不可逆とリバーシブル片側尿管閉塞のマウスモデル

サマリー

不可逆的な片側性尿管閉塞(UUO)のマウスモデルは、切断された尿管が膀胱内に吻合することによって尿管閉塞が緩和される可逆的なUUOのモデルとともに提示されます。これらのモデルにより、腎臓の炎症や瘢痕化、組織のリモデリングの研究が可能になります。

要約

腎臓の閉塞は、天然または移植された腎臓に影響を及ぼし、腎臓の損傷や瘢痕化を引き起こす可能性があります。ここで紹介するのは、片側尿管閉塞(UUO)によって引き起こされる閉塞性腎症のモデルであり、これは不可逆的(UUO)または可逆的(R-UUO)のいずれかです。 不可逆的なUUOモデルでは、尿管がさまざまな期間にわたって閉塞し、ますます重症化する腎炎症と間質性線維性瘢痕化を誘発する可能性があります。可逆的なR-UUOモデルでは、尿管が閉塞して水腎症、尿細管拡張、炎症を誘発します。適切な期間の後、尿管閉塞は、腎臓の完全な減圧と膀胱への尿の流れの回復を可能にするために、以前に閉塞した膀胱への切断された尿管の吻合によって外科的に逆転します。不可逆的UUOモデルは、疾患の病因や潜在的な抗炎症療法または抗線維化療法の試験など、腎臓の炎症と瘢痕化のさまざまな側面を調査するために使用されてきました。R-UUOのより挑戦的なモデルは、一部の研究者によって使用されており、有害な刺激の除去後の損傷した傷跡のある腎臓の炎症および免疫プロセスおよび組織リモデリングの研究を可能にするため、大きな研究の可能性を提供します。その結果、R-UUOモデルは、研究者に腎臓の炎症の解決と組織修復の重要な側面を探求する機会を提供します。これらの実験モデルは、患者が減圧を必要とする腎管の閉塞を呈することが多く、現在の治療選択肢がなく、最終的に末期腎不全につながる可能性のある重大な腎障害が残ることが多いため、人間の疾患に関連しています。

概要

ここで説明する実験モデルの全体的な目的は、片側尿管閉塞(UUO)による閉塞性腎症を誘発することです。これは、不可逆的(UUO)または可逆的(R-UUO)のいずれかです。UUOの単純な不可逆的なモデルが提示され、縫合糸による結紮または結紮クリップの適用によって左尿管が永久に閉塞されます。 これにより、尿管が著しく拡張し、腎血流と糸球体濾過が減少します。腎組織学は、尿細管の拡張とますます重症化する間質性腎の炎症と線維症を示しています。不可逆的UUOは有用なモデルであり、腎の炎症と線維症の両方の研究において多くの研究者によって採用されています。^1-4 UUOの不可逆的なモデルにはある程度の外科的専門知識が必要ですが、比較的単純であり、間質性腎障害の病因とそれに続く線維症についての洞察を求めるためによく使用されます。また、Tapmeierらによって最初に記述された方法の修正を使用した、使用頻度の低いR-UUOモデルも紹介されています。⁵ R-UUOモデルは、炎症および免疫プロセス、細胞および組織の再生、および有害な刺激の除去に続くその後の組織リモデリングの研究において、多くの将来の可能性を秘めています。

より挑戦的なR-UUOモデルは、限られた数の研究者によって使用されており、いくつかのグループはここで述べられているものとは著しく異なる外科的技術を採用しています^6,7が興味深い結果をもたらしました。提示されたR-UUOモデルでは、尿管は、所望の損傷および線維化のレベルを誘発するのに十分な期間、完全な尿管閉塞を誘発するために結紮される:ここで説明する方法では、7日間のUUOが選択された。尿管閉塞を逆転させ、マウスを淘汰し、腎臓を分析のために摘出する前に、研究者が決定した期間、腎臓を減圧させます:ここで説明する方法では7日間の減圧が選択されましたが、炎症と線維症の解消が研究されている場合は、より長い期間が選択されます。ここで説明する方法は、かなりの外科的専門知識を必要としますが、他のR-UUOモデルに比べていくつかの利点があります。閉塞した尿管に柔らかい壁のプラスチックチューブを適用すると、過度の尿管の拡張が防止され、これにより尿管のその後の操作と吻合が容易になります。さらに、記載されているR-UUOモデルでは、尿管が分割されているため、残留尿沈渣や破片を除去できます。これにより、残りの尿管内腔が閉塞しなくなり、膀胱への吻合前に開存していることが確認されます。

不可逆的なUUOモデルと可逆的なUUOモデルの両方を組み込んだ実験は、研究者に損傷とその後の解決と再生の両方の分子的および細胞的メカニズムについての強力な洞察を提供することができます。 したがって、ここで説明するR-UUOのモデルは、炎症後組織のリモデリングとこれを調節する方法に関心のある研究者にとって非常に関連性があります。

プロトコル

一般的なガイダンス：動物実験は、動物によって課せられたガイドラインおよび規則に従って（科学的処置）法1986このプロトコルと多くの上で実行することができます付属のビデオプロトコル標準UUOとR-UUO両方のためのもの、で行ったマウス系統。添付のビデオでは、両方の手順は、8週齢のオスのC57BL / 6マウスで実行されます。代表的な結果のセクションで提示されたデータは、オスのFVB / Nマウスから得た。

注：このプロトコルは、左尿管を利用して、標準的なUUO及びR-UUOを実行する方法ビデオの詳細を伴うが、しかし、同じ技術を容易に右尿管にも適用することができる。

1.動物の準備および開腹

1. 無菌（オートクレーブ処理）楽器や消耗品を持つすべての手順を実行します。
2. 麻酔腹腔内に塩酸ケタミン（70mgの/ kg）及びメデトミジン塩酸塩（1mgの/ kg）を注入マウス。注意：結果の麻酔薬平面の持続時間は4時間で、全く補足麻酔は必要ありません。
3. 反射神経例えば、つま先のピンチの損失によって麻酔の深さを確認してください。
4. 切開領域周辺の毛を削除し、希薄クロルヘキシジン溶液の適用を介して手術のために腹部の皮膚を準備します。
5. 仰臥位で加熱された外科パッドの上にマウスを置き、低粘着性接着テープを使用してパッドに手足を固定する。
6. 手順の間に、加熱された手術用パッドの結果として、熱傷の兆候がないマウスを監視します。可能であれば、非電気的熱源を使用しています。
7. 塩酸ブプレノルフィン（0.06mg / kg）を皮下注射によって鎮痛を投与し、角膜の乾燥を防ぐために、眼の潤滑剤を適用する。
8. 正中開腹と腹腔へのアクセスを得るために組織分離ハサミを使って無血管白線の切開を行います。
9. マウスをドレープコリブリを挿入切開に開創。

2.片側尿管閉塞

1. 滅菌綿棒を使用すると、腹腔の右側に向かって腸を移動させることによって、左尿管を露出し、湿らせたドレープでそれらをカバーしています。
2. 角度付き鉗子を使用すると、隔離し、左尿管を持ち上げます。
3. 尿管閉塞を作成するには、どこにでも膀胱と腎盂の間に6 / O黒編組絹縫合糸で二回、左尿管を結紮。長期実験のために、すべての腹部の手術のために吸収性縫合糸を使用しています。あるいは、結紮クリップは、尿管にも適用することができる。
4. 尿管から膀胱を単離するために、2本の縫合糸の間に尿管を分割。
5. 慎重に腹腔内に腸を交換してください。
6. 第4節に記載されている手順に従ってください - 術後の回復とケア切開を閉じ、麻酔を逆にする。

Reversibl 3.準備E片側尿管閉塞

1. 手術のためにマウスを準備し、上記の手順1.1から2.2で詳述するように、左尿管を隔離する。
2. 逆にすることができる尿管閉塞を作成するには、膀胱に近い6 / O黒編組絹縫合糸で二回、左尿管を結紮。これは尿管の周りの場所に柔らかい壁のプラスチックチューブを固定するために使用されるように、長いアッパー縫合糸の一端を残します。
3. それは尿管に適用されるように開放スプレイすることができるように柔らかい肉プ​​ラスチック管5mmの長さの縦方向のスリットを作る。 1ミリメートルと2ミリメートルの外径の内径を有する任意の柔らかい壁シリコーンプラスチック管を使用することができる。
4. 尿管の周りに優しく柔らかい壁のプラスチックチューブを置きます。それは尿管の周りに閉鎖された後、長い縫合糸は、チューブのスリットの中心から出ていることを確認してください。
5. 尿管を囲む柔らかい肉の管の周りに6 / O黒編み絹縫合糸の長さを置き、ネクタイ一回。今、縦方向にそれが以前に結ばれた縫合糸の上に位置するように、管全体に、チューブのスリットの中央から出てくる、縫合糸の長い方の端を置く。
6. チューブおよび尿管の周りの場所で長い縫合糸端を固定する二回のチューブの周囲に位置する縫合糸を結ぶ。
   注：尿管およびソフト薄肉プラスチックチューブ上の癒着形成を防止するために、接着還元溶液は、チューブの周りの領域に適用することができる。
7. 慎重に腹腔内に腸を交換してください。

4.術後の回復とケア

1. 5 / O黒編み絹縫合糸を使用したブランケットステッチで腹膜を閉じて、金属製の皮膚クリップを使用して皮膚に近似している。
2. 術後感染のリスクを最小限にするために、そのような腹部の皮膚にヨウ素/アルコール溶液のような防腐剤を加える。
3. 部分的に皮下アチパメゾール塩酸塩（2mgの/ kg）で麻酔を逆転。
4. 1mlを皮下注射することにより、流体を投与は、生理食塩水を温めた。
5. それが意識を回復するまでマウスを監視します。
6. マウスは24時間29℃に保たれ、加熱ボックスに回復することを許可します。湿らせた食品は、流体および栄養摂取を促進するために提供することができる。
7. 通常は7日、障害物の所望のレベルを誘導するために回復するマウスのままにしておきます。
8. 長期的な回復実験のために、継続的な鎮痛を提供する。マウスよりも長い7日間回復される場合、皮膚クリップを手術後7日を削除します。
9. 閉塞の所望のレベルが誘発された後、いずれかの以下に説明するように、UUOを逆転、または頸椎脱臼によってマウスを安楽死させると組織病理学分析のために腎臓を収集する。

5.リバーシブル片側尿管閉塞

1. R-UUOを実行するには、手順で説明するように手術のために、R-UUOのための準備が行われたマウスを、準備10.1から1.7。
2. 存在する場合、皮膚クリップを削除して、腹腔へのアクセスを得るために腹膜に縫合糸を分割または削除。注：尿管は、長期実験皮膚クリップの妨げされている場合は、アプリケーション以下の7日間を除去されている必要があります。
3. マウスを準備し、ステップ1.8から2.2で説明したように、左尿管を隔離する。
4. 角度付き鉗子を使用して、形成された可能性の肉芽腫組織から柔らかい壁のプラスチックチューブを解放する。
5. メスで閉塞尿管の周りにプラスチックチューブを保持している縫合糸を切り、チューブを外す。
6. 左の腎臓における水腎症の存在を評価することによって成功したUUOを確認し、腎臓にも淡い表示されます。
7. 縫合糸の間に尿管を分割します。
8. 滅菌ガーゼの小片に、腎臓に付着し、尿管の残りの長さを置きます。これは尿管aから排出されます尿沈渣と死細胞を収集するために使用されますND腎盂縫合糸が除去されると。
9. 上記の尿管を分割したが、近くに、縫合糸と腎臓は、ガーゼの上に排出させる。膀胱に最も近い、そのまま、下縫合のままにしておきます。これは、尿が膀胱から腹腔に漏れないことを確実にすることである。
10. 尿管と腎盂が排出されると、尿管の残りの長さの最後に長い6 / O黒編組絹縫合糸を適用する。これは、後の膀胱尿管吻合部を補助するために使用される。
11. 膀胱に尿管の残りの長さを吻合するには、以下の手順に従ってください。
    1. それは元の位置の前方に位置し、腎臓の上に位置するように尿管を回します。
    2. それは膀胱の方向に出てくるような尿管の端から縫合糸2ミリメートルをタッキングシングル9 / Oポリアミドモノフィラメントを置きます。縫合糸が筋層に残り、尿管の内腔に入らないように注意してください。タッキング縫合糸ウィルlは、膀胱内の尿管を固定するために使用すること。
    3. 膀胱を通してチャネルを作成するには、それが膀胱の正面（腹側）壁の方に出るように、膀胱を通して斜めに21G針を渡す。
    4. 21G針のベベルで目の針を休ま。膀胱を通して目の針を導くために21G針を使用してください。目の針は、膀胱を通って尿管を取るために使用される。
    5. 9 / Oタッキング縫合糸を渡し、膀胱内と外のエントリポイントに隣接した膀胱壁を介して第切開部を介して、ステップ5.11.2で尿管に適用される。尿管、膀胱を通過したらこれは、膀胱に尿管を固定するために結ばれます。
    6. 目の針を介してステップ5.10で尿管の一端に印加長い6 / O黒編組絹縫合糸を配置します。
    7. 慎重に尿管が膀胱を通って引っ張られることを確実にしながら、膀胱の外に目を針を撤回。
    8. 尿管が目から出たらEの膀胱は、目の針を削除し、バック膀胱へ後退を防止するために、尿管の終わりに長い縫合糸にクランプを適用する。
    9. 膀胱内に場所内の尿管を固定するには、手順5.11.5で適用9 / Oポリアミドモノフィラメントタック縫合糸を、ネクタイ。
    10. しっかりと膀胱内の尿管を固定するエントリポイントの周りの2箇所に段階5.11.2と5.11.5で説明したように、追加のシングル9 / Oポリアミドモノフィラメントタイ縫合糸を適用します。
    11. 開いたハサミの裏を使用して、緊急尿管のより多くを露出するために戻って少し膀胱壁を押してください。
    12. 尿管の端部に位置する長い縫合上記の尿管を分割します。尿管、膀胱の体内に後退する必要があります。これは、尿管の開放管腔を確認し、膀胱内の開口部から流れ出る尿を観察することが通常である。
    13. 9 / Oポリアミドモノフィラメント縫合糸で膀胱の出口傷を閉じます。
12. 慎重に腸を交換腹腔。
13. ステップ4.1から4.8に詳述術後ケアを提供。
14. 腎臓は通常、7日、圧縮解除されるまで、マウスが回復することを許可します。
15. 実験の終了時点で、頸椎脱臼によりマウスを安楽死させると組織病理学的分析のために腎臓を収集します。

結果

腎臓の変化の外観が著しく尿管閉塞に続く、それはより薄いと時間との触診に緊張した（ 図1）となる。障害物に尿管の近位および腎盂の増加拡張があります。腎臓は腎皮質と髄質の著しい間伐結果として長期の閉塞閉塞性腎症の増加期間としてますます萎縮になる。尿管閉塞の逆転後、腎臓の色が血流が増加し、組織浮腫が解消するように暗くなる。彼らは長期の膨満の期間（図1）の結果として、わずかに「だぶだぶ」残るかもしれないが、腎臓の尿管と腎盂の拡張が治まる。組織損失の程度が障害物の持続期間に依存するが、組織の萎縮の要素が避けられないとして、脱遮ら腎臓は反対側の腎臓よりも一般的に小さくなっている。

通常の非操作するネイティブ腎臓の組織学は、多くの細管が明らかに（ 図2）内腔に識別を持つ尿細管間質のコンパクトな細管に囲まれた糸球体を明らかにする。尿管閉塞以下尿管および腎盂（ 図1）の膨張及び拡張は、組織切片の組織学に容易に明らかである尿細管（ 図2に矢印拡張細管）の拡張を増加させる...

ディスカッション

腎臓の閉塞は、自然腎臓または移植された腎臓に影響を及ぼし、腎臓の損傷や瘢痕化を引き起こす可能性があります。R-UUO モデルは、患者が前立腺肥大に続発する腎管閉塞、減圧を必要とする後尿道弁などを呈することが多いため、ヒトの疾患に関連しており、患者は一般的に重大な残存腎障害を残しており、現在の治療選択肢がなく、最終的には末期腎疾患につながる可能性があります。^8,9 ここで詳述するモデルにより、不可逆的なUUOとR-UUOの両方の研究が可能になります。不可逆的な UUO は、さまざまな白血球とメディエーターの役割を含む炎症と組織損傷の研究を可能にします^1-3,10 一方、R-UUO モデルの研究により、研究者は腎障害の解決と関連する組織リモデリングを調査できます。^{6、7、11-15}

他の研究者は、尿管閉塞を誘発および逆転させるためにさまざまな方法を使用しています。R-UUO モデルの最初の説明では、雄の C57BL/6 マウスの左尿管は、脇腹切開を介して非外傷性微小血管クランプで閉塞されました。⁶ ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
鈍い解剖はさみ	ファインサイエンスツール	14072-10
春はさみ–ストレート	ファインサイエンスツール	15000-10
歯付き鉗子	ファインサイエンスツール	11021-12
角度付き鉗子×2	サイエンスツール	00649-11
鉗子	ファインサイエンスツール	00632-11
Colibri 3 cm ワイヤー リトラクター	ファイン サイエンス ツール	17000-03
ロック付きカストロビエホ ニードル ホルダー	ファイン サイエンス ツール	12565-14
傷口クリップ アプリケーター	ファイン サイエンス ツール	12031-07
7 mm 巻き口クリップ	ファイン サイエンス ツール	12032-07
ロック付き カストロビエホ マイクロ ニードル ホルダー	ファイン サイエンス ツール	12060-01
OPMI ピコ顕微鏡	カールツァイス	S100
熱電子パッド	Cozee コンフォート	n/a
6/O シルク編組縫合	ハーバード装置	72-3287
9/O ダフィロン (ポリアミド) 縫合	B-ブラウン	G1111434
5/O 編組シルク縫合	ハーバード装置	51-7680
レギュラーベベルニードル、1インチ、21Gベ	クトン、ディキンソンアンドカンパニー	305175
1mlシリンジスリップチップ	クトン、ディキンソンアンドカンパニー	300184
Wypall紙綿棒	バリークラーク	L40	(オートクレーブ)
綿毛バッドジョンソン	ジョンソン	n / a	滅菌(オートクレーブ)
プレーンドレープ	ガーディアン	CB03	滅菌済み(オートクレーブ)
軟質壁シリコーンゴムチューブ			シリコーンチューブ - 内径1.0 mm;外径2.0 mm;壁厚0.6 mm
(Lacri-Lube) ホワイトソフトパラフィン57.3%、鉱油42.5%、ラノリンアルコール0.2%	アラガン社	21956GB10X
(ビデン) ポビドンヨード10%	Ecolab Ltd	PL 04509/0041
(Vetalar V) ケタミン塩酸塩	ファイザー アニマルヘルス	Vm 42058/4165	100mg/ml 溶液
(ドミター) メデトミジン塩酸塩	オリオンファーマ	Vm 06043/4003	1mg/ml
(獣医学) ブペルノルフィン塩酸塩	アルストアニマルヘルス	Vm 00063/4002	0.3mg/ml
(アンチセダン) アチパメゾールヒドロコリド	オリオンファーマ	Vm 06043/4004	5mg/ml
(アデプト) 4% イコデキストリン	バクスター		付着力低減液
NaCl 0.9%	バクスター	FKE1323

ファインストレート糸 糸 糸 ベキン滅菌エンド