デザイン、治療、セルラーめっき、機能的に相互接続された回路で構成モジュラー神経回路網の培養表面

サマリー

この原稿は、空間的に閉じ込められた、機能的に相互接続された神経回路からなる生体外モジュラーネットワークで成長するプロトコルについて説明します。ポリマーマスクは、培養基材上に細胞接着を促進するために、パターンにタンパク質層が使用される。メッキニューロンは、被覆された領域自発的な接続を確立し、電気生理学的活性を示す上で成長。

要約

脳は協調活性化し、神経アセンブリの動的な通信を介して動作します。主要な未解決の問題は、最も多様な脳機能の基礎となる力学モチーフの膨大なレパートリーは、脳回路の固定されたトポロジカルとモジュラー組織の外に出てくることができる方法です。現在の本質的な実験的な困難神経回路のin vivoでの研究と比較して、in vitroでの製剤は、実験的なニューロン系の、構造的な力学的特性および化学的特性を操作し、プローブするための非常に大きな可能性を提供する。この作品は、空間的に異なる、機能的に相互接続された神経細胞の集合体で構成モジュラーネットワークの成長を可能インビトロ実験方法について説明します。プロトコルは、位相的複雑さの異なるレベルでの神経回路網の2次元（2D）アーキテクチャを制御することができる。

目的のネットワークパターニングが可能正規のカバースリップと基板埋め込みマイクロ電極アレイの両方を達成しました。微細加工された構造は、シリコンウエハ上にエンボス加工され、所望のネットワーク·アーキテクチャの負の特徴を含む生体適合性ポリマーステンシルを作成するために使用される。ステンシルは、細胞接着を促進するための分子層を有する表面コーティング手順中に培養基質上に配置される。ステンシルを除去した後、ニューロンは、めっきされ、それらは自然発生的に被覆された領域にリダイレクトする。インターコンパートメント距離を小さくすることにより、それが単離または相互接続されたいずれかの神経回路を得ることができる。細胞生存を促進するために、細胞を培養皿の周囲に配置され、支持神経回路網と共培養する。基板埋め込みマイクロ電極アレイおよびカルシウムイメージングを使用することによってそれぞれ得られたモジュラーネットワークの活性の電気生理学的および光学的記録が提示されている。各モジュールはSPONTを示しているがaneousグローバル同期は、モジュール間の同期の発生は回路間の接続の密度によって調節される。

概要

実験と理論の証拠は、脳が一過お互い、シェーピング、基礎となる別の脳の状態と対話ダイナミック機能ユニットとみなすことができるセルアセンブリ^1-5、の協調活性化を介して動作している可能性を支持している。機能モジュール性にも依存すると脳回路^6,7の構造的なモジュラー組織に関連付けられている。どの機能と脳回路の構成は相互に形状がまだ神経科学の主要な未解決の問題の一つである。この問題のより深い理解を提供するために、それは対処することが可能であり、少なくとも部分的に、これらの問題に最適な実験的なフレームワークを同定することが重要である。 in vivo実験で神経回路網の時空間的動態の制御された操作が困難であるので、 インビトロでの神経回路網モデルの開発は、その容易なaccのに重要な関心事であるessibility、監視、操作とモデリング^8,9。近年では、高度な基板のパターニング方法でサポートされているインビトロの技術は、事前定義されたモジュラー構造体³の範囲を開発するために、神経細胞のネットワークを誘導し、課せられたトポロジ¹⁰とのネットワークの機能的特性を研究することができました。特に、本 ​​発明の方法は、最近、物理的な制約^を課すことにより^4,11ネットワークを編成するために使用された。実際に、神経回路網における構造と機能との間のリンクを研究し、ニューロンアセンブリを相互作用の簡略化したが、妥当な表現を提供するために、in vitro系は、相互接続された神経細胞の亜集団を提供するべきである。広く研究されている2D均質なニューロン培養は、回路の自己組織創発配線上の任意の空間的な制約を課さない。そのため人工的に相互接続された電池アセンブリを形成するための可能なアプローチは、スパッツの異なるニューロン集団を配置することであるially異なる領域。これらの領域間の距離は、インターアセンブリの接続を防ぐことはできません。このアプローチは、ネットワークの複雑性を超えるかなりの制御を確保しつつ、同期モデル^6,7,12の豊かなレパートリーを提供することが示されている。

モジュラー神経アセンブリの再現性の培養を容易にするために、軸索および樹状突起によって連結されたニューロンのクラスタにネットワークの自己組織化を組み立てるためのプロトコルを提示し、説明する。神経細胞培養の物理的閉じ込めのためのポリマー構造がpolydimtheylsiloxane（PDMS）から作成されました。 PDMSは広くガス¹³に、その生体適合性、透明性及び透過性のために、生物医学的用途に使用されるエラストマーである。 PDMSをスピンコートジャックらに以前に記載されている「マスター」に液体PDMSを¹⁶ Tによって2075 ^14,15の構造を作製し、マイクロマシンSU8から除外される彼は、異なるサイズの相互接続されたモジュールで構成され、それらが成功したカバーガラスと微小電極アレイ（MEAの^）17-20の両方で得られたパターン化された神経回路網を達成しました。モジュール間の接続の密度は、モジュール間の同期の過渡状態に、均一な培養の典型的な、完全に同期化ネットワークから、ネットワーク同期の機能を変更することができます。

プロトコル

手順は、実験動物の管理と使用に関するNI​​Hの基準に準拠して行われていたし、テルアビブ大学動物実験委員会（許可番号 - L-14から019）によって承認された。

楽器とPDMSの作製

1. ウェハ（ 材料の表を 、または微細加工研究室からウェハを注文）の準備、外科用メス、およびピンセット-殺菌は必要ありません。
2. 以下の条件に従って、ポリ-D-リジン（PDL）溶液を作る：4ミリグラム/ 0.1 Mホウ酸緩衝液中に加え、pHを8、店舗-20℃。
3. 以下の手順に従って、PDMSのステンシルを準備します。
   1. 10の割合と共にベースと硬化剤を混合することにより、ポリジメチルシロキサン（PDMS、シリコーンエラストマー）を調製：1、次に約5分間2物質をかき混ぜる。
   2. 15分間二回真空チャンバー内の各時間を置き、気泡がなくなっていることを確認します。
   3. いつガスの使用を可能にするオープン窒素ノブスピナー上のシリコンウェハ（ 図1A）を配置し、移動するのを防ぐために真空を使用しPDMSをスピンコーターを準備する、準備ができている。
   4. ウエハ上にPDMSを注ぎ、1000rpmで1分間スピナーをアクティブ（約100μm、高さが作成されます）。
   5. 30分間、100℃のホットプレート上でウェハを置きます。
   6. PDMSが硬化した場合には、パスツールピペットを用いて、PDMSとステンシルの国境を概説。 30分間、100℃のホットプレート上でウェハを置きます。
   7. PDMSの境界線が硬化したら、国境に応じてステンシルをカットし、ウエハからシリコンステンシルを剥離し、メスを使用します（単一のパターンを含む二乗PDMS）。

2.ペトリ皿とカバースリップの準備

1. 次の順序に従って、23ミリメートル角のガラスカバースリップを準備し、それらをきれいに：
   1. 蒸留水、70％エタノール、及びアセトンで洗浄する。
   2. 窒素でイソプロパノールと速乾性で洗うこと。
2. カバースリップ上にパターン化されたPDMSのステンシルを置き、優しく、彼らはしっかりとガラス表面に付着していることを確認するために押してください。 15分間の真空チャンバ内に配置する。
3. ステンシル上のPDLの1ミリリットルをドロップします。二回20分毎の時間のための真空チャンバー内にカバースリップを挿入し、乾燥させるために、PDL O / Nを残す。
4. 支持細胞のネットワークを作成するためにペトリ皿を準備します。
   1. RTで2時間PDL 1mlでディッシュ（3.5センチ）の表面を覆う。ピペットを用いてPDLドロップを削除します。
   2. 蒸留水で洗浄し、乾燥さのまま。カバースリップの各コーナーにシリコーングリースの非常に小さなドロップを置きます。
5. 添付ファイルを確認するために優しくペトリ皿（ すなわち、PDMSを上にする必要があります）、Enterキーを押しの中央にカバースリップを置きます。
6. 静かにピンセットを用いてカバースリップからPDMSを取り除く。殺菌のために、7分間UV照射にさらす。

ル "> 3。マルチ電極アレイ（MEA）の作製

1. この順序（ 材料の表 ）のクリーンMEA：
   1. 濃縮酵素の洗剤でタップし、超音波処理下に水で3回洗浄する。
   2. 蒸留水中で超音波処理3回。
   3. 30分間のUV下で3回と場所のために（フード、千μlの先端に）蒸留水で洗ってください。
2. ネットワークの準備をサポートする：
   1. 設計されたサポートネットワーク金型を準備します。
      1. 12ウェルプレート（直径22mm）にPDMSを注ぐ。
      2. PDMSが硬化されると、金型を取り出し、メスを用いて、リング状を作成するために真ん中に穴をカット。
      3. MEA（ 図2A）の中心に設計されたサポートネットワーク型を置き、室温で2時間、PDLで表面の残りの部分をカバーしています。
   2. ピペットを用いてPDLを削除し、蒸留水で洗浄する。
   3. 金型を外し、（ 図2A）を乾燥させるために残す。
3. 以下の方法でMEAにステンシルを揃える：
   1. 指定されたマイクロマニピュレータにステンシルを置きます。正確に電極にパターン化された構造を合わせ、そしてそれは、MEA面（ 図2B）上に置かれるまで、ステンシルを下げるために倒立顕微鏡を使用してください。
      注：よく洗浄MEAとの接触は、PDMSとMEA自体の間で競争力のある接着性を提供します。
   2. マイクロマニピュレーターを持ち上げ、必要に応じて、それはMEAから取り外し防ぐために、PDMSの上に少量の圧力を適用するためにピンセットを使用しています。
   3. 静かにMEA表面にステンシルを押して、それがしっかりと取り付けられており、十分に整列されていることを確認するために顕微鏡を使用しています。 （ 図2C、D）。
4. 15分間の真空チャンバ内にMEAを配置する。ステンシル上のPDLの1ミリリットル降下を置く。
5. 真空チャンバ内に20分間ずつ2回を挿入します。インキュベーター内でO / Nを乾燥させるために、PDLのままにしておきます。
6. メッキ前に、多国間環境協定からPDMSのステンシルを削除し、wは、滅菌使用して洗う試合開始。 7分間UV照明の下に配置します。

4.解剖と文化

1. ヘルツォークら 2011 ²¹で説明したように文化を準備します。

5.めっき

1. （結果で述べたように、回路の大きさに応じて最適な濃度）を、血球計数器を用いて、めっきに必要な細胞の数を計算する。
   1. （きれいにアルコールを使用）、計数室（血球計）がクリーンであることを確認し、その上にカバースリップを配置。
   2. 培地（希釈1:20）メッキの190μlの細胞懸濁液10μlを希釈する。
   3. 負荷希釈した細胞の10μlの計数チャンバーの端の上にゆっくりとチャンバーがそれ自体を充填することができた細胞をピペット。
   4. 倒立顕微鏡を用いて、血球計算グリッドを視覚化。 （健康な細胞がラウンドであるべき）直接計数によってチャンバ内のセルの数を決定します。大きな正方形コーティングしていない内のセルを数えるエッジを横切るものをUT。
   5. 細胞の濃度を計算する。
      細胞/ 1000 10 ^4×希釈係数×カウントμL=総細胞（血球計の面積）の合計数。
      注：例えば、希釈倍率が20であり、計数した全細胞は100であった場合。
      100×20×10 ⁴ = 0.1×10 ⁷細胞/ 1,000μlの1×10 ⁶ /100μlの。 0.75×10 ⁶細胞をプレーするためには、細胞外に75μlのを取る。
2. 単一のMEAまたはペトリ皿当たりめっきに必要な細胞の数を取る凝集を防止するために細胞を再懸濁し、そしてpatternate領域の上に、中央にそれらをプレート（必要であれば、それは培地で細胞を希釈することが可能である） 。 MEAの場合、途中で100μlの低下を置く。カバースリップの場合は、途中で千μlの低下を置く。
3. 40分間37℃で平板培養した細胞をインキュベートします。 1まで、播種した細胞をプレーティング培地を追加MEAあたりミリリットル、カバースリップあたり2ミリリットル。
4. 37℃で維持し、4日ごとに、0.5ペニシリン - ストレプトマイシン、2％B-27及び0.75％グルタマックスに富む新鮮な増殖培地で希釈する。
5. DIV 6/7からは、島々の間の接続を見た後、10μL/ mlのFUDR（25 mgのデオキシウリジン+ 62.5 mgの12.5ミリリットルMEM（最小必須培地イーグル）におけるウリジン）またはグリアを防ぐために、他の抗有糸分裂剤を含む培地を希釈異常増殖。

結果

約100μmの特徴厚さを有するシリコンウェハ上SU8-2075モールドはPDMSを成形するために使用した。パターンは、辺長との距離は200との間に700ミクロン（ 図1B）を変化させて、いくつかの寸法の正方形で構成された。正方形のサイズは（辺の長さ<800ミクロンとの島々のための）10Xのと（辺の長さ<400ミクロンとの島々のための）20Xの目的の視野に合うように選ばれました。三つのパラメータ、すなわち、細胞播種密度、回路間の距離が、回路は「サイズが単層またはクラスタ化された回路を取得するだけでなく、その接続性を課すと整形するための決定要因である。しかしながら、これらのパラメータは、それらが自然に回路」サイズとの接続の増加を確立する確率、2つの回路間の固定距離を考えると、以降独立していない。 〜300×300μmの小さなニューロンのモジュール、接続のために、この作品で説明した例では、距離は〜300より大きくはなかったときに確立された - 400μmの間に〜700の大ニューロンのモジュール用X 700程度、距離は〜700μmのより小さかったとき、接続が確立された。一般的には、正方形の間の距離を...

ディスカッション

機能的に相互接続された回路からなる、in vitroでの2Dモジュラー神経ネットワークを成長させるためのプロトコルについて説明する。手順は、細胞の接着層をパターニングに基づいています。パターニングは、所望のネットワーク·アーキテクチャの負の特徴を再現するPDMSのステンシルを用いて達成される。 PDMSのステンシルは、細胞接着層が​​堆積される領域を定義する。細胞がメッキされていると、それらは自然発生的にコーティングされた島々に集合し、アクティブインター接続された回路に自己組織化する。 MEAのカルシウムイメージングを使用して記録機能的モジュラーネットワークの録音を提示した。

提示プロトコルは、正式に最初に続く手順に比べて変更されています。まず、PDMSステンシル」アラインメントの問題が対処されなければならなかった。アライメントが最初の試み（ステンシルが表面に触れた後、それはそれを再配置することは推奨されません）で達成する必要があるため、この問題が克服されている手動の手順を放棄し、MEAの記録領域上の正確なステンシル蒸着用マイクロマニピュレータを使用することからな...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
PDMS, Sylgard 184	Dow Corning
Nalgene 真空チャンバー	Thermo	5305-0609
Poly-D-lysine PDL	Sigma	P7886
シリコーングリース - SILICAID 1010	aidchim Ltd	H3375
スピンコーター	Laurell - Technologies Corporation	WS-650-23
12ウェル培養プレート	シグマ	CLS3336
5-フルオロ-2'-デオキシウリジン	シグマ	F0503
ウリジン	シグマ	U3003
MEA1060-INV-BC	マルチチャネル システム
TC02	マルチ チャネル システム
ペン連鎖球菌	生物産業 ベイト ヘメク	03-033-1c
B-27	Gibco	17504044
glutaMAX	Gibco	35050-038
MEM 最小必須 Medium-Eagle	Biological Industries Beit Haemek	01-025-1B
Micro Electrode Arrays 4Q	Multi Channel Systems	60-4QMEA1000iR-Ti-PR	クリーニング マニュアル: http://www.multichannelsystems.com
シリコンウェーハ	microchem	SU8-2075	準備プロトコル:http://www.microchem.com