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方法論記事

表現型分析のためのヒト皮膚からリンパ球単離と

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DOI：

10.3791/52564

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2016年4月8日

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Medical Immunology, Department of Laboratory Medicine, Radboud University Medical Centre, 2Department of Dermatology, Radboud University Medical Centre

この記事について

サマリー

ヒトの皮膚生検から皮膚常在T細胞を効率的に分離するためのプロトコルを記述します。このプロトコルは、フローサイトメトリー分析およびex vivo培養に十分な数の生存可能なヒト皮膚常在リンパ球をもたらします。

要約

人間の皮膚は重要なバリア機能を有しており、病原体からの組織の恒常性と保護に貢献様々な免疫細胞が含まれています。肌がアクセスすることは比較的容易であるように、それは末梢免疫制御メカニズムを研究するための理想的なプラットフォームを提供します。免疫常駐健康な皮膚行動免疫監視中の細胞だけでなく、乾癬のような炎症性皮膚疾患の発達において重要な役割を果たしています。新興洞察力にもかかわらず、様々な炎症性皮膚疾患の根底にある生物学の我々の理解はまだ限られています。生検皮膚試料から単離された良質な（単一）細胞集団が必要です。これまでに、単離手順は、深刻な生存細胞の十分な数を得ることの欠如によって妨げられてきました。単離およびその後の分析にも得ることが、現在の解離手順によって引き起こされる機械的及び化学的ストレスに起因する免疫細胞系統マーカーの損失の影響を受けています単一細胞懸濁液。ここでは、自動化された組織の解離及びコラゲナーゼ処理を用いた機械的皮膚解離を組み合わせることにより、健康と関係する両方の乾癬のヒト皮膚からT細胞を単離するために修正された方法を記載します。この方法は、単一細胞懸濁液を調製する際に、このようなCD4、CD8、Foxp3をおよびCD11cなど、ほとんどの免疫系統マーカーの発現を保持します。成功したCD4 + T細胞の単離およびその後の表現型および機能的分析の例が示されています。

概要

皮膚は、身体と環境との間の主要なインタフェースとして、外部からの物理的、化学的、およびそのような創傷、紫外線や微生物などの生物学的傷害に対する防御の最初の行を提供します。皮膚は、主に2つのコンパートメント、表皮と真皮を含み、ランゲルハンス細胞、マクロファージ、樹状細胞（DC）、および約200億メモリーT細胞を含む免疫細胞の様々な含まれ、全体の血液量1、ほぼ2倍の数の本、2。データの成長体は、皮膚が組織の恒常性の間、および様々な病理学的状態の両方で、本質的な免疫学的機能を持っているという概念をサポートしています。正常な皮膚内に存在する免疫細胞を、免疫学的監視3を実施するために考えられ、例えば、乾癬4のような炎症性疾患の発症において役割を果たすことが示されています。乾癬病変皮膚では、CD4 +およびCD8 +の両方のT細胞がOBSた浸潤しましたervedそれはCD4とCD8の比率は、疾患状態5に応じて変化することが示されました。しかし、細胞のこの集団は、既存の技術は、ほんのわずかの細胞の単離を可能にするため、研究するのが困難です。

ヒトの皮膚からのT細胞の単離のために現在広く用いられている技術は、酵素処理と機械的に皮膚解離を兼ね備えています。ヒトの皮膚生検は、広範囲に刻み、トリプシン、コラゲナーゼおよび/ ​​またはEDTA 6-8のような酵素でインキュベートします。皮膚は、引張力および機械的分解に非常に抵抗性であるバリア組織であることを考慮すると、T細胞の単離の確立された方法は、これらの細胞集団の困難およびex vivo細胞培養を行い、非常に少数の細胞および生細胞のより低い番号を生成します挑戦。

ここでは、mechanを組み合わせることにより、健康で関与両方乾癬ヒトの皮膚からリンパ球を単離するための改良法を報告します酵素消化は、コラゲナーゼを使用して一緒に、自動化された組織の解離の代わりに広くミンチの確立された方法を用いて、皮膚のiCalの解離。 DCおよびT細胞を含む種々の生存免疫細胞サブセットを、単一細胞懸濁液の調製後に観察されました。重要な表面マーカーCD3、CD4とCD8の発現がよく保存されていました。このようにして調製した細胞は、ex vivoでの細胞培養またはフローサイトメトリー分析に使用するための準備ができています。このプロトコルは、正常乾癬患者の病変皮膚に由来する単一の皮膚生検（4 mm）での分析のために使用されています。その結果、皮膚常駐患者のT細胞は、健康なボランティア9と比較して、IL-17及びIFNγのような多くの炎症性サイトカインを産生することを示しました。

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プロトコル

注：健康な個体からの皮膚生検は、科学的な使用のための口頭または書面によるインフォームドコンセントの後に選択科目整形手術を受けている個体の腹部の皮膚の残りから得ました。人間の皮膚の使用が承認されたラートボウト大学医療センター、ナイメーヘン、オランダ、エッセン、ドイツの大学の人間の研究のための医学倫理委員会によって設定された規則に従ってインチ

ヒト皮膚からの単一細胞懸濁液の調製（フローキャビネット内の作業滅菌後、細胞培養物がある場合は必須）

  1. 細胞培養培地を準備していない血清を含むRPMI 1640 +ペニシリン/ストレプトマイシン（ml最終濃度100単位/および100μg/ mlの、それぞれ）+ピルビン酸（0.02ミリモル）およびグルタマックス（0.02 mM）を、追加されました。
  2. 完全培地を準備します。ステップ1.1 + 10％のヒトプール血清（HPS）で調製した培地; 4℃で保存します。私たちの前に20℃±2にメディアを持参る。
  3. 4ミリメートルラウンド生検パンチ装置を用いて皮膚生検を取得し、最大4時間、または4℃でONで20℃±2でRPMI1640完全培地に保管してください。実験室での到着時にできるだけ早く生検を処理します。
    注：皮膚の長期保存は、細胞収量および細胞生存率に影響を与えます。
  4. ブルーキャップされた解離管にラベルを付け、ラベルされたチューブに5ミリリットルを完全培地を追加します。
  5. 無菌の6ウェル培養プレート（合計3つのウェル中）を各ウェルに完全培養培地2mlを加えます。このように3回のすすぎの合計を達成し、1つのより多くの時間を、単一のウェルに生検を配置するために、無菌のツールを使用してすすぎ、第2のウェルにそれを上に移動し、このステップを繰り返します。
  6. 滅菌シャーレによくすすぎ、皮膚生検を移し生検の上に完全培養培地100μlを追加し、慎重にステンレス鋼使い捨ての滅菌メスを使用して、皮下脂肪組織を削り取ります。
    注：番目重要なステップです。
  7. 滅菌ペトリ皿上の4小片に各皮膚生検をカット。転送サンプル（最大チューブあたり、4mmの生検の4つの）完全培養培地5mlを含有する準備解離管に。
  8. しっかりとキャップでチューブを閉じ、自動化された組織の解離のスリーブに上下逆さまに取り付けます。すべてのサンプル材料をロータのエリアに位置していることを確認します。
  9. 56秒間の適切な回転速度で生検を解離するために「プログラムm_spleenの_01」（計測器の内蔵メモリにより、または伴うプログラムカードが提供する事前定義されたプログラム）を実行することにより、解離プロセスを開始します。
  10. 処理の後、解離から解離管を切り離し、すべての解離した材料は、チューブの底に収集されていることを確認してください。
  11. 解離チューブに150μlのコラゲナーゼIA（80 mg / mlで）を加え、37℃で振とう水浴中でサンプルをインキュベート60分間°C。よく混ぜ、thedissociationチューブにDNアーゼI（5 MU / ml）を100μlのを追加します。
    注：コラゲナーゼのより高い濃度またはより長いインキュベーション時間は、細胞生存率を変化させます。
  12. 自動化された組織の解離のスリーブに解離管を取り付け、生検1つのより多くの時間を解離するために「 プログラムM_脾臓_01」を実行します。
  13. 50ミリリットルファルコンチューブの上に70μMナイロン細胞ストレーナーを配置します。細胞塊/組織片を除去するために、このセルストレーナーに解離した試料材料を適用します。
  14. 完全培地の5ミリリットルで一回セルストレーナーを洗浄します。 20°C±2で遠心し、10分と吸引上清のための450×gで。
  15. 洗浄工程をもう一度繰り返します。完全培養培地300μlの中に再懸濁し、細胞ペレット。単一細胞懸濁液は、さらなる分析のために準備ができています。 ex vivoでの細胞培養のためのプロトコルを続行するか、フローサイトメトリー分析。
  16. さらに私の場合、ntracellularサイトカイン染色は、37℃で4時間、PMA（12.5 NG /ミリリットル）、イオノマイシン（500ngの/ ml）およびブレフェルジンA（5μg/ ml）で細胞を刺激し、5％CO 2インキュベーターフローを実行する前に4時間フローサイトメトリー分析。

皮膚常駐T細胞の2ポリクローナル活性化（ex vivoで細胞培養）

  1. アリコート（ステップ1.15で調製した）100μlの単一細胞懸濁液を、丸底96ウェルプレートに。
    注：4mMの皮膚生検のそれぞれについて、取得された単一細胞懸濁液を96ウェルプレートのうちの少なくとも2つのウェルに分割することができます。
  2. 抗CD3 /抗CD28 mAbで被覆したマイクロビーズ（ウェル当たり25,000ビーズ）、組換えヒトサイトカインのrIL-2（最終濃度25 U / ml）およびのrIL-1β（最終濃度50 ngの/ mlで）を加えます。
  3. ウェル標識プレートの蓋で培養プレートをカバーし、5％CO 2、100％湿度でインキュベートし、37 Cのインキュベーター°。培地の色が黄色になるとメディアを変更します。
    注：明細胞コロニーは、細胞培養の8日目から観察することができます。

プライマリ/培養皮膚常駐T細胞の3フローサイトメトリー分析

  1. PBS + 0.2％BSA：FACS緩衝液を準備します。
  2. V底96ウェルプレートに、目的とする細胞を転送します。 20°C±2、2分間、450×gで遠心し、その上清を吸引。
  3. 100μlのPBSにペレットを再懸濁。 20°C±2、2分間、450×gで遠心し、その上清を吸引。
  4. 4℃で30分間：（PBSを使用して、千希釈1）固定可能な生存可能性色素を結合させ準備eFluorescence780100μlの染色細胞。 FACS緩衝液100μl、20℃±2で遠心分離機、2分、および吸引上清450 XGを追加します。
  5. 例えば、必要な細胞表面マーカーのmAbを選択：CD45-BV421（HI30、1時20分）、CD3-ECD（UCHT1、午前1時50分）、CD4-PC5.5（1388.2、1：200）、CD8-APC-AlexFluo700 （B9.11、1：400）、CD14-FITC（TUK4、1時50分）、CD19-APC-AlexFluo750（13から1191:50）、CD56-PE（MEM-188、1：50）、CD25-PeCy7（BC96、1時50分）、のCD11c-PeCy7（BU15、1:10）、およびCD1c-APC（AD5-8E7、 1:10）、テストした各mAbの希釈率に応じて、FACS緩衝液を使用したmAb-混合物を準備します。非染色サンプルと一緒に、抗体のアイソタイプコントロールを使用して、ゲートの設定を定義します。
  6. 各ウェルに準備したmAb-混合物の25μlのを追加します。光から保護し、20℃±2で20分間インキュベートします。
  7. FACS緩衝液100μl、20℃±2で遠心分離機、2分、および吸引上清450 XGを追加します。
  8. 唯一の細胞表面染色を必要とするサンプルについては、ステップ3.16に進みます。
  9. 細胞内のFoxp3染色の場合：
    1. 希釈剤の3部で濃縮物の一部を混合することによって固定し、透過処理バッファーを準備します。
    2. 10倍の透過化バッファの1部+滅菌H 2 Oの9部：1×透過処理バッファーを準備します
  10. 固定とpermeabiliの100μl中に再懸濁ペレット化バッファは、よく混ぜ、および4でインキュベート 30分間°C。
  11. 各ウェルに450 2分間、室温でXG、および吸引上清で遠心分離機を100μlの透過化バッファを追加します。
  12. 透過化バッファ1より多くの時間で細胞を洗浄。
  13. 例えば、必要な細胞内のmAbを、選択し、Foxp3を-eFluo450（PCH1​​01、1：50）、IL-17A-AlexFluo488（eBio64DEC1、1：50）およびIFNγ-PeCy7（4S.B3、1：400）。テストした各mAbの希釈倍率に応じて、2％正常ラット血清を含む透過化緩衝液を用いてモノクローナル抗体の混合物を準備します。非染色サンプルと一緒に、抗体のアイソタイプコントロールを使用して、ゲートの設定を定義します。
  14. 各ウェルに準備したmAb-混合物の20μlのを追加します。 4インキュベート 30分間°Cで、光から保護します。
  15. 30分間のインキュベーション後、各ウェルに透過化緩衝液100μlを加えます。 20°C±2、2分間、450×gで遠心し、その上清を吸引。
  16. 透過性のブフェで細胞を洗浄R 1のより多くの時間。再懸濁し、FACS緩衝液の110μlのでペレット、およびmicroFACSチューブに細胞懸濁液を転送します。
    注：サンプルは、10色のフローサイトメトリーを用いた測定の準備ができています。
  17. 必要とされる正確な細胞数の場合には、直ちにフローサイトメトリーを用いて測定を行う前に、各試料中に蛍光粒子の十分に混合された均一な懸濁液10μlを追加します。

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結果

単4ミリメートルの皮膚生検を使用している場合、ここで提示されたプロトコルは、ヒトの皮膚から（±SEM、乾癬患者の病変皮膚を意味する）760±178,000まで（±SEM、健康なボランティアの皮膚を意味する）615±2200の間に実行可能なリンパ球を得られます。

CD45 +細胞の異なる種類はCD4 + T細胞（〜45％）、CD8 + T細胞（約30％）を含む、健康な個体の皮膚に由来する単一細胞懸濁液中で同定、およびCD11c +樹状細胞（約5％でした）、いくつかのB細胞（CD19 +）のに対し、NK細胞（CD56 + CD3 - ）、または単球/マクロファージ（CD14 +またはCD1c +）は、（ 図1A）が観察されました。方法はまた、ヒト皮膚生検におけるCD4 + CD25 +のFoxp3 +<...

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ディスカッション

ここでは、効率的にヒトの皮膚生検からの皮膚常在T細胞を単離するためのプロトコルを提示します。このプロトコルの利点は、実行可能なリンパ球の比較的高い数の分離であり、関連する表面マーカーを発現します。同定された細胞のサブセットは以下の通りであった：たCD11c + DCは、CD4 +およびCD8 + T細胞とのFoxp3 + CD25 +細胞。重要なのは、孤立した皮膚常在T細胞のex vivoでの文化は非常によく実現可能だったとその後の機能解析を可能にしました。

ヒトの皮膚は、組織の構造的完全性を維持するために機能する細胞外接着タンパク質の酵素分解と機械的に解離を組み合わせることにより、単一細胞懸濁液中に解離させることができます。表皮と真皮のディスパーゼベース層分離は、これらのそれぞれの皮膚層に細胞浸潤を決定するために広く用いられている方法ですが、私たちは、ディスパーゼ処理がトンを主導していることに気づきましたOA CD25およびCD27の細胞表面発現の主要な...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

乾癬患者からの皮膚生検を親切に科学的な使用のための口頭または書面によるインフォームドコンセントの後に博士アンドレアスKoerber（エッセン、ドイツの大学の皮膚科部門）によって提供されました。

XHはまた、NSFC 61263039とNSFC 11101321でサポートされています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
使い捨て可能なBiopsyの穿孔器のKaiのヨーロッパBP-40F4 mm
の使い捨て可能な生殖不能のメスDalhausen1100000510
gentleMACS Cの管Miltenyiの生物技術130-093-237解離の管として使用される青い帽子。
gentleMACS DissociatorMiltenyi Biotech130-093-235自動組織解離器。皮膚生検の解離に「プログラムspleen_01」を使用します。
セルストレーナー BD35235070 & マイクロ;m ナイロン
96 ウェル U 底板Greiner Bio-One650180
RPMI 1640Life Technologies22409-015
ピルビン酸ナトリウムLife Technologies11360-039
GlutaMAXLife Technologies35050-061
ペニシリン/ストレプトマイシンLife Technologies15140-122
人間プール血清 (HPS)自社調製
コラゲナーゼ ISigma-AldrichC2674Type 1-A, suitable for cell culture
DNase ICalbiochem I Calbiochem260913
PBSB Braun3623140
BSASigma-AldrichA4503-500G
Fixable Viability Dye (FVD) APC-eFluo780eBioscience65-0865-18細胞固定前に死細胞を染色し、PBSで1:1,000に希釈
固定/透過濃縮液eBioscience00-5123-43
固定/透過希釈液eBioscience00-5223-56
透過化バッファー (10x)eBioscience00-8333-56
BV421 マウス抗ヒトCD45BD563879クローン:HI30;希釈係数 1:50
FITC マウス抗ヒト CD14DakoT0844クローン:TUK4; 希釈係数 1:50
PE マウス抗ヒト CD56DakoR7127クローン: MOC-1; 希釈係数 1:50
ECD マウス抗ヒト CD3Beckman - CoulterA07748クローン: UCHT1; 表面染色の場合は希釈係数 1:50、細胞内染色の場合は希釈係数 1:25.
PC5.5 マウス抗ヒト CD4Beckman - CoulterB16491クローン: 13B8.2; 希釈係数 1:200
PeCy7 マウス抗ヒト CD11cBeckman - CoulterA80249クローン: BU15; 希釈係数 1:50
APC マウス抗ヒト CD1cMiltenyi Biotech130-090-903クローン: AD5-8E7; 希釈係数 1:10
APC-AlexFluo700 マウス抗ヒト CD8Beckman - CoulterA66332クローン:B9.11;希釈係数1:400
APC-AlexFluo750 マウス抗ヒトCD19Beckman - CoulterA94681クローン:J3-119;希釈係数1:50
PeCy7マウス抗ヒトCD25eBioscienceAD5-8E7:BC96;希釈係数1:50
 PE ラット 抗ヒト CLAMiltenyi Biotech130-091-635クローン: HECA-452; 希釈係数 1:
eFluo450 ラット 抗ヒト Foxp3eBIoscience48-4776-42クローン: PCH101; 細胞内染色; 希釈係数 1:50
AlexFluo488 マウス抗ヒト IL-17AeBioscience53-7179-42クローン: eBio64DEC17; 細胞内染色; 希釈係数 1:50
PeCy7 マウス抗ヒト IFNgeBioscience25-7319-41:4S。B3 です。細胞内染色;希釈係数 1:400
フローカウント フルオロスフィアBeckman - Coulter7547053カウントビーズ、フローサイトメトリー用
クローンクローン

参考文献

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