ヒドロゲルは、構築し、マウス心筋梗塞モデルにおける治療薬を送達するためのフィブリンベースの接着剤のアプローチ。

サマリー

このプロトコルは、心筋梗塞の幹細胞治療のための細胞生着不良の制限を、ハイドロゲルシステムとフィブリンベースの接着剤の使用を通じて緩和することを目的としています。このアプローチにより、梗塞後の細胞間接触を維持でき、損傷部位における有益な薬剤の治療可能性が高まります。

要約

マウスの心筋梗塞モデルは、心血管疾患の分野で広く認識されており、in vivo¹での治療の有効性をテストするための最初のステップとして一貫して使用されてきました。従来の確立されたプロトコルは、動物へのダメージを最小限に抑えるためにさらに微調整されています。特に、胸筋層は単に切断するのではなく、からかい取り、開胸術は胸骨切開で肋骨を骨折するのではなく、肋間的にアプローチされ、胸郭の完全性を維持します。これらの変更により、動物への全体的なストレスが軽減されます。 >jove_content<心筋梗塞による損傷を軽減することを目的とした幹細胞療法は、長年にわたって血管新生促進および抗アポトーシス効果が期待されています。細胞を心臓表面に送達する現在のアプローチでは、通常、損傷部位の近く、冠状動脈内、または末梢血流^2-4に細胞を注入します。細胞は損傷した心筋の本拠地であることが証明されていますが、機能は損傷部位での生着不良によって制限され、その結果、血流⁵に拡散します。この原稿では、細胞内包されたヒドロゲルパッチを使用してこの障害を克服する手順に焦点を当てています。パッチは外科的処置の前に作成され、左冠状動脈の閉塞直後に損傷した心筋に配置されます。パッチを所定の位置に接着するために、生体適合性の外部フィブリン接着剤をパッチの真上に置き、パッチと心臓表面の両方に乾燥させます。このアプローチは、繊細な細胞内包治療コンストラクトの適用のための新しい接着方法を提供します。

概要

心筋梗塞（MI）は、主要な冠動脈の閉塞によって引き起こされる心臓の領域への血液の中断として定義されます。 MIに起因する損傷が原因または、より具体的には、左心室は、適切に打つ心臓の能力を低下させる非機能的瘢痕組織に生存可能心臓組織のリモデリングです。これは、一回拍出量としても知られているすべてのハートビート、および駆出率⁶と呼ばれる各心拍で心臓から送り出される血液の割合で身体に送達することができる血液の量の減少をもたらします。これらは、他の減少の機能とともに、十分な機能を維持するために、心臓の残りの部分に負担を増加させます。多くの場合、これは、株は、それが第二の心臓発作、個人⁷の約10％に見られる現象を引き起こすほど重症になることができます増加しました。

医療行為は、治療のために進化してきたがMIの直後には、何の技術は遅く、停止、ま​​たは組織リモデリングの負の副作用を逆転するように開発されていません。幹細胞療法は、それらの有望な潜在的にもかかわらず、しかし、そのような治療のための可能な道として出現した幹細胞は、臨床設定において成功することが証明されていません。その欠点の一つの理論は、有益な細胞が良好な結果^5を生成するのに十分な長さ梗塞部位に残って確保することができないことです。これは単に、梗塞の部位に注射された細胞のない24％以上が生存していないと損傷部位1日後に配達²にとどまったことが示されています。細胞保持のこの問題に対処するための可能な見通しは、細胞または損傷部位に送達することができる治療薬のいずれかをカプセル化する生体適合性ヒドロゲル系を開発することです。このプロトコルにおける選択のヒドロゲルは、ポリ（エチレングリコール）は、細胞のカプセル化では、直前の使用広報によるメタクリレートでありますoceduresしかし、カプセル化することができる任意のヒドロゲルが^8を使用してもよいです。直接損傷部位へのパッチの送達は、細胞が、下にある心筋に有益な因子を提供することができる時間の長さを増加させ、長期間にわたる細胞 - 組織接触を確実にします。

パッチアプローチのボトルネックは、心臓の表面にパッチを接着するのが困難です。多くのグループが、最も普及しているが、心臓の表面^9,10に構造物を結びつけるための簡単な縫合糸である、種々の技術によってこれを克服しています。これは、構築物はより硬い材料で作られたケースの数は成功しますが、高い水濃度とパッチ構築物の繊細な性質のために、ヒドロゲル系にしようとしたときに失敗しました。これを克服するために、我々は、血栓形成の化学的性質を模倣するフィブリン糊外部接着剤系を利用しています。フィブリン糊は、INC、多数の医療手術で使用されています創傷シーラント^11〜13として、製品の生体適合性を強調し、硬膜涙、気管支瘻、及び角膜移植をluding。さらに、フィブリンは、左心室破裂および冠動脈バイパス手術の外科的治療を含む心臓の目的の種々のために使用されている、しかし、心臓パッチの接着糊としてのその使用は、一般的に^14〜17を使用していません。心臓の相互作用にパッチを確実にするために実行可能な接着システムを提供すること、外部心臓パッチの外側に直接配置することができる生体適合性の接着剤でトロンビンおよびフィブリノーゲン結果の単純な製剤。

プロトコル

手順はIACUCプロトコル番号13302との完全な互換性であり、動物資源の部門によって承認されています。

1.機器の準備

1. 無菌性を確保するために、外科手術の前に使用されるすべての非使い捨て器具をオートクレーブ。
2. 使用の間、ガラスビーズ滅菌器とのセッションで複数回使用される器具を滅菌します。

2.ハイドロゲルの調製

1. 解凍し、ヒドロゲル構築物の作成に少なくとも24時間前にプレート幹細胞。
2. 以前の刊行物^8,18に完全に詳細に記載されているステレオリソグラフィー装置を用いて、外科的処置（または類似の器具）を一日前にパッチを準備します。
3. ハイドロゲルを作成するには、第1の所望のパッチのコンピュータ支援設計（CAD）モデルを生成し、立体造形形式（STL）に設計をエクスポートします。
4. dissolvinによってプレゲル溶液を作成します滅菌1×PBS中のGポリ（エチレングリコール）ジメタクリレート（PEGDMA）は20％のw / v溶液を得ました。同時に、光開始剤、1- [4-（2-ヒドロキシエトキシ） - フェニル] -2-ヒドロキシ-2-メチル-1-プロパン-1-オンDMSO中に溶解させます。 0.5％w / vの最終でPEGDMA溶液に光開始剤を追加します。直接架橋の前に、細胞の所望の密度の100ミリリットルを追加します。注：2.0×10 ⁵ -2.0×10 ⁶細胞/ mlの間の細胞密度が推奨されます。
5. SLAプラットフォームの中央に皿にプレ - ゲル溶液をピペットで、以前にアップロードしたSTLフォーマットされたデザインで、SLAのソフトウェアを実行します。
6. 細胞を調節するために可能にするために装置からパッチを取り外し、ダルベッコ改変イーグル培地中でヒドロゲルO / Nインキュベート（DMEM）、5％ウシ胎児血清（FBS）を補充した、100 U / mlペニシリン、および100mg / mlストレプトマイシンパッチ内の環境に。

3.動物の準備とオーラルintubatiオン

1. ケージの仲間とのグルーミング習慣との相互作用から決定されるような動物は、健康であることを確認する手順の前に、各マウスを評価します。注：女性8-10週齢のC57BL / 6Jマウスは、この手順のために使用された、しかし、任意のマウスの年齢やタイプを使用することができます。
2. 麻酔室に動物を置き、1リットル/分O ₂をサポートして5％のイソフルランに公開します。つま先ピンチ反射によって麻酔のレベルを監視します。
3. 動物を適切に麻酔された後、計量し、挿管台の上に置きます。
4. 動物の胸腔に向けて光源を直接および喉頭面を撤回し、声帯を公開するために鉗子を使用しています。慎重に声帯の間の20のG血管カテーテルをガイドし、スムーズに気管に挿入します。カテーテルは小動物人工呼吸器に接続されると、胸腔の機械的な動きによって適切な挿入を検出します。
5. 目に換気設定を調整メーカーのガイドラインに基づいて、動物の電子体重。
6. 挿管後、低体温症を防ぐために加熱パッド上に仰臥位で動物を配置します。加熱パッドは40℃を超えないことを確認してください。必要に応じて、火傷の可能性を最小限にするために、動物や加熱パッドとの間の障壁を配置します。
7. 脱毛クリームを使用することにより、手術部位から髪を削除します。適切な滅菌を確実にするためにベタジンと75％エタノールの3交互スクラブしてサイトを滅菌します。ただ、手術部位を露出させるためにドレープを置き、手順の間に乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を配置します。

4.手術手順

1. 開胸したがって、胸骨の長さを実行する胸骨の左側に皮膚切開約1cmを行い、動物の左側に実行されます。
2. 二段階で、基礎となる胸郭から筋層を分離するために鉗子を使用してください。 delineを観察動物の大胸筋を表すレーティングライン。 、少しこの筋肉を持ち上げ、基礎となる外腹斜筋から分離し、内側に後退。そして、同様に、基礎となる胸郭から外腹斜筋を解放し、第2、第3、第4肋骨の暗くされていないビューを提供する、横方向に後退させます。
3. 第三及び第四肋骨の間開胸術を行います。静か第4肋骨を持ち上げ第3および第4肋骨の間胸腔を開くために焼灼器を使用しています。さらにキャビティを開き、心臓を露出させるためにリトラクターを配置します。
4. 心の薄い心膜を破裂させるために鉗子を使用してください。
5. 8-0モノフィラメントナイロン縫合糸で左冠動脈を結紮。直接左心房の下部先端の下、約4mm心尖から縫合糸を配置します。心室筋のブランチングとスツ語の後に左心房の大きさの増加により、適切な縫合糸の配置を決定します再結ばれています。

5.パッチの配置とグルー

1. 使用するまで37℃でパッチを維持し、5％CO ₂の条件。
2. ゆっくりフラットエンドへらを使用してパッチを持ち上げ、ゆっくりと梗塞部位で、心臓の表面の上に置きます。
   注：左心室の脱落防止のために、パッチが軽くへら又はピンセットの先端のいずれかを使用して接触を維持することによって所定の位置に保持することができます。
3. トロンビンへのフィブリノゲンの1の比率：4を混合して接着剤を準備します。それは準備の開始後、通常1分以内に、厚く始めるまで繰り返しピペッティングにより溶液を混合。
4. 溶液粘度が所望のレベルに達すると、すぐにパッチ表面に約10 mlで移します。注：フィブリン糊の凝固時間は迅速であり、接着剤の効率的な転送のための機会の小窓を提供します。

6.縫合

6-0モノフィラメントナイロン縫合糸を使用して、すべての閉鎖縫合糸を実行します。
1. 三から四個々の結節縫合でリブ層を閉じます。
2. 肋間層の完全閉鎖する前に、閉鎖が完了した後、胸腔を排気し、適切な胸腔内圧を再確立するために切開部にPE-10カニューレを挿入します。
3. 三から四個々の結節縫合で胸筋を閉じます。
4. 連続縫合で皮膚層を封止します。
5. 完全閉鎖後、カニューレの端に1.0ミリリットルの注射器を接続して、胸腔を排出するためにそれを使用。
6. 縫合部位を補強するために切開部位に組織接着剤を適用します。

7.手術後の処置

1. マウスにブプレノルフィン（0.05〜1.0ミリグラム/ kg）および皮下直前復活に冠動脈結紮および少なくとも20分以下のカルプロフェン（2.2ミリグラム/ kg）を注射を与えます。両薬剤を手術後6-8時間の管理、その後痛みや苦痛を制御するために最大3日間、1日2回与えます。
2. 継続的に手術後の最初の4時間を意識し、すべての時間になるまで動物を監視します。鎮痛剤の第二の用量を投与するために、第2の検診を手術（2-4時間後）の夜を実行します。
3. 動物が安定した表示されるまで、手順に従って、二日後に毎日動物を監視します。

心機能と組織学の8解析

1. マウスのechocardiographs MI後の損傷の程度を決定するための手順を次の4週間を実行します。
2. 吸入麻酔の誘導のための麻酔チャンバー内の4〜5％イソフルラン、およびメンテナンス麻酔用フェイスマスクを介した後、2％イソフルランでマウスを麻酔。
3. 脱毛クリームで撮像領域をクリアし、拍動する心臓の2D Mモード心エコー検査スキャンを得るために、小動物の超音波を使用して、機能パラメータのASSOを記録それにciated。
4. その後、24時間、10％ホルマリン溶液中で動物と場所からの心臓を集め、二酸化炭素チャンバーにマウスを安楽死させます。 24時間後、70％エタノールに心を転送し、組織処理まで4℃で維持。
5. 心を処理し、パラフィンブロックでそれらを埋め込みます。
6. 頂点で始まり、心房で終わる、心臓の心室領域を介して、5mmのセクションをカット。
7. 染色は、標準的なプロトコルを使用して、マッソン三色、ヘマトキシリン​​およびエオシン染色の両方でスライスを切断しました。

結果

外科的処置の間に、左冠動脈の結紮は、閉塞した動脈の下流のブランチングマークすることによって同定することができます。結び目を作る前の試験のように、縫合糸は、それが適切な場所にあるかどうかを確認するために簡単に締め付けることができます。さらに、適切にビートに左心房の能力のほぼ瞬時減少動脈結果の閉塞ので、左心房は、システム内の血液の逆流に応じて拡大します。

Mモード心エコー検査の測定は、梗塞後は、筋肉の再構築を示す、左の壁運動の停止を示し、早くも2日としました。データから作られた定性的な計算は、梗塞心での駆出率とストローク量の減少を示します。心臓を組織学的目的のために収集されたときに実験の終了時に、左心室の明確な拡張は、左心室の薄型化に伴って、見ることができます壁、および機能の心筋細胞（ 図1）の代わりに、瘢痕組織の沈着を示し、コラーゲンの沈着。

また、（ 図2）は 、組織学的分析にヒドロゲルの存在は、フィブリンゲルの投与のおかげで構成で見られます。我々の目的のた...

ディスカッション

マウスMIモデルにこの方法では、我々は他のマウスのMI技術と関連している非心筋領域へのダメージを最小限に抑えるシステムを開発しました。これらの領域は、気管切開による損傷、筋層の切断、および胸腔を露出させるために、リブの破損を含みます。我々は、これらの変更は、外科手術中など、肋骨や筋肉の層を含む、主要な構造の多くの無傷を保つように注意する全体的な手術結果のおかげで改善することを考えています。

これは、最大の一日の唯一の8-10完全手術手順の結果、その時間がかかる性質であることで、この手法にはいくつかの制限があることに留意すべきです。これを克服するために、第二の人工呼吸器は、手順は、同時に2匹の動物に対して実行されるのを可能にする、使用することができます。加えて、肋間血管のような主要な血管、および開胸術を行う際に、内部胸動脈は、避けるべきです。これらの血管の近くにいる場合は、焼灼が原因破裂動脈にブリードアウトを防止するために使用されるべきです。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ハーバードモデル687マウスベンチレーター	ハーバード装置	55-0001
Inintech Biosciences LLCドライガラスビーズ滅菌器	フィッシャーサイエンティフィック	NC9531961
ライカMZ6手術用顕微鏡	カ
焼灼キット	ジェミニ	GEM 5917
鉗子-0.4mmチップ角度付き	ファインサイエンスツール	11063-07
アグリコラ リトラクター - 3.5 cm スプレッド	ファイン サイエンス ツール	17005-04
スプリング ハサミ - 2.5 mm ブレード ストレート	ファイン サイエンス ツール	15000-08
カストロビエホ ニードル ホルダー - ロック付き タングステン カーバイド 14 cm	ファイン サイエンス ツール	12565-14
アイリス ハサミ - デリケート ストレート 10.5 cm	ファイン サイエンス ツール	14060-10
8-0 モノフィラメント縫合糸	Ethicon	8730P
6-0 シルク縫合糸	Ethicon	639G
トロンビン	シグマ	T7009
フィブリノーゲン	シグマ	F3879
Vetbond 組織接着剤	3M	1469SB

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