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方法論記事

と伝達性海綿状脳症種の障壁を評価する

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DOI：

10.3791/52522

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2015年3月10日

 ,  ,  ,  , 
1USGS National Wildlife Health Center, 2Department of Soil Science, University of Wisconsin–Madison, 3Laboratory of Immunology, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, 4Merial Veterinary Scholars Program, School of Veterinary Medicine, University of Wisconsin–Madison, 5Department of Neurology, University of British Columbia

この記事について

サマリー

プリオン病の種間伝播に対する障壁を測定することは困難であり、通常、動物実験や生化学的アッセイを伴います。ここでは、種障壁を予測する能力を持つin vitroプリオンタンパク質変換アッセイを紹介します。

要約

>jove_content<伝染性海綿状脳症(TSE、プリオン病)の種間感染を理解するための研究は、通常、長くて費用のかかるin vivo動物チャレンジ研究に依存しているという点で挑戦的です。プリオン種のバリアの測定を支援するために、多くのin vitroアッセイが開発されており、それにより動物の使用を減らし、動物バイオアッセイよりも迅速な結果を提供しています。ここでは、Conversion Efficiency Ratio(CER)アッセイと呼ばれる迅速なin vitroプリオン変換アッセイのプロトコールを紹介します。このアッセイでは、感染していない宿主脳由来の細胞プリオンタンパク質(PrPC)をpH 7.4と3.5の両方で変性させ、2つの基質を作製します。pH 7.4の基質をTSE剤とインキュベートすると、プロテイナーゼK(PK)耐性状態に変換するPrPCの量は、TSE剤に対する元の宿主の種バリアによって調節されます。対照的に、pH 3.5基質中のPrPCは、TSE剤によって誤って折り畳まれます。2つの基質中のPK耐性プリオンタンパク質の量を比較することで、宿主の種バリアを評価することができます。CERアッセイが実験用マウスの既知のプリオン種障壁を正しく予測することを示し、例として、ボブキャット(Lynx rufus)がオジロジカ(Odocoileus virginianus)の慢性消耗病病原体に感受性がある可能性があることを示唆するいくつかの予備的な結果を示しています。

概要

伝達性海綿状脳症（TSE、プリオン病）は、動物およびヒトの様々な影響を与える長時間のインキュベーション期間が致命的な神経変性疾患の一群である。 TSEの推定上の病原体は、感染、疾患関連したPrP（PrP Cから）の正常な細胞形態のテンプレート駆動変換によって自己増殖可能な宿主プリオンタンパク質（PrP）のミスフォールド異性体から構成されている感染したホスト1の中枢神経系組織内に蓄積フォーム（PrPのTSE）。感染哺乳類のプリオンは、一般的に種間の伝送イベント2を制限する「東証種の壁」の概念に上昇を与えている種特異的な方法、ホスト·ツー·ホストから送信する。プリオン種の壁の生物学的決定要因はよく理解されていない。感染性プリオンTSEとホストのPrP C cとのアミノ酸配列類似性強く変換が行わ3-5かかりますが 、 インビボ 6,7 で観察されたすべてのプリオン伝達事象を説明するには不十分なままであるかどうかに影響を与える。

したがって、TSE種の障壁の特性は、主に動物チャレンジ試験に頼っている：別のプリオンに所定の種からのナイーブ動物を曝露し、伝送効率の指標として、疾患の発症および発病率を生じるインキュベーション時間を測定する。異種の種由来のPrP Cを発現するマウスはまた、試験8のこのタイプのために使用される。トランスジェニックマウスの生産と長引くプリオンバイオアッセイと同様に、動物使用の倫理的配慮に関連するコストは、東証種の壁の実験的調査の障害となっている。 TSEはヒト種の壁の評価は、ヒトPrP Cを発現するように遺伝子操作したマウスに依存しています。これらのマウスは、tに人間のTSEや変更に屈するように長い潜伏期間を必要と彼の迅速な疾患発症9用のヒトPrP C分子 。これらのマウスにおける非ヒトのTSEの潜伏期間は、困難な負の結果の解釈を行う通常のマウスの寿命を越えて延びることができる。非ヒト霊長類は、ヒト種の壁を研究するためのプロキシとして使用されてきたが、これらの研究は、ヒト宿主に進むように、他の動物実験の種類、非ヒト霊長類と同様の課題を正確疾患を再現しない可能性をはらんでいる。

動物のバイオアッセイは、東証への種の感受性を測定するための「ゴールドスタンダード」方式のままであるが、障害物、コストとこれらの生きた動物研究の倫理は、代替案調査を強要している。 PrPのTSEによって播種プロテイナーゼK（PK）耐性状態（PrPの解像度 ）にホストのPrP Cの転換を評価することに基づいて、in vitroアッセイの数は、開発され、TSE種を調査するために使用されているECIES障壁10-12。 インビトロアッセイの例は、無細胞転換アッセイ、タンパク質サイクリック増幅（PMCA）のミスフォールディング、および変換効率率（CER）アッセイ10-14を含む。これらのアッセイのいずれも、自然感染した後、種の壁に関与するアカウント末梢要因を考慮しないが、すべてのTSEのための潜在的に感受性のホストを識別することが有用であり得る。

ここでは、正常な脳ホモジネート由来の2つの変性したPrP C基板をベンチトッププリオン転換反応に使用されるCERアッセイのためのプロトコルは、（ 図1）13 を提示する。 pH7.4で変性した基板中のPrP Cは、種の壁14の非存在下での反応中に播種したPrP TSEによってPrPの解像度に変換することができる。対照的に、pHが3.5で他の基板中のPrP Cの変性は、インキュベーション後のPrP 解像度に変換することができ任意の種からのPrP TSEと、変換のためのコントロールとして機能します。 pH3.5の基板とpH7.4の基板の相対中のPrP resはへのPrP Cの転換の比率は種の壁の尺度を提供する。我々は、CERアッセイは、種々のTSEに実験用マウスの既知の種の壁を予測することが見出されており、慢性消耗病（CWD）にオオツノヒツジ、および他のTSE 14を含む多くの哺乳動物種の種の壁を予測するための努力においてアッセイを使用している15。便利なこの方法論を見つける東証種の壁またはPrP Cから-to-PrPの解像度の変換の評価の迅速なスクリーニングを可能なツールに興味を持って研究者。

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プロトコル

USGS国立野生生物保健センターで行わ動物の作業は実験動物福祉ガイドラインのNIHオフィスに合わせて、制度的動物のケアと使用委員会プロトコル＃のEP080716で行った。狩猟採取した動物からの組織は、ウィスコンシン州、または天然資源のミシガン部門からの贈り物だった。

1.溶液の調製

注：以下に記載されているソリューションは、下記の第2でCERアッセイ基質の製造のために必要とされる。より高濃度のストック溶液からこれらの溶液の各々を準備し;ストック溶液の推奨濃度は、リストされた各それぞれの化学名の後の括弧内に与えられます。使用するまで4℃で基板準備や店舗の際に新鮮なすべてのソリューションを準備します。

  1. 100mMの秒：溶解緩衝液は、10mMトリス、pH7.5の（1 Mトリス、推奨pH7.5のストック溶液）で以下の溶液を調製する憎悪塩化ナトリウム（NaCl、1 Mのストック溶液）、10mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA、500mMのEDTA、pH8.0のストック溶液）、0.5％NP-40（10％ストック溶液）、0.5％デオキシコール酸（DOC、10％ストック溶液）。
  2. 変換バッファは、1リン酸緩衝生理食塩水（PBS、10、pH7.4のストック溶液）、0.05％のドデシル硫酸ナトリウム（SDS、10％のストック溶液）及び0.5％のTriton X-100（10％ストック溶液）の溶液を調製する。
  3. カオトロピックソリューションでは、1×PBS（10倍原液）における塩酸グアニジン（GdnHCl、8 Mストック）の2つの3 M溶液を調製する。濃塩酸（HCl）を用いて、3.5±0.05の解決策の1のpHを調整する。第2の溶液のpHが7.4±0.05のままであり、必要に応じて、濃HClまたは水酸化ナトリウム（NaOH）を用いて調整することを確認する。

2. CERアッセイ基質ペアを準備

  1. 興味の種から健康的、非TSE感染脳組織を入手し、10％の重量あたりのボリュームを準備ダウンス、ビーズミル、又は乳鉢及び乳棒均質化：次のいずれかの方法を使用して、溶解緩衝液中（w / v）のホモジネート。さらに、シリンジおよび針均質に供する基板を吸引し、27 G注射針を介して容易に排出することができるまで増加ゲージの針を使用して得られたホモジネートを絞り込む。
    1. 齧歯類および他の小型哺乳類から調製基板について、脳全体（複数可）を均質化する。大型哺乳類から調製した基板について、OBEX（脳幹）ホモジネートを準備するための組織を使用しています。脳ホモジネートの量を選択する場合、ステップ2.6において、タンパク質沈殿のために使用される遠心分離器の容量の50％以下を準備していない。
    2. 取得された脳組織の品質は疑問がある場合は、SDS-PAGEおよび免疫ブロット16 17基板の前に準備することによってのPrP Cのレベルを評価する。
  2. 独立したラベルプラスチック製コニカルチューブ内の2つの同等のボリュームに脳ホモジネートを分割。 （GdnHClを追加脳ホモジネートへ1体積比：1の各チューブにpHが3.5または7.4のいずれかで1 P​​BS中の3 Mソリューション）。
  3. 2の溶液のpH値を確認してください。濃HClを使用して0.05​​±pHにpHを3.5基質のpHを調整します。他の基板のpHは7.4±0.05のままで確認し、必要に応じて、必要に応じてHClまたはNaOHでpHを調整する。酸または塩基の賢明な添加によってpH値をオーバーシュート避ける。
  4. 5時間室温（RT）で転倒ミキサーで解決策を回転させます。
  5. 各コニカルチューブ内の基板ソリューションへのメタノールの4つのボリュームを追加することによって、タンパク質を沈殿させ、ボルテックスよく混ぜ、そして16〜18時間、-20℃でインキュベートする。
  6. 4℃で30分間、13000×gで遠心分離により堆積物試料。慎重にデカントし、上清を廃棄し、メタノールはペレットから蒸発させる。チューブの内側にしがみついメタノールを吸収を助けるために綿棒アプリケーターを使用してください。オーバー-DRへのペレットを許可しないyおよびメタノールが見えなくされたら、次のステップに進んでいない。
  7. 変換バッファにおけるタンパク質ペレットを再懸濁する。ステップ2.2において、各チューブに分注し、脳ホモジネートの出発材料の量に等しい変換バッファの量を使用する。
    注：これは、pHが3.5と7.4で処理した基板の製剤の両方からのタンパク質ペレットを再懸濁するために使用する変換バッファは、（洗剤の低レベルと生理的pHを含む）上記のステップ1.2で定義されて解決することが重要です。
  8. cuphorn音波処理で簡単に超音波処理基質溶液（30％最大電力〜10秒）、0.5へのアリコート - ラベル1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブ中で1.0mlのボリューム。各基板のアリコートに品質管理イムノブロット（ステップ2.9）を実行します。 CERアッセイ（第4節）を実行する準備ができるまで-80℃で、他のアリコートを保管してください。
  9. 使用前CER基板対（ 図2）上の品質管理を行う。これらのステップは、CER基板が提供します：することを保証する変換の研究で、電子最適な結果を得る。
    1. 二枚の基板中のPrP Cの匹敵する量を確認してください。 SDS-PAGE 16およびイムノ17によって各基板の10-25μlの中のPrPレベルを比較。 pHは7.4と3.5の基質中のタンパク質レベルが互いに約10％以内で​​あれば、基板対はCER研究での使用に適している。
      注：PrPのイムノブロットは、大規模なPrP Cから劣化の証拠を示すべきではありません。 PrPの免疫反応性は、主> 20kDaのである必要があります。この分子量よりも小さいバンドは分解産物であることができる。バンドパターンは、基板対の間でほぼ同等でなければなりません。
    2. 両方の基質中のPrP Cの PK敏感であるべきであるように、100μg/ mlの最終濃度でPKと、各基板10〜25μLを治療し、サーモシェーカーで1時間、37℃で1,000rpmで試料を消化する。 SDS-PAGE 16およびイムノ17で残りのPrPの信号を評価する。PrPのRESを持つ基板は、CERの研究に使用するために適切ではありません。

3.東証エージェントの種子を準備

  1. 興味の種からTSE感染脳組織を入手し、上記のステップ2.1に記載されている方法を使用して、1×PBS pH7.4の中で10％（w / v）のホモジネートを準備します。
    NOTE：種子はまた、中枢神経系外の他のTSE感染組織から製造することができ、しかし、TSE感染末梢組織に由来する種子による脳由来の基質の変換効率はまだ実験的に公開された文献において評価されていない。
  2. 100へのホモジネート（S）結果の分量 - 直前まで、-80℃で0.5 mlマイクロチューブ内の300μlの体積およびストアはCERアッセイを実行する。

4. CERアッセイ

注：CERアッセイは、ある種から（「シード」で提供される）のPrP TSEの比較的少量の添加を含む部分的にpHが3.5または7.4のどちらかで変性された別の種からのPrP C（非感染脳「基板」で提供される）の相対的過剰に。拡張振盪インキュベーション期間の後、各反応中のPrP TSEによるPrP Cからのテンプレート駆動型の変換は、PrPの解像度の残りのPK消化および免疫ブロット検出後の濃度測定信号によって評価される。以前にpHは3.5 対 7.4で変性基質中のPrP RESレベルを比較することは、種の壁の尺度を提供する。このアッセイ法の実験の概要を図1に提供される。

  1. ゆっくりと非感染CER基板のペア（アッセイは、以前にpHが3.5と7.4の両方で変性基質の等容量を必要とする）と氷のベッド（約1時間の解凍時間）の上にそれらを配置することによってTSE感染シード·ソリューションを解凍。
  2. 完全に解凍されると、吸引した後、各貫通基質溶液を追い出す27 Gの注射針を数回に再均質化する。簡単に説明すると約30％最大パワーで10秒間各TSE感染シードソリューションを超音波処理。変換反応の準備中に氷の上にすべてのソリューションを保管してください。
  3. ラベルTSEエージェントあたり5個々の低結合、薄壁PCRチューブがテストされている。
  4. pHは7.4で調製（a）はCER基板およびpH 3.5で調製（b）はCER基板の95μlに10％のTSE感染シード溶液5μlを添加することにより、これらのチューブ内変換反応を準備します。
    1. 各実験サンプルについては、以前にpHは3.5と7.4の両方で変性CER基板対における平行反応を準備します。
    2. 経験的決定を通じて感染していない脳の基板へのTSE因子の種の比率を最適化します。共通シード：採用基板比は100μlの総反応容量を維持し、1：99μL、2：98μLと5:95μlのがあります。ほとんどのアプリケーションでは、5：95μlのシード基板の体積比が適当であると目に提示されるものであるプロトコルである。
  5. 次のようにTSE因子ごとに3つのコントロールサンプルがテストされているの準備：（a）の入力のPrP RESのコントロールとして95μlの変換バッファに10％のTSE感染シード溶液5μlを追加します。非特異的、非テンプレートの変換のための対照として（b）のpHは3.5、及び（c）は、pH 7.4で調製95μlの基質を5μlの変換バッファを追加する。
  6. 簡単に言えばよく、種と基板を混合するためにその閉じたPCRチューブに各サンプルをボルテックス。 PCRチューブの蓋の中に閉じ込め、反応混合物の任意のボリュームを削除するには、低速ベンチトップミニ遠心機で瞬間的なパルスで従ってください。
  7. PCRチューブを受け入れるために装備ベンチトップサーモシェーカーに個別に標識PCRチューブで負荷サンプル。 24時間、37℃で1000rpmでサンプルを振る。
  8. 以下（w / v）のおよびPKを、100μg/ mlの最終濃度2％の最終濃度までサルコシルを追加し、振盪。ダイジェストサンプルサーモシェーカーで1時間、37℃で1,000rpmで少なくとも。
    NOTE：PrP CからのPK消化のサンプル変換後のエイズへのサルコシルを添加する。播種していないサンプル（ステップ4.5）において偽陽性シグナルは事実上サルコシルを添加することによって除去される。
  9. 5分間95℃にSDS-PAGE試料緩衝液、熱のサンプルを追加して、17をイムノブロッティング、続いてSDS-PAGE 16により各サンプルの残りのPrP resとを解決する。
    注：前のイムノブロッティングサンプルバッファーの添加と加熱後、サンプルをすぐに処理してもよいし、サンプルは-20℃で保存するか、または-80℃である。ここに提示されたすべてのデータは、ノベックスNuPAGEゲル及び転送システムを使用して生成された。 CERアッセイからの個々のサンプルがサンプル·バッファと、製造者の指示に従って還元剤で処理した。サンプルは、その後95℃で5分間加熱し、各サンプルの30μlを、12％ビス - トリスプレキャストゲルにロードした。
  10. 対策として、変換効率比（CER）を計算種の壁の。デンシトメ17によるPrPのRESの測定レベルと、pHが3.5試料のそれによってpHが7.4の試料の総密度を分割。パーセントを生産する100で掛けます。
  11. 与えられたTSE因子を有する種の平均CER±標準偏差を生成するために、独立した実験の反復からのデータをコンパイルします。

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結果

CERアッセイの使用の成功は、変換反応に使用される基板のペアの品質に大きく依存する。この理由のために、CER基板対を調製する手順に従い、品質管理イムノブロット（ 図2）を実行すべきである。両基板の場合、アッセイ免疫ブロット法によって10〜25μL。 PrP Cからは、各基板において容易に検出可能であるべきとのPrP Cレベルは、2つの間でほぼ同じでなければなりません。免疫反応は、20kDaの上記主に表示されますが、小さいバンドも明らかである。我々の経験では、より小さなバンドの存在は、種に依存します。低分子量の生成物が認められた場合に、それらの存在は両方の基質ペアで確認すべきである。

それは、そのCER基板はPKで基板を処理することにより（ 図2）内因性プリオンRESから自由であることを確認することが重要です。 PrPの解像度が存在する場合、動物がでsubstに使用レートの調製は、TSE感染または無症状感染...

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ディスカッション

このプロトコルが正常に完了するために、注意が基板準備（ステップ2.1.2）と、変換反応（ステップ4.4.2）用の比率を基板へのシードに使用する非感染脳組織中のPrP Cレベルに支払われるべきである。我々の経験では、脳は、限りのPrP Cは、免疫ブロット法（ 図4）によって存在するように、かなりの期間、死後後CER基板として使用するために抽出することができる。実際には、いくつかの自己消化は、CER研究のために使用ボブキャットの脳で観察された。それにもかかわらず、これらの脳から誘導された基質のインキュベーションは、依然としてのPrP resは形成された。我々は、部分的には、CERアッセイのロバスト性は、多くのプロテアーゼを不活性化する、1.5M GdnHClでCER基質の変性に由来する、と推測している。

比率を基材へのシードは、免疫ブロット法により許容さPrPのRES信号を得ることが経験的に決定する必要があるかもしれない。あまりまたはL基質比：ittleのPrP <...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

組織取得の支援について、John Olsen氏(ウィスコンシン州天然資源局)、Tom Cooley氏、Daniel O'Brien氏、Steve Schmitt氏(ミシガン州天然資源局)、Daniel Walsh博士(USGS国立野生生物保健センター)に感謝します。また、診断検査サービスを提供してくださったウィスコンシン州立衛生研究所、機器の使用について、トニー・ロック博士と彼女のスタッフ(USGS国立野生生物保健センター)にも感謝します。商号、製品名、または会社名の使用は、説明のみを目的としており、米国政府による承認を意味するものではありません。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
12% Bis-Tris SDS-PAGEゲルLife TechnologiesNP0342
0.5 mm 酸化ジルコニウムビーズNext AdvanceZROB05他の種類のビーズも効果的です
抗体様々なサプライヤー目的の種からのPrPresのイムノブロット検出に適した一次抗体と二次抗体を選択します
ビーズホモジナイザー ビーズホモジナイザー次へ前進 BBY24M
遠心分離機ベックマン・コールター369434温度制御付き高速
円錐管任意のブランド
綿先端アプリケーターUlineS-18991
カップホーン ソニケーターヒートシステム-超音波W-380ヒートシステム-超音波 - 超音波株式会社は、Qsonica, LLC
デンシトメトリーになりましたソフトウェアプログラムUVPVision Works LS 画像取得および分析ソフトウェアNIH ImageJなどの他のプログラムも機能します
ドンスホモジナイザーキンブルチェイス885300
エンドオーバーエンドミキサーLabnet InternationalH5600
エチレンジアミンテトラ酢酸ボストンバイオプロダクツP-770有害化学物質:眼の刺激
グアニジン塩酸塩、8 Mサーモフィッシャーサイエンティフィック24115有害化学物質:急性毒性、皮膚刺激性、眼刺激性
加熱ブロックフィッシャーサイエンティフィック11-718
塩酸シグマ-アルドリッチ435570有害化学物質:強酸
ドデシル硫酸リチウムサンプルバッファー、4xLife TechnologiesNP0008有害化学物質:皮膚&呼吸器刺激、深刻な眼の損傷、可燃性固体
ノールフィッシャーサイエンティフィックA454-4危険な化学物質:急性毒性、可燃性液体
微量遠心チューブ任意のブランド
遠心分離機LabnetインターナショナルC1301N
-ラウロイル-サルコシン(サルコシル)Sigma-Aldrich L-5125有害化学物質:急性毒性、皮膚刺激性、眼障害
Nonidet P-40AmrescoM158有害化学物質:皮膚刺激性、眼障害
SDS-PAGEゲルシステムライフテクノロジーNuPAGE電気泳動システムその他のSDS-PAGEシステムもPCR
チューブ(低結合)AxygenPCR-02-L-C
乳棒ホモジナイザーフィッシャーサイエンティフィック03-392-106
pHメーターSentronSI600
ポリフッ化ビニル膜ポアIPVH00010
プロテイナーゼKプロメガV3021危険な化学物質:皮膚と目の刺激、呼吸器感作、臓器毒性
SDS-PAGEサンプルの還元剤、10xLife TechnologiesNP0009
塩化ナトリウムフィッシャーサイエンティフィック7647-14-5
デオキシコール酸ナトリウムシグマ・アルドリッチ D6750有害化学物質:急性毒性
ドデシル硫酸ナトリウムサーモフィッシャーサイエンティフィック28364有害化学物質:急性毒性、皮膚刺激、眼障害、可燃性固体
水酸化ナトリウムSigma-AldrichS5881有害化学物質、強塩基
シリンジBD バイオサイエンス各種均質化する基質の体積に適したシリンジサイズを使用
シリンジ針Biosciencesの様々な
サーモシェーカー(PCRチューブシェーカー)杭州すべてのShengインスツルメンツMS-100
トリスベースバイオベーシック77-86-1化学物質:皮膚、目、呼吸器への刺激トリ
トンX-100ラケミカルカンパニーT756.30.30化学物質:急性毒性、眼の刺激
ボルテクサーフィッシャーサイエンティフィック12-812
メタミニズ ミリBD 危険なインテグ危険な

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