方法論記事

マウスにおける安定な高レベルの骨髄キメラ現象を生成するための骨髄抑制剤としてブスルファン

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DOI：

10.3791/52553

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2015年4月1日

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1Department of Biomedical Physiology and Kinesiology, Simon Fraser University, 2The Biomedical Research Centre, University of British Columbia, 3Division of Neurology, Department of Medicine, Neuromuscular Disease Unit, VHHSC

この記事について

サマリー

私たちは、ブスルファン条件付けにより、レシピエントマウスの骨髄を、照射がない場合に緑色蛍光タンパク質を遍在的に発現するドナーマウスの骨髄細胞に置き換えることを可能にするプロトコルを記述します。この手法は、中枢神経系における骨髄細胞の蓄積を研究するのに役立ちます。

要約

骨髄移植(BMT)は、レシピエントマウスの骨髄(BM)コンパートメントを、ドナーマウスから分離された明確なバイオマーカーを発現するBM細胞に置き換えるためによく使用されます。この技術により、レシピエントマウス内のドナー由来造血細胞の同定が可能になり、さまざまな生化学的手法を使用してドナー細胞を単離および特性評価するために使用できます。BMTは通常、全身照射による骨髄破壊的条件付けに依存して、ドナー細胞の生着のためにレシピエントマウスのBMコンパートメント内にニッチスペースを生成します。ここで説明するプロトコルは、化学療法剤ブスルファンによる骨髄抑制コンディショニングを使用します。専門施設の使用を必要とする照射とは異なり、ブスルファンコンディショニングは、総用量60〜100mg / kgが投与されるまで、20 mg / kgのブスルファンの腹腔内注射を使用して行われます。さらに、骨髄破壊的照射は毒性の副作用を引き起こす可能性があり、レシピエントマウスの生存のためにはドナー細胞の生着を成功させる必要があります。対照的に、これらの用量を使用したブスルファンコンディショニングは一般的に忍容性が高く、マウスはドナー細胞のサポートなしで生存します。ドナーBM細胞は、緑色蛍光タンパク質(GFP)を遍在的に発現するマウスの大腿骨および脛骨から単離され、条件付けレシピエントマウスの側尾静脈に注入されます。BMキメラは、BMT後の末梢血中のGFP+細胞の数を定量化することによって推定されます。キメラのレベル >80%は、通常、移植後3〜4週間で末梢血で観察され、少なくとも1年間確立されたままになります。照射と同様に、ブスルファンとBMTによるコンディショニングにより、中枢神経系(CNS)内、特に神経変性のマウスモデルにおいて、ドナーBM由来細胞の蓄積が可能になります。このブスルファンを介したCNS蓄積は、ブスルファン治療は毒性が低く、CNS炎症がそれほど広範ではないように見えるため、全身照射よりも生理学的である可能性があります。これらの細胞は、治療薬をCNSに送達するために遺伝子操作できるという仮説を立てています。

概要

最近、中枢神経系(CNS)におけるミクログリアと骨髄(BM)由来細胞(BMDC)の役割について、病気の時も正常な老化時も、かなりの関心が寄せられています。中枢神経系の常在免疫細胞であるミクログリアは、胚形成中に原始的な骨髄系前駆細胞が侵入した後、中枢神経系で発生することが現在知られています1。ミクログリアは、その骨髄単球系譜の側面を成体まで保持しています。健康な成体動物では、BMDCのミクログリアプールへの寄与が最小限であることが示唆されていますが1、さまざまな神経変性疾患の進行においてBMDCが果たす役割は不明のままです。この不確実性は、普遍的に受け入れられている識別免疫組織化学的マーカーが同定されていないため、CNS内に蓄積するBMDCを内因性常在性ミクログリアと区別することが困難であるという事実によってさらに悪化します。in vivoでBMDCをモニターするために、レシピエントマウスの内因性BM細胞を、βアクチンプロモーターの制御下で遍在的に緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現するドナーマウスのBM細胞に置き換えるBMT移植(BMT)プロトコルを採用しています。このプロトコルは、免疫組織化学を用いてレシピエントマウス内のGFP+ BMDCの局在と形態の両方を決定することを可能にし、蛍光活性化セルソーティング(FACS)とそれに続く生化学的アッセイを用いてこれらの細胞のさらなる特性評価を容易にします。

成功したBMTのためには、レシピエントBM細胞をアブレーション(骨髄アブレーションと呼ばれる)して、レシピエントBM内にドナー細胞の生着を可能にするニッチスペースを生成する必要があります。多くの場合、骨髄切除術は、特に造血前駆細胞2,3などの活発に分裂する細胞において、DNAの二本鎖切断を誘発する全身ガンマ線照射を使用して達成されます。照射プロトコルは、レシピエント動物がBMTから適切なドナー細胞生着を達成しない場合(いわゆる「致死的照射」)に動物が致死するほど、十分なBM細胞死を誘発するために行われます。しかし、放射線照射には専門的な施設や設備が必要であり、また、どの機関の研究者も利用できない獣医学や畜産のリソースが必要です。さらに、骨髄破壊的照射は他の組織に致命的な損傷を引き起こす可能性があり、免疫抑制により、照射された動物は二次感染に対してより感受性が高くなる3。そのため、特に子供や高齢者などのリスクのある集団で使用するために、患者のコンディショニングプロトコルの潜在的に有毒な副作用を最小限に抑えることを目的とした、強度の低いコンディショニング(いわゆる「RIC」プロトコル)レジメンが開発されました4。

一部のRICプロトコルは、BMコンパートメントを調整するためにbusulfanのような化学療法に依存しています。ブスルファンは、放射線照射の代替として臨床的によく使用される二官能性DNAアルキル化剤です5,6。特に、ブスルファンは腹腔内(IP)注射によってマウスに安全に投与することができ、マウスへの照射に必要な特別な施設や機器を必要としません。Busulfanコンディショニングは、私たちの研究室7だけでなく、他のいくつかの最近の出版物でも広く使用されています8–11。60-100 mg/kgの用量を使用すると、末梢血およびBM7に高度の安定キメラ(>80%GFP+細胞)を確立することができる。重要なことに、これらの用量では骨髄切除は完全ではなく、そのためマウスは支持BM細胞を受けずに生存することができます(K.ピーク、J.マニング、C.ルイス、およびC.クリーガー、未発表の観察)。さらに、骨髄抑制性ブスルファンコンディショニングにより、ドナー細胞による末梢血骨髄単球細胞の迅速な再構成が起こります。しかし、末梢血リンパ球のドナー細胞による置換は遅く、全身照射と比較して60〜100 mg / kgのブスルファン投与で発生する免疫抑制の欠如が強調されています7。

私たちは、野生型マウスのBMDCを調査するために、また神経変性疾患である筋萎縮性側索硬化症(ALS)7およびアルツハイマー病のマウスモデルにおいて、ブスルファン誘発性キメラ現象を成功裏に使用しました。特定の条件下では、かなりの数のGFP+ BMDCがCNS内に蓄積することが観察されています7,12。重要なことは、放射線照射による骨髄破壊的コンディショニングと同様に、ブスルファンコンディショニングとそれに続くBMTは、野生型マウスと神経障害のあるマウスの両方において、CNS内のGFP+ BMDC蓄積を可能にするのに十分である7-11。神経変性疾患の治療における主要な障害は、治療分子を循環からCNSに取り込み、有益な効果を発揮できるようにする能力であるため、BMDCが治療分子を発現するように操作され、その後、ブスルファンに条件付けられたレシピエントのCNSに治療薬を送達するための手段として使用できる可能性が提起されます。 このメカニズムについては、積極的に調査を進めています。放射線照射による骨髄破壊的コンディショニングは、ブスルファンコンディショニングと比較してCNSにおけるGFP+ BMDCsの蓄積が多いことを発見しましたが7、放射線照射は神経変性疾患の患者やCNS疾患のマウスモデルにおいてかなりの毒性を有する可能性があります。

私たちや他の多くの人々が、神経変性疾患におけるBMDCを研究するためにBMTモデルを使用してきましたが、レシピエントマウスのBMコンパートメントを明確に識別可能なBM細胞の集団に大きく置き換える能力は、造血システムのさまざまな側面を研究するための非常に貴重なツールです。これには、造血系譜の発達、白血病、臓器移植、移植片対宿主病、免疫生物学など、幅広い研究トピックが含まれます。

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プロトコル

注：倫理声明：このプロトコルは、見直し、サイモン·フレーザー大学の動物実験委員会によって承認されている（UACC、許可証番号1037K-12と1060K-03）とアニマルケアに関するカナダの協議会に準拠している、のためのNIHガイド実験動物の管理と使用、およびEEC理事会指令。

1.特別な考慮事項

注：ブスルファンは、細胞傷害性である。ハンドルと安全データシートと制度ガイドラインに従って廃棄してください。

  1. 層流フード内で無菌的にすべての技術を実行する。
  2. このような剥離パッケージ、およびオートクレーブのような適切な包装材料で包むことによって、使用前に器具を滅菌する。
  3. 感染のリスクは、照射に比べブスルファン付きの下ですが、唯一の移植後最初の2週間は、層流フードで動物を扱う。

2.コンディショニングレシピエントマウス

  1. 滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を用いて溶液を3mg /にブスルファンを希釈する。
    注：注射の毎日を使用直前にブスルファンの新鮮な希釈することが重要である。
  2. 毎日のIP注射を経由して、レシピエントマウスに希釈しブスルファンの20mg / kgのを管理します。
  3. 60-100 mgの総用量まで20mg / kgのブスルファンの毎日のIP注射を繰り返し/ kgの（ すなわち、80 mg / kgを総用量のために、4日間連続ブスルファンを20mg / kgで投与）送達された。

ドナー骨髄細胞の3.絶縁

注意：このプロトコルは正常に最大5ドナーマウスからのBM細胞を単離および調製するために使用されてきた。通常、マウス当たり細胞収量は、12-16レシピエントマウスに移植するのに十分である約30から40000000 BMDCを、である。以上のドナーマウスが必要な場合は、プロトコルに応じて調整する必要があるかもしれない。

  1. ブスルファンコンディショニングの最後の日に続いてeuthCO 2を使用した（一から六ヶ月）のGFPドナーマウスをanize（または機関に受け入れられ、他の安楽死法による）。移植の合併症を回避するために、受信者と同じ性別である同系ドナーを使用しています。
  2. 70％エタノールでマウススプレー。リフト腹部の皮膚と外科用ハサミを使用するには、足首に向かって腹腔まで足から皮膚を介して切開する。足を持ち、しっかりと脚組織を暴露腰に向かって足首から肌を引き出します。
  3. 股関節を露出するために大腿骨から筋肉及び脂肪組織を切り取る。
  4. 優しく足を拡張するために、足を引っ張っている間、股関節に対してハサミを押してください。ちょうど大腿骨自体をカットしないように注意しながら、大腿骨の頭の上にカット。
  5. 、無菌性を維持するのに役立ち足で足を保持し、オートクレーブ組織と骨表面をこすることにより骨から残りの組織をクリーニングするには。
  6. 膝関節を切断することにより、大腿骨と脛骨を分離滅菌PBSを含む培養皿に大腿骨を置く。氷上でインキュベートする。
  7. 腓骨は脛骨に接続している箇所で切断することにより、腓骨を取り外し、廃棄します。大腿骨との培養皿で脛骨を置き、氷上でインキュベートする。
  8. 繰り返して、他の足のために3.2から3.7を段階的に説明し、必要に応じて、追加のドナーマウス。骨を除去した後、ホットビーズ滅菌器で手術器具を滅菌するか、その後の工程のための無菌の新しいツールセットを使用します。
  9. 大腿骨の場合は、鉗子で大腿骨を保持し、慎重に手術用ハサミを使用して「剃る」は遠位骨をオフに終了します。 BM空洞を公開するために、必要に応じて骨のような少しを削除します。
  10. 滅菌PBS 3mlで注射器を記入し、23 Gの針を取り付けます。慎重にBM空洞に針を産んと無菌培養皿にBMをフラッシュする。すべての所望の細胞の除去を確実にするために、ニードルポイントで髄空洞をこすりしてください。抽出に続いて、赤いBMは表示されなくなりと骨が今白く見えることを確認してください。
  11. 繰り返しは、同じ培養皿にBMのすべてをプール、後続の大腿骨用3.9から3.10を繰り返します。
  12. 脛骨のために脛骨がBM空洞が露出するように膝に取り付けた最後を、鉗子で脛骨を保持し、慎重に「剃る」。可視赤色BMが終わる骨に沿って第2のカットを行います。
  13. 滅菌PBS 3mlで注射器を記入し、25 Gの針を取り付けます。静かに（膝に取り付けた端から）BM空洞の中に針を挿入し、大腿骨からBMを含む培養皿にBMをフラッシュする。すべての細胞を除去するために針でBMキャビティの壁をこすり。抽出に続いて、赤のBMが見えなくなると骨が今白表示されていることを確認していない。
  14. 繰り返しは、同じ培養皿にBMのすべてをプール、後続の脛骨のため3.12から3.13を繰り返します。
  15. 穏やかcと解離を1 mlピペットチップでBMを粉砕するのエル。
  16. 滅菌した50mLの遠心分離管に40μMバスケットフィルターを通して細胞懸濁液を渡す。残りの細胞を取得し、遠心管にフィルターを介してこれを転送するためにPBSでディッシュをすすぐ。
  17. 4℃で450×gで5分間遠心。上清を除去し、廃棄する。
  18. 再懸濁赤血球溶解緩衝液3ml中にペレットを再。 8.5分間氷上でインキュベートする。
  19. 溶解バッファをクエンチするの無菌PBS〜30ミリリットルを追加します。
  20. 4℃で450×gで5分間遠心。上清を除去し、廃棄する。
  21. 滅菌PBSの1ミリリットル中にペレットを再懸濁。氷の上に保管してください。
  22. 細胞ホモジネートの小アリコートを取り、PBSで希釈し（1：1マウス100; 1：2匹のマウス200等）の血球計数器を用いて細胞数を定量する。
  23. 8×10 6細胞/ mlの細胞懸濁液を希釈し、注射まで氷上でインキュベートする。

4.骨髄移植

  1. Fiのllの各マウスに希釈した細胞懸濁液を300μlと（28 Gイン​​スリン針付き）が0.5 mlシリンジに注入する。注射器中に存在する任意の気泡を除去するようにしてください。
  2. 加熱パッドを条件とレシピエントマウスを含むマウスケージを置き、尾静脈を拡張することができます。
  3. 拘束装置において、レシピエントマウスと起こる。 70％エタノールを浸した外科ガーゼでテールを拭きます。
  4. しっかりと尾を保持し、ベベルを上にして、軽く外側尾静脈の1に針を挿入し、細胞懸濁液を注入する。
  5. 出血が新しいクリーンケージにマウスを導入する前に停止するまで注射部位に外科ガーゼを持ってください。

5. BMキメラ現象の程度を推定

NOTE：キメラ化レベルが1週間後BMTにおける末梢血中で一般的に可変であり、そのようキメリズムのレベルは、通常、少なくとも2週間後BMT推定される。チムのレベルerismはBMT後3〜4週間以内に末梢血中の> 80％のGFP +細胞に到達する必要があります。

  1. FACS緩衝液（PBS中の2mM EDTA + 2％ウシ胎児血清）を準備。
    NOTE：FACSバッファは数週間4℃で保存することができる。
  2. 拘束チューブにマウスを置き、横伏在静脈を露出させるために後部脚に毛を剃る。
  3. 薄くコートワセリンとピアス25 G針で伏在静脈と足。
  4. ヘパリンコーティングされた毛細管血液の約50μlのを収集します。 FACS緩衝液1mlを含むマイクロ遠心チューブに血液を加える。反転によってチューブを混合し、氷上で保存する。
  5. 戻ってケージにマウスを返す前に停止し、出血するまで、注射部位に外科ガーゼを保持します。
  6. 遠心分離機900×gで5分間の血液サンプルは上清を除去し、廃棄する。
  7. 赤血球溶解緩衝液500μl中にペレットを再懸濁。 8.5分間氷上でインキュベートする。
  8. 溶解緩衝液をクエンチし、FACS緩衝液1mlを加える。
  9. 900×gで5分間、サンプルを遠心する。上清を除去し、廃棄する。
  10. 赤血球溶解緩衝液500μl中に第二溶解ステップを実行します。 8.5分間氷上でインキュベートする。
  11. 溶解緩衝液をクエンチし、FACS緩衝液1mlを加える。
  12. 900×gで5分間、サンプルを遠心する。上清を除去し、廃棄する。ペレットは今白であることを確認してください。
    注：ペレットがまだ赤い表示される場合は、追加の溶解工程は、次のステップに進む前に必要になる場合があります。
  13. 再懸濁FACS緩衝液1ml中でペレット。 900×gで5分間、サンプルを遠心する。上清を除去し、廃棄する。
  14. FACS緩衝液300μl中にペレットを再懸濁し、フローサイトメトリーを用いて、GFP +細胞を定量化する（注：この時点で、細胞の任意の免疫染色は、標準的な技術を使用して、行うことができる前にフローサイトメトリー分析する）。

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結果

ブスルファンの60〜10mg / kgの投与は、一般的にマウスが許容される。しかし、動物は、一般的に、コンディショニング相（〜5から10までパーセント）の間に体重を減らすため、食事は、そのような食べることを奨励するために照射ヒマワリの種のような扱いで補充する必要があるかもしれません。末梢血中の> 80％のGFP +細胞のキメラ現象とBMのレベルは60〜100 mg / kgをブスルファン7を使用して、一貫して達成可能である必要があります。当研究室では、成功した末梢血とBM中の> 80％のGFP +細胞と100以上のキメラマウスを生成するには、このプロトコルを使用しています、と同系ドナーとレシピエントを使用した場合、当社のBMTの事実上すべてが成功している。 図1をキメリズムのレベルは毎週定量化を示し成功した同系BMTを受けた100mg / kgのブスルファンでコンディショニングしたマウスの末梢血中の（n = 3）の不成功同種BMTを受けた80 mg / kgをブスルファンでコンディショニングマウス（n = 3）。 > 80％のキメラ現象レベルがtypicallです...

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ディスカッション

ブスルファン調整は容易に検出された造血細胞を有するマウスにおける高レベルのBMキメラの生成を可能にする。この調整は、照射設備を必要とせずに行うことができる。また、このプロトコルで概説ブスルファンの用量の骨髄抑制はよく照射骨髄破壊用量によって引き起こされる有害な副作用を最小限に許容され、従って、よりあり、若い古い、または罹患したマウスにおけるBMキメラを生成するためのより適切な技術であってもよい骨髄破壊的照射の影響を受けやすい。ブスルファンで達成可能なものよりも低いキメリズムのレベルをもたらすことができる、いくつかのRICプロトコルは、有害な副作用を最小限に抑えるために全身照射の低い、非myleoablative用量を使用するが、これらのプロトコルはまだ照射量に応じて、照射設備を必要としエアコン13。最近では、トレオスルファンは、BMコンディショニング8,14のために使用されてきた。ブスルファンと同様に、トレオスルファンconditioningとBMTはBM 14におけるキメラ現象の高いマウスを生成することができる。しかし、トレオスルファン、北米で容易に達成されないが、ブス...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この作業は、ロナルド・ピーター・グリッグスALS研究フェローシップ(KPへ)と、CIHR、カナダALS協会、およびカナダ筋ジストロフィー(JNM-69682)からのCKおよびFMRへの神経筋研究パートナーシッププログラムの助成金によって支援されました。 ALS Society of America(57969)からも追加の支援が提供されました。カナダのバンクーバーにあるBCがん庁のTerry Fox Laboratory/Department of PathologyのR. Keith Humphries博士と、Simon Fraser University Animal Care Unitのスタッフに感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ブスルフェックス大塚カナダファーマシューティカルインクDIN 02240602使用直前にブスルファンを滅菌PBSで3 mg / mLに希釈します。.ブスルファンは細胞毒性があります。MSDSおよび機関のガイドラインに従って取り扱いおよび廃棄してください。
ACK Lysing BufferLife TechnologiesA10492-01他の溶解バッファーを代用できるが、それに応じてインキュベーション時間を調整する必要があるかもしれない
Fetal Bovine SerumLife Technologies12483-020

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