イメージングローカルCA<sup&gt; 2+</sup&gt;培養哺乳動物細胞内シグナル

サマリー

ここでは、Ca²⁺インジケーターをロードした無傷の哺乳類細胞で蛍光顕微鏡を使用して、局所的なIP₃媒介Ca²⁺イベントをイメージングする技術と、これらのイベントの識別と分析を自動化するアルゴリズムを紹介します。

要約

細胞質ゾルのCa ²⁺イオンは、広範囲の遺伝子転写、電気的興奮性細胞増殖のようなプロセスを制御する、ほ ​​ぼすべての細胞型における細胞活性の多くの側面を調節する。のCa ²⁺シグナル伝達の多様性と特異性は、地元の過渡のCa ²⁺マイクロドメイン分の期間にわたって発生する細胞全体の振動と波に至るまでのCa ²⁺シグナルは、異なる時間と空間スケールの上に行動するために生成されるメカニズムから派生（Ca ²⁺のパフ）持続的なミリ秒。電子の最近の進歩は、CCD（EMCCD）カメラは今> 500フレーム秒^-1（FPS）のレートで128×128ピクセル空間分解能で地元のCa ²⁺シグナルの画像化を可能に掛けた。このアプローチは、高度に並列であり、単一の実験でチャンネルやパフサイトの何百もの同時モニタリングを可能にします。しかし、膨大な量のデータが生成された（ 約 ​​1 GBのPER分）実行不可能なローカルのCa ²⁺のイベントの視覚的な識別と分析をレンダリングします。ここでは説明し、取得、検出のための方法が示され、かつ広視野落射蛍光（WF）と全反射の両方を使用したCa ²⁺指標を搭載し、無傷の哺乳動物細胞内でのCa ²⁺シグナルを媒介₃ローカルIPの分析蛍光（TIRF）顕微鏡。さらに、我々は、これらのローカルのCa ²⁺シグナルの同定および分析を自動化するオープンソースのソフトウェア環境のPythonの中で開発したアルゴリズムを記述します。アルゴリズムは、サブピクセル解像度でのCa ²⁺放出の部位を局在化する。データのユーザーレビューを可能にする。エクセル互換テーブルの振幅および動力学的データと共に蛍光比信号の時間系列を出力する。

概要

カルシウムイオン（Ca ^2+が ）普遍的に遺伝子発現、分泌およびシナプス可塑性¹における長期的な変化を含む、生物学的プロセスの多様な範囲を調節。 Ca ²⁺の^ような多様な方法で行動できるような一つの方法は、Ca ²⁺の異なる空間的·時間的パターンを介して行われ、細胞が生成することができます通知します。細胞質ゾルの例グローバル標高平滑筋組織²のに対し、小さい内の[Ca ^2+]トリガー収縮、ローカライズされた一過性の上昇（ローカルのCa ²⁺のミクロドメイン）の場合は学習と記憶³に不可欠な遺伝子発現を刺激する。

無料のサイトゾルは、の[Ca ^2+]静止時〜100 nmで維持されるが、急速に細胞膜内とすることにより位置のCa ²⁺透過性イオンチャネルを通じて細胞質ゾルへのCa ²⁺の流入、以下のいくつかのマイクロモル濃度に上昇することができます細胞内sからのCa ²⁺の遊離tores。私たちの研究室では、小胞体（ER）膜に存在するのCa ²⁺放出チャネルを形成する、イノシトール1,4,5-三リン酸受容体（IP ₃ R）に焦点を当てています。受容体のサイトを活性化、細胞質ゾルに両方のIP ₃およびCa ²⁺が結合すると、IP ₃ Rチャンネルは、Ca ^2+が ER内腔内に隔離遊離するために開きます。 Ca ²⁺の放出が空間的に（Ca ²⁺のパフ^4）のCa ²⁺のローカルサイトゾルのミクロドメインを生成するために、IP ₃ Rの小さなクラスタに制限されたままであってもよいか、IP ₃ Rの隣のクラスタの近接度に応じて、かもしれないのCa ²⁺誘導性のCa ²⁺ -放出^{（CICR）5,6}のプロセスを介して複数のパフサイトを補充することによって、細胞全体に伝播。

高度な顕微鏡imagiと相まってツィン⁷ロジャーによって開発された蛍光小分子のCa ²⁺指示色素の導入、技術ngを、大幅のCa ²⁺シグナル伝達の我々の理解を促進してきた。顕微鏡検査のために使用されるカメラの最近の進歩は今そのような前例のない空間および時間分解能でパフなどの一時ローカルのCa ²⁺イベントを撮像することができます。現在利用可能なEMCCDカメラは、> 500フレーム秒^-1数（fps）と相補型金属酸化物半導体の新世代で128×128画素の画像化を可能にする（CMOS）カメラは、わずかに高い犠牲にしてより高い画素解像度、さらに速い速度を提供ノイズレベル。全反射（TIRF）顕微鏡法と併せて、画像を参照する単一のCa ²⁺チャネルイベント^8,9可能である。実行不可能な手動処理、視覚的識別および分析をレンダリングし、自動化されたアルゴリズムの開発に責任を置く大規模なデータセット（毎分約 1Gビット）を発生しながら、このアプローチは、同時にチャネル/イベント数百の画像化を可能にする。

ここでは、蛍光灯のCa ²⁺指標を用いて、無傷の哺乳動物細胞でのローカルのCa ²⁺シグナルを画像化するための手順およびプロトコルを提示する。今後は、TIRF、従来の広視野落射蛍光（WF）顕微鏡の両方によって画像化ローカルのCa ²⁺イベントの識別と分析を自動化し、オープンソース環境Pythonで開発したアルゴリズムを実証する。我々はIPのCa ²⁺シグナルをと生成さ₃のコンテキストでこれらのアプローチを説明したが、彼 ​​らはの[Ca ^2+]のCa様々ないずれかの表面に位置²⁺透過性イオンチャネルを発散する細胞質ゾルの局所的な変化を研究するために容易に適している膜または細胞内小器官^8-10。

プロトコル

私たちは、ヒト神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞におけるローカルのCa ²⁺イベントを画像化するための詳細な手順を提示する。これらの手順は、多くの細胞型^8-10画像内Ca ²⁺シグナルに適合させることができる。

細胞の調製

1. 培養細胞は、その供給者のウェブサイトに掲載されている指示に従って撮像される。
2. 画像化の前の数日間は、収穫細胞を1mlの0.25％トリプシン/ EDTA（2-3分）を用いて組織培養フラスコ中で増殖させた。剥離後、トリプシンを不活性化するために培養培地の等量を加える。
3. 皿あたり3-7×10 ⁴細胞の密度でガラスボトムイメージング皿に血球計および種子細胞を用いて細胞カウントを行う。彼らは60％コンフルエンス（2-3日）に達するときイメージング実験のためのセルを選択します。

ソリューションおよび試薬の調製

1. バッファリングされたCa ²⁺含有HEPESを準備（ミリモル）からなる塩溶液（Ca ²⁺の-HBSS）：135のNaCl、5.4のKCl、2のCaCl _2、1のMgCl _2、10 HEPES、および10グルコース。でpH = 7.4 NaOHで室温（RT）にて。 4℃でのグルコースや店舗の添加なしのCa ²⁺ -HBSSを準備します。使用直前に液にグルコースを追加します。
2. 蛍光のCa ²⁺指示薬カル-520（1 mm）で膜透過性のフォームを可溶化、CI-IP _{3（200μM）、}およびEGTA 20％のプルロニックF-127を含むジメチルスルホキシド（100 mM）を（DMSO）。 -20℃で、湿気や遮光エッペンドルフチュー​​ブとストアにこれらの試薬を分注し。

3.読み込んで細胞膜透過性、カル- 520 CI-IP ₃およびEGTA

1. のCa ²⁺ -HBSSに、それぞれ、5および1μMの最終濃度になるように膜透過性カル-520及びCI-IP ₃のストック溶液を希釈することにより、「ローディングバッファー」を準備します。
2. 吸引したCultureメディアとは、Ca ²⁺ -HBSS 3回メディアを交換することによって、細胞をリンス。
3. のCa ²⁺ -HBSSを取り外して、暗闇の中で、室温で60分間ローディングバッファーで細胞を培養する。
4. ローディングバッファーを除去し、Ca ²⁺の-HBSS 3回メディアを交換することによって、細胞をリンス。
   1. 必要であれば、この段階で、その後負荷のCa ²⁺ -HBSSで5μMの最終濃度に原液を希釈することによってEGTA / AMを持つ細胞とは、暗闇の中で、室温で30〜60分間細胞をインキュベート。このインキュベーションの後、3.5のステップに進む前に、Ca ²⁺の-HBSSで細胞を3回すすいでください。
5. ロードされた試薬の脱エステル化を可能にするために30分間のCa ²⁺ -HBSSで細胞を培養する。
6. イメージングの直前に、最終インキュベーション中に風呂に漏れた可能性のある染料を除去するために、「新鮮な」のCa ²⁺ -HBSSでのCa ²⁺ -HBSSを交換してください。

4.のCa ²⁺ 画像取得

1. 100X APO TIRF目標（NA 1.49）上に浸漬油の小滴を置きます。
2. 倒立顕微鏡のステージ上での結像の皿をマウントし、透過光を用いて、焦点に細胞をもたらす。なお、記録時の移動を防止するために、撮像皿を確保することが重要である。
3. 高速EMCCDカメラを使用して発せられる蛍光（λ> 510 nm）をカル-520を励起し、収集するために、488nmレーザーで細胞を照らす。
   注：顕微鏡を操作するソフトウェアパッケージは、ユーザが、レーザビームのいずれか（「WF」励起用）より中央または（TIRF励起用）は、対物背面開口部の極端なエッジで導入されることを可能にする集束レンズを翻訳することができる。
4. EMCCDソフトウェアを使用して、ローカルのCa ²⁺のイベントをキャプチャするために必要な時間分解能でデータを収集するために、完全な512×512画素からの撮像視野を減らす。
   注：たとえば、中央クワッド256×256ピクセルの買収は、66 fpsに取得率を高速化します。さらに、単離されたクロップ·モード機能を使用して500 fpsにEMCCDカメラのフレームレートを増加させることも可能である。
5. 自動的に、ベースラインアクティビティの数秒を記録し、細胞に紫外線フラッシュを提供し、別の10〜30秒の記録を継続してソフトウェアを設定します。
   NOTE：UVフラッシュ、顕微鏡の背面ポートにおける反射ダイクロイックミラーUVを通して導入キセノンアーク光源を用いて送達される。 UVフラッシュの持続時間と強度は、地元のCa ²⁺イベントの所望の周波数を呼び起こすために経験的に調整されている。
6. オフライン分析のための画像スタックなどのファイルに保存する。

5.自動化のCa ²⁺画像解析

注：これは、表示プロセスと多くの商用ソフトウェアパッケージを使用して、キャプチャしたデータを分析することが可能である。しかし、我々は急速に識別ANを自動化するためのアルゴリズムを開発した地元のCa ²⁺シグナルのd分析。このアルゴリズムで使用される空間的および時間的フィルタの詳細な説明は、ΔF/ F ₀と識別/分析ルーチンの発生が¹¹に見出すことができる。このアルゴリズムは、オープンソースソフトウェアプラットフォームのPythonで実行するために開発された、対応する著者（ismith@uci.edu）を電子メールで送信することにより、一緒にサンプル実験データと詳細な取扱説明書を得ることができる。

1. マルチプレーン.TIFFファイル形式にカスタム書かれたアルゴリズムにインポートするファイルを変換します。
2. 解析アルゴリズムを含むフォルダを見つけてダブルRUN.EXEをクリックします。
3. 分析されるべき.TIFFファイルを選択します。
4. [開く]ダイアログボックスの[解析パラメータを選択してください。サンプルデータのデフォルトのパラメータについて、図2Aを参照のこと。
5. nとし、視野の部分にカーソルを移動させるのいずれかによって画像スタックからオフセットされる黒レベルを決定する細胞が含まれている（ 図2Bを参照）、または手動で「セットブラックレベル」プロンプトを使用して黒レベルを入力することにより、OT。
6. ソフトウェアによる分析（ 図2C-F）以下の画面上に4つのウィンドウを観察します。 Cは、分析された細胞からの蛍光を安静時のモノクロ画像である。この画像に重畳白い四角はイベントに備えた2次元ガウス関数の重心位置として決定し、イベントの場所である。
7. 各イベントの場所をクリックするか、イベント間のサイクルにカーソルキーを押してください。そのようにこれらの各サイトでのバックグラウンドを差し引い、ガウシアン平滑化蛍光比の変化（ΔF/ F _0）を実行するとウィンドウDに更新する
   メモ：Redイベントが隣接する部位に局在活動から「ブリードスルー」からその特定のサイトから発信していないと判断された強調した。選択された部位での蛍光シグナルの検出を超えた場合に低い青のトレースを示ししきい値は、黒い線のに対し、（イベントを強調し赤に相当する）、その特定のサイトから発信するイベントを識別します。
8. 赤をクリックしてイベントの時間発展を表示するウィンドウのE、およびイベントの空間プロファイルが一緒にフィットガウス関数の空間プロファイルで、その時間経過にわたって平均化され表示されたウィンドウFを更新するためにイベントを強調した。
9. 手動での成果物は、分析から除外することができるように特定されたイベントを確認します。右の赤いをクリックして、このようなイベントを削除するには、イベントを強調した。
   注：我々の手では、単一のIP ₃ Rチャネルを通じたCa ²⁺フラックスは約0.11ΔF/ F ₀で信号を連想させるので、これは偽陽性である可能性が高いよりも、任意の検出された「イベント」かなり小さい。
10. 目的の細胞の周りに描画し、「保存CellRを選択することで、セルごとに、またはエクスポートデータ」をExcelに保存」を選択してデータをエクスポート17 ;.
    注：データは元の画像スタックと同じフォルダに保存されます。

結果

図1Aはまた、ciは、IP ₃を装填したヒト神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞におけるカル-520蛍光休止のWF画像を示す。フォト·リリースに100ミリ秒のUVフラッシュへのこれらの細胞の曝露は、I-IP _3は、（ 図1Aに白丸で示される）別個の部位での一過性のCa ²⁺パフを誘発した。これらの部 ​​位で測定された蛍光トレースはゆっくりとリリースサイトから拡散したCa ²⁺のような非常に遅い立相（ 図1Bおよび1C）が続くIP ₃ Rの一過性の開口部、のために急速な上昇相を示した。赤は、 図1Bのイベントが選択されたサイトから発信されたのは、アルゴリズムによって決定されたのCa ²⁺シグナルである強調した。非ハイライトのイベントが密接に隣接する部位から拡散するのCa ²⁺シグナルを汚染...

ディスカッション

私たちはここに記述し、蛍光Ca ²⁺の指標を用いて培養された哺乳動物細胞中で地元のCa ²⁺イベントを画像化するためのプロトコル。さらに、我々は、取得したデータの識別および分析を自動化する直感的なユーザーインターフェースでアルゴリズムを記述する。ここで説明する手順は、蛍光Ca ²⁺のインジケーターカル-520が、例えば、Fluo-3、Fluo-4のような他の多くのCa ²⁺感受性色素を利用して、のFluo-8およびオレゴングリーンBAPTA-1は、画像のCaに十分にうまく機能²⁺マイクロドメイン。注意は、これらの指標の高親和性バージョン（〜200〜400 nMでのK _d）は 、画像に局所Ca ²⁺のミクロドメインを使用していることを保証するように注意する必要がなく、これらの指標の最適な負荷条件にするために経験的に決定される必要がある調査中の各細胞タイプ。その性質上²⁺指標は、Caと結合したCa ²⁺ため、Ca ²⁺のバッ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ヒト神経芽腫 SH-SY5Y細胞	ATCC	CRL-2266
Cal-520/AM	AATバイオクエスト	21130
ci-IP3 (D-23-O-イソプロピリデン-6-O-(2-ニトロ-4,5-ジメトキシ)ベンジル-<-em>myo-イノシトール 1,4,5-三リン酸-ヘキサキス(プロピオノキシメチル) エステル	SiChem	cag-iso-2-145-10
DMSO/20% プルロン酸 F127	Invitrogen	P-3000MP
EGTA/AM	Invitrogen	E-1219
35 mmガラス底イメージングディッシュ	MatTek	P35G-1.5-14-C