは根の形、温室内の土壌に植物を移す。
   13. 各工場の葉の部分を収集し、市販のキットを用いてゲノムDNAを単離。
   14. 特定のPCRによる導入遺伝子の存在を検出する。 58℃のアニーリング温度で20秒の伸長時間で、5'-CTGGTGCCAAGTGGCTCAGA-3 'および5'-CACACGCCGGCAGCAGGT-3'：以下の導入遺伝子特異的プライマーを用いるPCR増幅のための鋳型としてのゲノムDNA 30ngのを使う。全量50μl中でPCR反応を行う。
   15. トリス - 酢酸-EDTA（TAE）緩衝液（40mMのTrを1％アガロースゲル上での電気泳動により220 bpの産物を分析する）、20 mMの酢酸、および1mM EDTA。
   16. 標的遺伝子を含むトランスジェニック植物を選択する。
   17. 選択したトランスジェニック植物のそれぞれから葉片を収集し、直ちに液体窒素中で凍結する。
   18. 植物の葉組織（ステップ3.1.3）からの全タンパク質抽出物を調製し、以前にタバコを発現する最良の組換えタンパク質を選択するために²に記載^のようにウェスタンブロット分析により、各試料を試験する。
   19. 他家受粉を防ぐために、開花前に選択した最高のパフォーマンスの植物の袋の花。
   20. ブルーミング果実の成熟と種子乾燥後、袋を集める。
   21. もみ殻から独立した種子や制御された温度（20〜24℃）で乾燥した部屋に保管してください。
   22. 第二世代のトランスジェニック植物を生産し、その後、自家受粉すること最高のパフォーマンスの植物を選択するために乾燥した種をまく。
   23. 次の世代のためのステップ2.4​​.19-2.4.21に記載したのと同じ手順を繰り返します。

3.組換えタンパク質発現解析

1. 総タンパク質抽出：
   1. 細菌細胞：
      1. 1mMのphenylmethanesulfonylfluoride（PMSF）を添加した - （2 mMトリス/塩酸、500mMのNaCl TBS）pH7.4のトリス緩衝食塩水の半分の培養容積中で、ステップ2.1.5で説明したように収集された細菌細胞ペレットを再懸濁する。
      2. 氷上でサンプルを維持しながら超音波処理は、半分の電力で40秒間、細胞ペレットを3回再懸濁した。
      3. 4℃で20分間、14000×gで遠心分離することにより、溶解物を明確にする。
      4. きれいなチューブに上清を移し、-80℃で別々に上清とペレットの両方を格納します。
      5. 激しく室温で一晩振盪することによって6 M尿素を補充したTBS pH8.0の半分の細胞溶解物の体積が、ペレット中に収集された封入体を可溶化する。
      6. 室温で25分間、10,000×gで遠心分離し、きれいに上清を回収しチューブ。
      7. -80℃で上清とペレットの両方に保管してください。
   2. 昆虫細胞：
      1. （ - 137のNaCl、2.7mMのKClを、10ミリモルのNa ₂ HPO _4、1.8mMのKH ₂ PO ₄ PBS）pH7.4のリン酸緩衝生理食塩水1mlを、ステップ2.2.12に記載されているように収集された感染した昆虫細胞ペレットを洗浄する。
      2. 溶解緩衝液200μl中に細胞を再懸濁し（20 mMトリス/ HClでpHを8.0、0.5 MのNaCl、3mMのβメルカプトエタノールおよび1％のTween-20）と氷上で30分間インキュベートする。
      3. 遠心分離を4℃で20分間14000×gで細胞を可溶化した。
      4. -80℃で可溶性画とストアを収集し、ペレットを捨てる。
   3. 植物の葉組織。
      1. グラインドN.アナタバコまたはN.乳鉢と乳棒を用いて液体窒素中で微粉末にタバコ組織 。
      2. 抽出緩衝液300μl（40mMのヘペスpHは7.9、5mMのDTT、1.5％CHAPS）接地100mgの組織を均質化、補遺氷上のプロテアーゼ阻害剤カクテルと解凍の3μlのemented。
         注3：ボリュームをバッファリングする植物組織重量（g）（ml）の間の選択比が1である。
      3. 4°Cで30分間30,000×gで遠心エキス。
      4. -80℃で清潔なチューブやストアに上清を収集します。
2. クマシーゲル染色：
   1. 抽出緩衝液10μlの最終容量に全タンパク質抽出物（ 例えば、植物抽出物、細菌および昆虫抽出物の5μlを2μL）の適切な希釈液を調製し、3Xサンプルバッファー5μlを添加（1.5 Mトリス/ HClのpHは6.8、最終1×濃度3％SDS、15％グリセロール、4％βメルカプトエタノール）。
   2. 10分間沸騰サンプル。
   3. 10％SDS-PAGEでタンパク質を分離する。
   4. 電気泳動後、約2分間、マイクロ波オーブン中クーマシー溶液A（0.05％ブリリアントブルーR-250、25％イソプロパノール、10％酢酸）の存在下で熱ゲル沸点まで、S。
   5. 穏やかに振盪しながら室温にゲルをクールダウン。
   6. クマシー染色液Aを破棄
   7. クーマシー溶液Bの存在下で加熱することにより脱色ゲル（0.05％ブリリアントブルーR-250、25％イソプロパノール）、C（0.002％ブリリアントブルーR-250、10％酢酸）及びD（10％酢酸）毎回染色のために同じプロトコル以下。
   8. 背景が⁹明確であるまで、溶液Dとの最後の加熱工程の後、ゲル脱色を残す。
3. ウエスタンブロット分析。
   1. 電気泳動後、転送は1時間室温でPBS（pH7.4）中の標準的な技術および4％のミルクでブロックを用いてニトロセルロース膜上のタンパク質を分離した。
   2. 10,000 0.1％のTween-20を補充した：4℃でまたは1で標的タンパク質に対するウサギ一次抗体を含むブロッキング溶液中で室温で4時間、一晩ブロットをインキュベートする。
   3. 一次抗体のラベルの後る、0.1％のTween-20を含むブロッキング溶液で膜を5分間ずつ3回洗浄する。
   4. 1で西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）-conjugate抗ウサギ抗体でインキュベートする：10,000 1.5時間。
   5. PBS-Tで5分間、膜を5回ずつ洗浄する（PBS、0.1％のTween-20を補充した）。
   6. 化学発光ペルオキシダーゼ基質を用いたウエスタンブロットを処理する。
4. ラジオイムノアッセイ（RIA）
   1. 12×75mmのポリスチレンチューブに（商業組換えhGAD65の300-2,400 / mlのから）異なる濃度でタンパク質抽出サンプルおよび標準の室温とピペット20μLに到達するための試薬（抗血清、トレーサーとタンパク質Aセファロース）を許可します。
   2. 抗血清の20μl加え、1時30 T1D患者の血漿交換から血清を希釈する準備。
   3. トレーサー（125-I-GAD65）の50μl添加し、室温で2時間インキュベートする。唯一の総活性を推定するためにトレーサーチューブを設定します。
   4. 50μLを追加プロテインAセファロース、室温で1時間インキュベートする。
   5. 30分間4℃で1500×gで各チューブと遠心分離機に冷PBS緩衝液1mlを分配する。
   6. 上清を除去し、静かにチューブをタップして吸い取り紙に残留液を吸収するためのチューブをデカント。
   7. ガンマカウンターで1分間計数することにより、すべてのチューブで免疫沈降した放射能を測定します。
   8. 対数スケールでプロット総活性に関連するキャリブレータの結合率（B / T％）を、標準曲線を確立し、検量線¹⁰からのサンプルのGAD濃度を読み取る。
      注：制限区域は、放射性物質の貯蔵、取扱い及び廃棄のために設計されるべきである。

Results

異なる生産システムにおける標的組換えタンパク質の異種発現のための実験計画は、ここに記載されている。最初の焦点は、各システムにおける標的タンパク質の発現のための最適な条件を確立することによって、異なるプラットフォームをセットアップした。

標的タンパク質、hGAD65mutの発現は、三重E.で誘導された大腸菌の培養物。 37℃での発現の3時間後、細菌細胞を遠心分離により回収し、超音波処理により溶解した。遠心分離工程の後に、可溶性タンパク質は、不溶性の封入体から分離し、最初の分析（データは示さず）hGAD65mutが不溶性の封入体で優勢に蓄積することが実証された。組換えタンパク質の可溶化は、その強力な変性特性のために、hGAD65mutの不可能適切な定量化をする、RIAの分析を妨げる尿素6 M、の使用を必要とした。いくつかの戦略がなけれいる低温¹¹で微生物細胞を増殖からなる、封入体の形成を制限するために報告アン。培養物を15℃および20℃で増殖させ、組換えタンパク質の発現は、同じ温度で誘導した。 図1A

Discussion

細菌細胞、バキュロウイルス/昆虫細胞および植物：本研究では三つの異なるプラットフォームは、組換えヒトタンパ​​ク質の発現を比較した。植物ベースのプラットフォームは、さらに、（かつ安定した- -ベースMagnICONとpK7WG2 すなわち 、一過性の）3広く使用されている発現技術を利用して調査した。この実験で、hGAD65mutのために選択された標的タンパク質は、以前に別のシステム¹³内で発現されており、その生産と機能を容易に検出し^、14測定可能である。

hGAD65mutこのように面倒な可溶化を必要とし、そのネイティブなコンフォメーションを達成するために、リフォールディングも、低温成長条件で、封入体を形成したので、細菌細胞は、効率的な生産プラットフォームではなかった。実際、複雑な組換えタンパク質の発現のために、このプラットフォームの主な障害は、最終製品の右配座である。

ザ·バキュロウイルス/昆虫細胞プラットフォームは、免疫反応性組換えタンパク質の高発現を媒介した...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
酵母エキス	シグマ	Y1333
プトン	Formedium	TRP03
天細菌学グレード	Applichem	A0949
SF-900 II SFM媒体	Gibco	10902-088
Grace'昆虫培地、未添加	Gibco	11595-030
セルフェクチンII試薬	Invitrogen	10362-100
ビタミンを含むMS培地	デュチェファ生化学	M0222
ショ糖	デュチェファ生化学	S0809
植物寒天	デュチェファ生化学	P1001
アンピシリンナトリウム	デュチェファ生化学	A0104	有毒
硫酸ゲンタマイシン	Duchefa Biochemie	G0124	有毒
な Ganciclovir	Invitrogen	I2562-023
カルベニシリン二ナトリウム	Duchefa Biochemie	C0109	有毒
な硫酸カナマイシン	Sigma	K4000	有毒
リファンピシン	Duchefa Biochemie	R0146	有毒 –DMSO
ストレプトマイシン硫酸塩	デュチェファ生化学	S0148
スペクチノマイシン二塩酸塩	デュチェファ生化学	S0188
IPTG(イソプロピル-&ベータ;-D-1-チオガラトピラノシド)	シグマ	I5502	有毒
MES水和物	シグマ	M8250
MgCl<サブ>2	>生化学	436994U
アセトシリンゴン	Sigma	D134406	Toxic – 0.1 M Stock in DMSO
Syringe (1 ml)	Terumo
MgSO4	Fluka	63136
BAP (6-ベンジルアミノプリン)	Σ	B3408	Toxic
NAA (Naphtalene acetic acid)	Duchefa Biochemie	N0903	刺激性
セフォタキシム	マイラン ジェネリック
トリズマ ベース	シグマ	T1503	1 N HCl で pH を調整して Tris-HCl バッファーを作る
HCl	シグマ	H1758	腐食性
NaCl	シグマ	S3014	1 M ストック
KCl	シグマ	P9541
Na2HPO4	シグマ	S7907
KH2PO4	Sigma	P9791
PMSF (フェニルメタンスルホニルフッ化物)		ΣP7626	腐食性、有毒
尿素		ΣU5378
&β;-メルカプトエタノール		Σ M3148	毒物
Tween-20
Hepes	Sigma	H3375
DTT(ジチオスレイトール)	Sigma	D0632	Toxic – 1 M stock, store at -20 >C
CHAPS	Duchefa Biochemie	C1374	有毒
植物プロテアーゼ阻害剤カクテル	Sigma	P9599	/融解しすぎないでください
SDS (ドデシル硫酸ナトリウム)	Sigma	L3771	可燃性、毒性、腐食性 – 10% ストック
グリセロール	Sigma	G5516
ブリリアントブルー R-250	Σ	B7920
イソプロパノール	シグマ	24137	可燃性
酢酸	シグマ	27221	腐食性
抗グルタミン酸デカルボキシラーゼ 65/67	シグマ	G5163	/融解しすぎない
西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)-結合抗ウサギ抗体	シグマ	A6154	/融解しすぎない
Sf9細胞	寿命テクノロジー	11496
BL21 コンピテント E. coli	ニューイングランド バイオラボ	C2530H
プロテイン A セファロース	シグマ	P2545
細胞培養プレート	シグマ	CLS3516
ラジオ免疫アッセイキット	テクノジェネティクス	12650805	放射性物質