次世代シーケンシングによりDNAメチル化解析をターゲット

サマリー

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS)は、標的ゲノムの関心領域におけるシトシンメチル化を定量化する方法です。この方法では、バイサルファイト変換と標的領域のPCR増幅を組み合わせて次世代シーケンシングを行い、塩基特異的レベルでのDNAメチル化の絶対定量を行います。

要約

遺伝子発現の制御におけるエピジェネティックなプロセスの役割は、何年も前から知られています。シトシン残基でのDNAメチル化は、遺伝子発現の長期持続性と動的調節因子の両方であることが実証されているため、エピジェネティックな研究にとって特に興味深いものです。健康と疾患のエピジェネティックな変化を調べる取り組みは、ハイスループットで定量的に正確な方法の欠如によって妨げられてきました。次世代シーケンシング(NGS)技術の出現と普及により、これらのツールは、既存のゲノムおよびトランスクリプトーム方法論に加えて、現在エピゲノミクスにも適用されています。特定の遺伝子プロモーターやCpGアイランドなどの関心領域が特定され、大量のサンプルを高い定量精度で調べる必要があるシトシンメチル化のエピジェネティックな研究のために、バイサルファイトアンプリコンシーケンシング(BSAS)と呼ばれる方法を開発しました。この方法は、バイサルファイト変換と関心領域の標的増幅、トランスポソーム媒介ライブラリ構築、およびベンチトップNGSを組み合わせたものです。BSASは、基本的な分子生物学のスキルを持つほとんどの研究グループが一度に実行できる、最大96サンプルの最大10 kbの標的領域を迅速かつ効率的に分析する方法を提供します。この結果から、塩基特異性を持つシトシンメチル化の絶対定量が得られます。BSASは、あらゆるDNA源のあらゆるゲノム領域に適用することができます。この方法は、目的領域の仮説検定研究や、全ゲノムバイサルファイトシーケンシング、低発現バイサルファイトシーケンシング、メチル化DNA免疫沈降シーケンシングなどのゲノムワイドなメチル化解析で同定された領域の確認に役立ちます。

概要

それは自然にシトシンメチル化¹の形態のDNAの変更を発生するの最初の報告以来、半世紀以上となっている。シトシンのメチル化は、ベースリング上の5 ^番目の炭素にメチル基（5-mCと）は、最も頻繁に、哺乳動物ゲノム中のCpGジヌクレオチドモチーフで生じる有する修飾シトシンヌクレオチド塩基である。不在は、転写活性²に関連している遺伝子のプロモーター中の5-mCとの機能的な存在は、一般に、転写抑制と関連している。

驚異的な進歩が開発^3、エピジェネティックなプロファイル^4、癌の病因^5,6、および他の研究領域の数のtransgeneration伝搬におけるDNAメチル化の役割についての我々の理解がなされている。新しい方法論は、DNAメチル化^7をプロファイリングするために開発されているようにこれらの進歩の多くは、過去数年間で来ている。出現でと次世代シーケンシング（NGS）技術の普及は現在、全ゲノムまたはゲノム⁸の大きな領域全体にDNAメチル化をプロファイリングするための方法がいくつかあります。これらのアプローチは、DNAメチル化パターン及びDNAメチル化の差異を定量発見研究の可能性を開く。これらの仮説生成のアプローチに加えて、標的/仮説テストのDNAメチル化の定量法のための重要な必要性がある。

パイロシーケンシング、メチル化特異的PCR、および重亜硫酸変換したDNAの直接のサンガー配列決定は、対象地域を分析するための最も使用される方法であった（ すなわち 、単一遺伝子のプロモーター領域またはCpGアイランド^）9-12。メチル化シトシンのはそのまま^13,14ままこれらの方法の全ては、亜硫酸水素塩変換、非メチル化シトシンのウラシルのに変換され、化学的脱アミノ化反応に依存している。 bisulfite-のPCR増幅差動メチル化塩基の違いとして読み出すことを可能チミン¹⁵とウラシルの交換で変換されたDNAをもたらす。非常に有用であるが、これらの方法には限界が低い定量的精度、短い読み取り長、および低いサンプルスループットを含む。これらの制限に対処するために我々は^（BSAS）16重亜硫酸リコンシーケンシングと呼ばれるている方法を開発した。この方法の目的は、高い定量性を有する多数のサンプル中の目的の標的ゲノム領域を分析することができることである。

BSASは、既存の方法（重亜硫酸塩変換および領域特異的PCR増幅）の要素を使用して、単純な次世代ライブラリー構築とそれらを組み合わせた（トランスポ媒介^）17及びベンチNGS ^18（ 図1）。このアプローチは、目的の任意の領域におけるシトシンのメチル化を調べるためのより定量的な、高スループット方法を提供する。ここでは、提示詳細方法とトラブルシューティングと品質はBSASプロセスをチェックするためのアプローチを説明します。

プロトコル

組織からの1。核酸単離

注：同じ組織サンプルからDNAおよびRNAの同時分離は、遺伝子発現解析のためのエピジェネティックな分析のためのDNAと対になったRNAを収集する機会を提供する。ここで与えられた例では、実験的組織からのカラム精製の形態であるが、異なるサンプルタイプまたは他の分離方法のための代替的なアプローチを採用することができる。主要な要件は、タンパク質または有機溶媒を汚染することなく、高度に精製された核酸である。

1. 機械的な均質化のため、新鮮凍結または新鮮な組織片を選択し、氷上に置きます。 2.0ミリリットル丸底マイクロ遠心チューブに組織を保存したり転送します。
2. 組織を含む各チューブに1 5ミリメートルのステンレススチール製ビーズを追加します。細胞数または組織重量の製造元の提案に基づいて、溶解緩衝液の適切な量を加える。
3. でビーズミル機械的均質化を用いて組織をホモジナイズ30秒間30ヘルツ。
   注：周波数および機械均質化の持続時間は、組織の種類に依存する。厳しい組織が最適化を設定する必要がながらも柔らかい組織が完全に、推奨設定を使用して均質化します。
4. 製造業者のプロトコルに従って室温でシリカスピンカラムを用いてDNAとRNAの単離を行う。
   1. 氷上のRNaseフリー水と場所50μlの溶出RNA。定量PCRによるmRNAの発現解析のためのRNAを使用してください。
   2. TE緩衝液100μlで溶出DNA。 DNA濃度および収量を増加させるために溶離液を用いたDNAのカラムから繰り返し溶出。目標とメチル化定量化のためにDNAを使用してください。
5. 230ナノメートル、260ナノメートル、280ナノメートル、および320 nmでの吸光度のための標準的な分光光度計を用いて、DNA及びRNAの品質を評価する。
   注：A260 / A280比は、高品質のDNAのための〜1.8から2にする必要があります。 A260 / A280比は、高品質のRNAについて〜2である必要があります。 230 nmのインド語での過剰吸収の存在単離手順からのATE汚染物質。
6. 品質は、製造業者の説明書に従ってキャピラリー電気泳動チップを用いて、さらにRNAをチェックする。
   注：高品質のRNAは、RNAの完全性番号（RIN）> 8を持つことになります。 rRNAのピークに加えて電気泳動で余分なピークの存在は、試料の汚染を示している。
7. 製造業者のプロトコールに従って蛍光アッセイによってDNAおよびRNAを定量化する。
   注：蛍光分析を使用すると、単独の分光光度法より核酸を定量化するための、より高感度で特異的である。
8. ストアは、-80℃でDNAおよびRNAを単離した。

2.ターゲットの同定とプライマー設計

1. 適切な基準ゲノム配列に基づいて、BSASによって分析される対象のゲノム領域（複数可）を決定する。示差的に発現される遺伝子の遺伝子プロモーターがメチル化定量共通の標的である。
2. インシリコ亜硫酸水素コンバートを準備シークエンシングの後の整列のためのED参照ゲノムは、テキストエディタで.fastaシーケンスファイルを変更することによって読み込む。 5'-3 '方向では、チミンの（ 図2）非CpGシトシンに置き換わる。
3. デザインプライマーは、重亜硫酸変換したDNAから関心領域を増幅するように設定します。
   1. 亜硫酸塩特異的PCRプライマー設計プログラム（ 図3）に、5'-3 'の方向で、関心の未変換地域を選択してコピーします。
      注：最適な重亜硫酸塩PCRアンプリコンの長さは、重亜硫酸塩処理DNA断片として、アンプリコン当り250〜400塩基対であり、それは、大きな> 400 bpの領域を増幅することは困難である。例えば、1キロバイトの領域に関心がある場合、複数のプライマー対は、この領域をカバーするように設計することができる。設計のアンプリコンが容易プーリングに等しいbpのサイズのものである。これらはライブラリー生成のためには不十分で長さとすることができるので、アンプリコンの長さ<250bpのは避けてください。 BSASための最適なプライマー長が>プライマーあたり20 bpの。
   2. 55〜65℃と前方および1-2℃のリバースプライマー間の最大_の T _m差の T _mの範囲を選択します。
   3. 最高の関心領域をカバーするプライマーペアを選択します。これはPCR反応に偏りの原因となりますように、CpG部位が含まれているか、CpG部位に直接隣接しているプラ​​イマーを選択しないでください。学術的または商業プロバイダが、任意の数から注文することができ、標準的なPCRプライマーを使用してください。
   4. 100μMの作業ストックでのRNase / DNaseを含まない水で凍結乾燥されたプライマーを再構成する。
4. -20℃で保存PCRプライマー。 PCR反応のための作業ストック、10μMに100μMのプライマーストックを希釈する。

3.重亜硫酸塩特異的PCRの最適化

注：ゲノムDNAの重亜硫酸塩変換のために、亜硫酸水素変換のための異なる市販のキットの数が利用可能です。最善の計画的な実験に適したキットまたはプロトコルを選択します。

1. ゲノムDNA2μgの200 ngの間で使用してください。最適化実験のために、十分な重亜硫酸塩は、複数のBS PCR反応のためのDNAに変換させるために複数の変換反応を実行する。
2. 高いDNA濃度を維持するために、重亜硫酸変換したDNAの小さい（ 例えば 、10μl）を溶出体積を使用してください。
   注：1μgのゲノムDNAを変換入力のために使用した場合、重亜硫酸変換したDNAの1-2μlの最適化PCR反応のために十分である。
3. 重亜硫酸特定のPCRによる重亜硫酸変換したDNAを増幅する。 BS-PCR反応は、重亜硫酸変換したDNAを増幅することができるTaqポリメラーゼを使用して必要とする。
   1. シングルアンプリコンの標的増幅最適化のための以下の反応を組み立てます。複数のサンプルのために、96ウェルPCRプレートで反応を組み立て。
      25μlの2倍反応バッファー
      0.5μlのdNTPミックス
      5μL、10μMフォワードプライマー（最終1μM）
      5μlの10μMリバースプライマー（最終1μM）
      2μlのテンプレート亜硫酸水素は、DNAに変換
      0.4μL（5 U /μL）DNAポリメラーゼ
      12.1μlのDNaseを含まない水（最終反応容量50μL）
   2. 適切な接着剤またはヒートシールフィルムをPCRプレートをシール。
   3. 適切なサーマルサイクラーで反応を置き、加熱蓋付き、以下のサイクル条件を使用します。
      1. 10分間の95℃での初期変性を行います。
      2. 30秒、95℃で変性。
      3. プライマーの特定のT _mで_の 30秒間のアニールは、使用されている。アニーリング温度の最適化反応のためのプライマーのT _mより少ない℃で開始する。
         注：最高アニーリング温度も温度の範囲をテストするために、勾配サーマルサイクラーを用いて決定することができる。
      4. 30秒72℃で拡張子を実行します。長いアンプリコンのための延長時間を長く。
      5. 繰り返します3.3.3.2-3.3.3.4 35サイクルステップ最初の最適化のためのTAL。高いサイクル番号が必要になることがありますが、一般に、反応の成果物を作成し、クローン増幅を防ぐために避けるべきである。
      6. 7分間72℃での最終伸長を実行します。
      7. 4℃で反応を保持する。
   4. PAGE電気泳動によりアンプリコンを可視化する。あるいは、製造業者のプロトコルに従ってキャピラリー電気泳動DNAチップを使用。
      1. 氷と渦上の5倍のローディング色素の6μlのPCR反応の24μlのを混ぜる。
      2. のddH ₂ Oのバッファと800ミリリットルを実行している5倍TBEの200ミリリットルを混合することによってバッファを実行している1×TBEの1 Lを作る最終のddH ₂ Oでウェルあたり0.5 mlの濃度とローディング色素のためのDNAラダーを希釈する。
      3. PCR反応や梯子の30μlの井戸をロードします。
      4. 〜45分間、200Vでゲルを実行します。第1の色素フロントがゲルの終わりに達したときに、ゲルの実行を停止します。
      5. 5μg/ mlのでゲルを染色のddH ₂ Oを100mlの10 mg / mlの5μlを混合することにより、臭化エチジウムゲル全体をカバーし、約5分間インキュベートしましょう​​。
      6. 482 nmの励起波長でのUV光ボックス又は多撮像装置を介して画像ゲル。
      7. はしごを参照すると、サイズのPCRアンプリコンと予想されるアンプリコンサイズ以外の複数のバンド（ 図4AおよびC）を探すことにより、反応の特異性を決定する。
   5. 一度BS-PCRのための最適条件は、実験試料にBS-PCRを行い、決定されている。
      1. 残りのプライマー及び他の反応成分からのアンプリコンを精製する。シリカカラム精製、SPRIビーズ、またはゲルベースの​​クリーンアップと定量化を行います。
      2. 30μlのTEバッファーで溶出アンプリコン。
      3. 製造業者のプロトコルを使用して、蛍光アッセイを使用してアンプリコンを定量化する。
      4. サンプルごとに複数のアンプリコンが存在する場合には、体積当たりの等しい重みでそれらをプール-20℃での金額と店舗。

4. NGSライブラリの準備とライブラリQC

注：BSAS NGSライブラリの準備は、デュアルインデックス作成を簡素化トランスポ媒介プロトコルを使用しています（ライブラリー調製キットの選択の詳細については、物質一覧を参照してください）​​。この方法は、検証され、亜硫酸水素塩配列決定用途^16,19におけるバイアスなしに少しを示してきたライブラリー構築のための非常に迅速で高スループットの経路を提供する。デュアルインデックス作成は、単一のインデックス作成よりもサンプルの高い多重化が可能になります。他のライブラリの準備のスタイルは可能かもしれないが、テストされていません。

1. 96ウェルPCRプレートにBS PCRアンプリコンからNGSライブラリを準備します。最終的な入力1 NGの質量、または0.2 ng /μLで希釈5μlのためのμL/ 0.2 NGにアンプリコンを希釈します。 SPRIビーズを使用して生成されたライブラリのクリーンアップを実行します。 Wライブラリを分離するための50〜90μlのSPRIビーズを使用して、このプロトコル番目。 SPRIビーズの体積は、ライブラリーの標的サイズと所望の配列決定反応のサイクル数に依存する。
   注：ビーズを再懸濁し、マイクロプレートシェーカー又はプレートボルテックスを使用してください。
   1. ビーズからのライブラリを溶出し、新しい96ウェルプレートに移し、-20℃での保存のためのヒートシールフィルムで密封する。
2. ライブラリ（ 図4BおよびD）の大きさや濃度を決定する。
   1. 製造業者のプロトコルに従って、チップのサイズを決定するキャピラリー電気泳動DNA上で実行されたライブラリ。
      1. 検出されたライブラリーピークの平均サイズは、製造業者のプロトコールに従ってモル濃度の推定値を決定するために、高感度キャピラリー電気泳動DNAアッセイを使用する。
   2. 既知濃度の生成されたライブラリーおよび使用基準のアダプター配列に対して設計したプライマーを用いて、定量PCRによってライブラリを定量化する。
      1. ファイル名を指定して実行定量PCRの再製造業者のプロトコルに従って絶対定量の設定を使用して、リアルタイムの機器に対する操作。
      2. 図書館のモル濃度を算出するために定量PCRからのライブラリのサイズとのモル定量を使用してください。
3. pH8.5で0.1％のTween-20を10 mMのトリス-Clを用いて、4 nMのライブラリーを希釈する。 96ウェルPCRプレートに保管ライブラリは、-20℃でヒートシールフィルムで密封した。

ベンチトップシーケンサーを用い5.シングライブラリ

1. 出解凍し、製造元の指示に従って試薬を準備する。
2. 氷上で4 nMのライブラリを解凍する。
3. 1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに0.2 N NaOHを1ミリリットルを加えます。
4. 等体積量のプール4 nMのライブラリは、複数のライブラリがある場合に使用する。
5. 所望の最終モル濃度に、製造業者の指示に従って、プールされたライブラリーを希釈し、変性させる。
   1. 希釈したまま、変性直前まで、氷上でプールされたライブラリは、試薬カートリッジにロードします。
6. サンプルシートサンプル名を含む、対応するインデックス情報を生成し、ファイルのみを.fastq生成することを指定します。
   1. シーケンサー上の対応するサンプルシートフォルダ内の負荷サンプルシート。
7. うまく対応するに試薬カートリッジに600希釈しμL及び変性ライブラリの合計を追加します。
8. 完了までの配列決定反応を実行します。

6.メチル化定量データ解析

注：両方の商用およびオープンソースなど、NGSデータ解析のために利用可能な複数のプログラムがあります。実行中のプログラムの詳細は、各特定のパッケージを見つけることができます。一般的な手順は、このソフトウェアパッケージのための特定のコマンドと一緒に、各ステップで与えられている。 （このプロトコルで使用されるソフトウェアの詳細については、物質一覧を参照してください）​​。

1. 適切なSEにインポート.fastq.gzファイルトリミングの読み取りで使用するために品質スコア（Qscores）を保持解析パイプラインをシーケンシング。 （このプログラム例では「インポート」を選択して読み込み、生成するために使用される配列決定法を選択します。インポートするファイルを読む.fastq.gz選択し、読み込みが「一般の下に「破棄品質スコア」を選択解除して、アプリケーションをトリミング.fastqファイルからQscoresを保持オプション[完了]を ''。読み込み、インポートされ、選択するための場所を選択します」。）
   1. トリムとNGSデータ解析パイプラインで次の設定を使用して、読み取り保持します。 （このプログラムの「NGSコア·ツール」の下に「トリムシーケンス」を選択して、トリミングする読み込みを選択します。）
      1. のみ≥Q30スコアを含む読み込み保持します。 （このプログラムの「品質スコアを使用してトリム」を選択し、0.001に制限を設定します。）
      2. 保持のみ≤1あいまいなヌクレオチドを​​含む読み取ります。 （このプログラムの「トリムあいまいなヌクレオチド」を選択し、設定1.「あいまいさの最大数は、「読み込みトリミング保存する場所を選択し、「完了」を選択します。）
   2. 地図は2.2からインシリコ亜硫酸水素変換遺伝子リファレンスに読み込み、トリミング。 （例えば、ソフトウェアの場合「NGSコアツール」の下にある「地図参考に読み込み」を選択します。トリミングを選択すると、マッピングされ、「次へ」を選択します。変換された参照配列を選択し、「参照マスキング」の下の「マスキング」を選択しないことを読み取ります。選択」次 '。）
      1. のミスマッチ、挿入、および削除のための最高刑を割り当てます。読み取り長の100％が90％の配列同一性をマッピングするために必要とされるようにパラメータを設定する。例えば、ソフトウェアの場合、不整合、挿入、および削除のための3のスコアを割り当てる。参照するようにマッピングされた読み取り長の最小分数のための1のスコアを割り当て、マッピングされた読み取りと参照間の同一性の最小割合のために0.9のスコアを割り当てる。
      3. アライメント出力のための独立したファイルとして、各サンプルを生成する。例えば、ソフトウェアの場合は、選択する「出力オプション」と「結果の取り扱い」の下の「保存」の下の「スタンドアロンの作成マッピングを読んで」。読み取りマッピングを保存し、「完了」を選択するための場所を選択します。
   3. 読み込みマッピングされた上でワークフローを呼び出すバリアントを実行します。例えば、ソフトウェアの場合、「再配列決定分析」の下に「確率的バリアントの検出」を選択し、分析し、「次へ」を選択することが読み取りマッピングを選択します。選択して「フィルタを読む」の下の「非特異的なマッチを無視」と「次」を選択します。
      1. シーケンスはDEPであることを確認1000「意義」の下に「最低限のカバレッジを「設定することにより、≥1000 Xの番目。
      2. バリアントコールが順方向と逆の読み取り中に存在していることを確認してください。例えば、ソフトウェアの場合、選択は「前進の両方で存在を必要とし、スタンドを逆に ''バリアント·フィルター」の下に「次へ」を選択します。
      3. 輸出整列、変異体は、注釈付きのテーブルのようなデータと呼ばれる。例えば、ソフトウェアの場合は、「出力オプション」の下の「注釈付きのテーブルを作成して 'を選択し、バリアントテーブルファイルを保存する場所を選択します。 「完了」を選択します。
2. バリアントテーブルファイルから関心領域内の注釈付きのCpG部位での変異体の頻度を用いて、5-mCとの比率を計算する。 CGにおける基準Cのシトシンの頻度は、5-MCの割合です。
   注：高度にメチル化CpGのためのアルゴリズムを呼び出すバリアントを使用する場合は、チミンとのCpGシトシンを交換してください。これは同定します年度のCpGのシトシン頻度で生じた変異体、などのシトシンのマッピングされた。
3. 最初のCのではない参照（C）中のCpG部位での割合を算出することにより、亜硫酸水素変換効率（BSC）を決定します。総Tのマッピングされた（のT _MP）の数、および総Cの参照Tの（C _MPT）にマッピングすることにより除算することにより、非のCpG Cのの割合を掛けます。 100マイナス計算された周波数は、そのライブラリ（数1）の亜硫酸水素変換効率（BSC）である。



式1重亜硫酸塩変換効率。
注：哺乳類ゲノムは（幹細胞²⁰の潜在的に除いて）非CpGシトシンメチル化の非常に少量を含有しているが、植物ゲノムは、かなりの量を含む。これらのreferencに亜硫酸水素変換効率を測定するために電子ゲノム、適切な経路は、ミトコンドリアゲノムまたは葉緑体ゲノムの一部または植物のゲノム中に存在する既知の非メチル化遺伝子^21の配列^を決定することで、上述したように、変換効率を計算する。重亜硫酸塩変換効率は未変換Cのは、潜在的に非CpGメチル化から生じると、ほとんどの場合、≥98％であるべきである。

結果

BSASは正しく図5のようになり、変換参照配列に整列読み出す。CpGジヌクレオチドを明確に識別することができ、メチル化状態は、マッピングされた読み取りにおけるCpG部位でのベースコールを観察することによって推定することができる。例えば、メチル化コントロールと、0％メチル化は、すべてのTの（ 図5A）を含むCpG部位にマッピングされた読み取りをもたらす。 100％のメチル化コントロールがマップされて読み込まれるすべてのCの（ 図5B）を含むCpG部位に読み込むことになります。

CpG部位のシトシン周波数（C / C + T）の定量は、元の試料中のメチル化頻度をもたらす。全ゲノムメチル化コントロールた（n = 3 /メチル化率）から生成された代表的な標準曲線は、それぞれ、メチル化率（ 図6）で定量におけるメチル化の定量の直線性並びに精度を示している。合計で、この方法の一例として、RNAおよびDNA共イソたマウスの小脳および網膜（n = 4 /群）からlated。選択的に、網膜組織において発現ロドプシン発現は、定量PCRを用いて測定した。発現は、唯一の網膜（ 図7A）で検出された。 BSASを使用して、CpGメチル化のレベルはロドプシンプロモーター領域で定量した。プロモーター領域を横切る累積メチル化レベルは、網膜の<15％に（p <0.001、パラメトリックt検定）（ 図7B）と比較して小脳に> 80％であった。部位特異的メチル化の定量からBSASメチル化定量の利点、及びメチル化レベルは、任意のゲノム領域を横切るCpG特異的に基づいて比較することができる。網膜サンプルた（p <0.001、各々のCpG部位におけるパラメトリックt検定）（ 図7C）と比較した場合、ロドプシンプロモーター渡ってCpGメチル化のレベルは、小脳の試料において有意に高かった。

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図1：BSAS方法の概略は、この方法では、ゲノムDNAを重亜硫酸塩がウラシルに非メチル化シトシンを修飾するために変換される。その後、PCRの間にこれらのウラシルはチミンに変更されます。 PCR増幅は、関心領域に向けられた、高度にだけこれらの配列について富化される。得られたPCRアンプリコンは、単純なtagmentationプロセスを通じてデュアルインデックス化ライブラリに作られています。その後、ライブラリは、ベンチトップ次世代シーケンサー上で配列され、配列決定は、シトシンのは、塩基特異的方法で決定されたのシリコ変換参照配列とパーセントメチル化にマッピングされて読み込みます。

図2：関心領域のシリコ亜硫酸水素塩変換では 、任意のゲノム基準からの関心の任意の領域は、セレクことができますシリコ亜硫酸水素変換におけるためのテッド。非CpGシトシンがチミンの参照配列中に置換されます。のCpGシトシンは重亜硫酸塩変換された参照内のシトシンのまま。

図3：プライマー配置亜硫酸塩PCRプライマーは、 インシリコ亜硫酸変換参照配列におけるに対して設計されている。プライマーは、それらがCGジヌクレオチドを​​重複しないように設計またはCGジヌクレオチドに隣接するように設計されるべきである。

図4：高および低品質のPCRアンプリコンとシーケンシングライブラリーの例代表電気泳動図トレースとゲルショー（A）単一の高とトランスポ媒介ライブラリ生成のための理想的なアンプリコン。濃縮製品。このアンプリコンから生成された（B）ライブラリ（C）低品質のPCRアンプリコンのサイズ、濃度が低くてもよい。高濃度、さらにはサイズ分布を示し、複数の製品および/ ​​またはプライマー二量体を含む。これらの低品質のアンプリコンは、（D）につながる低濃度と低サイズ分布を有するライブラリー生成に失敗しました。

図5：メチル化コントロールからシーケンシング出力の例。 インシリコ （A）は、CpG部位を有する基準シングが赤で強調表示に変換。マップされた0％のメチル化制御はCpG部位でのチミン（貪欲ハイライト）マッピングを示す選択された領域に読み込みます。（B）100％のメチル化制御マッピングされたがCpG部位のシトシンの（青のハイライト）のマッピングを示して読み込みます。

図6：メチル化コントロールの範囲にわたるメチル化定量 0％から100％までのメチル化比率た（n = 3 /比）で混合した全ゲノムメチル化コントロールはBSASを用いて定量した。定量化に対する期待の定量をプロットすると、メチル化制御定量の直線性を示している。すべてのコントロールを越え、高い精度がメチル化定量にあった。

図7：組織サンプルからの対のDNAメチル化および遺伝子発現分析の例。 （A）マウス小脳および網膜組織からロドプシン相対的mRNA発現。（B）小脳および網膜DNA（***はp <0.001、パラメトリックt検定）との間にBSASにより定量化ロドプシン平均プロモーターのメチル化。 <マウスの小脳および網膜DNA中の転写開始部位[TSS]）に対してロドプシンプロモーター（6へ-244、全体で強い> C）のCpG部位特異的メチル化レベル。

ディスカッション

BSASサンプルとターゲットの数の両方数の高スループット能力を有する焦点、正確なDNAメチル化の定量を可能にする。さらに、トランスポ媒介tagmentationを使用して、このライブラリー生成は、より少ないインプットDNAを必要とし、より迅速で、伝統的なせん断およびその後のアダプターライゲーション技術より少ないステップが含まれています。既存の方法に比べてこれらの改善は、任意の目的の標的の正確な基本レベルのDNAメチル化解析を可能にする。また、BSASは全ゲノムバイサルファイト²²またはキャプチャ²³アプローチを用いて同定されている関心領域（差別的メチル化領域（DMRに）、CpGアイランド、調節領域）の確認のための新しい方法を提供する。直交確認のアプローチや、より定量的に正確な方法を使用すると、エピゲノム研究の分析的厳密さを向上させます。 BSASで達成高い読み取り深度再狭い信頼区間で正確な定量を可能にする正確な定量¹⁶にまで一貫した。さらに、単一の実験で多数のサンプルを分析する能力は、統計的検出力を増加させる全ゲノム法の確認のためのサンプルサイズを増加させることができる。現在の多くのエピジェネティック研究の弱さ。重要なことは、BSASはエピジェネティックな研究のための検証可能な仮説の生成を可能にする塩基特異的CpGメチル化の定量を、提供します。特定の応答エレメントでのそのような増加したメチル化のような仮説は、特定の転写因子の結合の減少をもたらすであろう。対のmRNA発現データと結合BSASは、組織または細胞集団の単一片内のエピジェネティックな調節およびmRNA発現の両方を得るための方法を提供する。規制と表現の対の測定値も、調査結果の科学的な厳格さとインパクトを高める。

BSASプロトコル内の重要なステップは、/プライマー設計、アンプリコンの最適化、およびライブラリ生成、QC。プライマーは、適切に設計され、異なる効率⁸で増幅されていない場合、PCRバイアスが導入される。そのような酵素的に生成された100％および0％のシトシンのメチル化の標準としてメチル化規格の使用は、もしあれば、メチル化定量バイアスの、程度を決定するために使用され、メチル化^16を定量化する際に、適切な方法論的な制御であることができる。単一の高品質なアンプリコンを生成するためのPCR反応を最適化する場合も同様に、注意が払われるべきである。何リコンプロトコルで詳述示唆ガイドラインを使用して存在しない場合、最適化ステップが増加PCRサイクル数またはbsDNA入力量を含む。プライマー·ダイマーを含む複数のPCR産物は、存在する場合、最適化ステップは、bsDNA投入量を減少させるPCRプライマーのモル入力濃度を減少させ、アニール温度を増加させる、またはPCRのサイクル数を減少させることが含まれる。これらの最適化の手順のいずれかまたは組み合わせは、単一のHIGを生成するために、十分な結果が得られ時間品質のアンプリコン。また、プライマーを再設計することは、単一のアンプリコンを生じないプライマーセットのための良いアプローチです。再設計が適切なまたは不可能であるこれらの領域については、シトシンのチミンのフォワードプライマーおよびアデニンの中のCpG部位でのグアニンのリバースプライマー中のCpG部位での両方を含む縮重プライマーセットが動作する可能性があります。しかし、これらのプライマーセットは、PCRバイアスは、このプロトコルの範囲外のプロセスを生じていないことを確認するためにさらなる最適化を必要としています。品質ライブラリは、成功のために極めて重要である。 QC対策がシークエンシングの前にライブラリの大きさ、質と量を決定するために行われていることを確認します。配列決定反応は、低品質のライブラリーの入力に失敗しがちである。メチル化の定量におけるバイアスがメチル化頻度が前方の両方に存在し、シークエンシング読み取り逆にすることによって軽減することができる。さらに、CpG部位に合わせて拠点の品質スコアが高いCOのために≥Q30であるべき定量でnfidence。他のものは、上記の測定基準を確保し、重亜硫酸変換したDNA ¹⁹のtagmentation反応におけるバイアスなしに、以前にはほとんど示されているが、低バイアスメチル化定量を確認することができます。

BSASは現在、しかし、この方法の将来の拡張は、亜硫酸水素塩変換²⁴の前にカリウム過ルテニウムを導入するなどの5-MCと5-HMCを区別する実験工程を追加してのCpG 5-HMCの対の測定値を可能にし、CpG部位でのメチル化を測定します。これは、DNAメチル化の遺伝子発現調節の役割を決定するために、対のメチル化を可能にすることにより、5-mCと5-HMC、および発現データの両方をBSASユーティリティの影響を増加させる。 PCRアンプリコンのトランスポ媒介ライブラリ調製物は増幅された領域の端部で低下し、配列決定深度をもたらすない。したがって、高い関心領域は、アンプリコンの中央に存在するように設計されるべきである。どうやってBSASが生成するので、今までに、シークエンシング>は千X、増幅された領域の端部付近の測定は高いまま5-MCの定量的な精度の深さを読み取る。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アジレント 2100 バイオアンライザー	アジレント	G29393AA
アジレント RNA 6000 ナノキット	アジレント	5067-1511
アジレント 高感度 DNAキット	アジレント	5067-4626
台風 9200	アマシャム/GE ヘルスケア ライフサイエンス
アジャンコート アンプレ XP - PCR精製	ベックマン・コールター	A63880	5 ml
PowerPac Basic Power Supply	Bio Rad	164-5050
twin.tech PCR プレート 96	エッペンドルフ	951020362	セミスカート
ヒートシールフィルム	エッペンドルフ	0030127838
ヒートシールホイル	エッペンドルフ	0030127854
ヒートシーラー	エッペンドルフ	5390000.024
0.1-10 μlヒント	エッペンドルフ	0030073.002
2-200 μlヒント	エッペンドルフ	0030073.045
50-1,000 μl ヒント	Eppendorf	0030073.100
MixMate	エッペンドルフ	5353000.014
1.5 ml微量遠心チューブ	エッペンドルフ	0030121.023
遠心分離機5424	エッペンドルフ	5424000.010
2.0 ml微量遠心チューブ	エッペンドルフ	022363352
Nextera XT DNAサンプル調製キット	イルミナ	FC-131-1024	24 rxn
Nextera XT インデックスキット	イルミナ	FC-131-1001	24 インデックス
MiSeq デスクトップシーケンサー	イルミナ
MiSeq Reagent Kit v2	Illumina	MS-102-2002	300 cycles
KAPA SYBR FAST Universal qPCR kit	KAPA Biosystems	KK4824
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit	Life Technologies	P7589
Quant-iT RiboGreen RNA Assay kit	Life Technologies	R11490
ProFlex 96 ウェル PCR システム	Life Technologies	4484075
Novex 6% TBE DNA gel	Life Technologies	EC6261BOX	10-well
Novex TBE Running Buffer	Life Technologies	LC6675	5x (1 L)
Novex Hi-Density TBE Sample Buffer	Life Technologies	LC6678	5x (10 ml)
1 Kb Plus DNA	Ladder Life Technologies	10787-018
Xcell SureLock Mini-Cell	Life Technologies	EI0001
UltraPure 10 mg/ml Ethidium Bromide	Life Technologies	15585-011
7900HT 高速リアルタイム PCR システム	Life Technologies	4329001	384-well block
DynaMag-96 Side Skirted	Life Technologies	12027
SpectroMax M2 マルチモードマイクロプレートリーダー	Molecular Devices/VWR	89429-532
AllPrep DNA/RNA Mini Kit	Qiagen	80204
ステンレススチールビーズ	Qiagen	69989	5 mm
CLC Genomics Workbench	Qiagen		メチル化パイプライン用ソフトウェア
QIAQuick PCR 精製キット	Qiagen	28104	50 rxn
TissueLyser II	Retsch/Qiagen	85300
ヌクレアーゼフリー水		Σ W4502
TRIS 塩酸塩	Σ	PHG0002-100G
Tween-20 Σ		P9416-50ML
NanoDrop 2000	Thermo Scientific
384 ウェル フルスカートプレート、標準	Thermo Scientific	AB-1384
絶対qPCRシール	Thermo Scientific	AB-1170
EZ DNAメチル化-ライトニングキット	Zymo Research	D5030	50 rxn
ZymoTaq DNAポリメラーゼ	Zymo Research	E2001	50 rxn