三次元の全層皮膚等価物と自動傷つけ処理の発生

サマリー

このプロトコルの目標は、自然な肌に似た3次元の全厚の皮膚等価物を構築することです。特別に構築された自動創傷装置により、無菌状態を維持しながら、正確で再現性のある創傷を生成することができます。

要約

in vitroモデルは、皮膚の創傷治癒過程を研究するための費用対効果が高く倫理的な代替手段です。さらに、ヒト細胞を用いることで、これらのモデルは動物モデルよりもヒトの創傷状況をよりよく反映しています。細胞の遊走や増殖などのプロセスを調べるために2次元モデルが広く使用されていますが、創傷治癒についてより深い知識を得るためには、より複雑なモデルが必要です。適切なモデルシステムに加えて、正確で再現性のある創傷の生成は、異なるテストラン間で比較可能な結果を確保するために重要です。この研究では、創傷治癒の研究と同等の3次元の全層皮膚の生成が示されています。モデルの真皮部分は、ラットテールコラーゲンI型ハイドロゲルに埋め込まれたヒト真皮線維芽細胞で構成されています。ヒト表皮ケラチノサイトへの接種と、その結果としての気液界面での培養に続いて、モデルの上に多層の表皮が形成されます。創傷治癒過程を研究するために、無菌雰囲気で標準化された創傷を生成する自動創傷装置を追加開発しました。

概要

皮膚は体の最大の器官である。これは、外部環境と内部器官の間の障壁を作成します。さらに、皮膚は、流体損失、環境の影響、傷害および感染から身体を保護し、体温^1を調節するのに役立つ。 、その暴露の場所に、皮膚は、多くの場合、機械的、熱的または化学的な外傷の影響を受けます。皮膚の自己修復が可能な一般的であるが、そのような感染症、酸素、および静脈充足などの複数の局所因子は、創傷治癒障害をもたらすことができる。創傷治癒はまた、肥満、アルコール依存症、喫煙、薬物療法、栄養、糖尿病などの疾患などの全身的な要因によって干渉することができます^。2

（i）の炎症段階、（ii）の増殖および（iii）リモデリング段階：創傷治癒の過程は3段階に分けることができる。皮膚への損傷時には、複雑な信号カスケードは、傷の閉鎖につながる、開始します^。3損傷後、創傷は出血し、血餅が形成される。線維芽細胞は、血液凝固に移動し、その後年間で改装された新しい組織と交換してください。

皮膚の修復の基礎となる生物学的プロセスの現在の理解は限られている。小動物およびブタモデルは創傷治癒を研究するために使用されてきた。しかし、これらの結果は、直接に種特異的な違いに起因するヒトに転送することができない。これらのin vivoモデルに加えて、創傷治癒のいくつかの側面は、不死化細胞株または初代細胞に基づくin vitroで単層培養物のスクラッチを介して、創傷の状況をシミュレートすることによって調べることができる⁴これらのスクラッチモデルは高度に標準化されているが、十分に反映していない複合体のin vivo生理学⁵の二次元モデルの他には、三次元のヒト皮膚同等物は、皮膚科学研究のために開発されている。これらのモデルの皮膚部分は、葛ある脱細胞化真皮^、6コラーゲンハイドロゲル^、7,8グリコサミノグリカン⁹または合成材料を含む様々な足場を使用して^nerated。10これらの皮膚同等物、上皮間葉相互作用¹¹の役割、再上皮、線維芽細胞およびケラチノサイトの間に細胞のクロストークや採用異なる成長因子の影響を研究することができる。さらに、これらのモデルは、線維芽細胞が創傷領域内に移動し、どのように走化性因子は、組織再生にどのように影響するかについての新しい知識を得るために有用である^。12

創傷治癒モデル自体の唯一ではない世代は挑戦的であるだけでなく、モデル性の高い標準化された傷を確立することは問題がある。傷を作成するための一般的な技術は、スクラッチテスト^、13火傷^、14テープ摩耗^、15熱傷^、16吸引水疱^、17液体窒素^、18レーザー^、19アールメス^、18メッシャー⁶と生検パンチ^。20これらのメソッドのほとんどは、同じ落とし穴を持っている。手動で実装けがを標準化し、複数のテストの間で再現することが困難である。サイズ、形状、および傷の深さは、研究の間で変化するので、研究データの品質を損なう。定義された皮膚の創傷のためのレーザーの使用は、比較的容易に標準化されたが、火傷を模倣する状況をもたらすことができる。レーザーによって加えられた熱は、壊死組織につながることができ、タンパク質の変性、血小板の凝集や血管収縮を引き起こす可能性があります。

別のアプローチでは、我々は、私たちは、無菌条件下で定義されており、正確な皮膚創傷を生成することができ、自動化創傷デバイス（AWD）を、開発しました。浸透深さと速度のようなパラメータを創傷ならびにドリルヘッドの回転を規制することができる。本研究では、家の中で開発された全層皮膚等価物とAWDを組み合わせた（FTGangatirkar らによって公開プロトコルに匹敵する^SE）。8皮膚同等物の真皮層は、I型コラーゲンは、ヒドロゲルに埋め込 ​​まれたヒト皮膚線維芽細胞（HDF）、から構成されている。真皮層の上に、ヒト表皮ケラチノサイト（HEK）は播種。二週間以内に、気液界面でのHEKは、いくつかの重要な細胞層からなる表皮と角質層を構築する。このモデルの生成に加えて、本研究では、FTSEで定義され、正確な傷を作成するためのAWDの使用を示している。

プロトコル

注：プロトコルは24全層皮膚同等物の生産のために設計されている。ヒト皮膚線維芽細胞と表皮角化細胞は、以前に公開されたプロトコルに従って、皮膚生検から単離した^。21,22インフォームドコンセントが事前に得られたものであり、研究はユリウスマクシミリアン大学ヴュルツブルクの人間研究に制度的倫理委員会によって承認された（182投票/ 10）。

皮膚コンポーネントの1。生産

1. を6mg / mlの最終濃度まで0.1％酢酸を有するコラーゲンを溶解する。ゲル中和溶液は、232.5ミリリットル2回DMEM、7.5ミリリットルのウシ胎児血清、7.5ミリリットル3 M HEPES、2.5ミリリットルコンドロイチン硫酸（5ミリグラム/ ml）を混合する。氷の上でゲル中和溶液とコラーゲン溶液を保管してください。挿入/肌当量当たりゲルの500μlのを計算します。
   NOTE：ゲル中和溶液は、コラーゲン溶液のprepaの2つの部分と混合されるようにコラーゲンの倍の量の再。
2. 24ウェルプレートに24のインサートを置きます。
3. 10ミリリットルDMEM、270×gで5分間遠心分離器でヒト皮膚線維芽細胞（HDF）を再懸濁し、細胞を数える。 G X 270で5分間に必要なHDFの量（500μlのコラーゲンゲルあたり5×10 ⁴細胞）と遠心細胞を抽出します。
4. 上清を除去し、慎重に気泡を発生させずに、ゲル中和液を冷却して4ミリリットルでHDFを懸濁します。このステップから、コラーゲンゲルの早期凝固を避けるために、可能な限り高速に動作することを確認してください。
5. コラーゲン溶液8mlの溶液を再懸濁する。
6. マルチステップ·ピペットでコラーゲン - 細胞混合物を取り、各挿入で急速混合物500μlのを埋める。ゲルをゼリー状にするために、インキュベーター（37℃、5％CO _2）中で20分間ゲルをインキュベートする。
7. ウェル当たり2ミリリットルダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）+ 10％ウシ胎児血清（FCS）でゲルを沈めるインキュベーター（37℃、5％CO _2）で24時間静置する。

ヒト表皮ケラチノサイト（HEK）2.追加

1. 24時間後に培地を除去します。を50μg/ mlの最終濃度になるように超純水でフィブロネクチンヒトタンパ​​ク質を溶解する。フィブロネクチン溶液25μlの各真皮同等物をカバーしています。インキュベーター（37℃、5％CO _2）中で30分間ゲルをインキュベートする。
2. その間、10mlのKGM-2でHEKを再懸濁し、KGM-2 5 +準備％FCSで1×10 ⁶細胞/ mlに細胞濃度を設定する。各ゲル上の種子1×10 ⁵ HEK。細胞が付着できるように、インキュベーター（37℃、5％CO _2）中で45分間ゲルをインキュベートする。
3. インキュベーター（37℃、5％CO _2）中で、5％FCS +準備し、培養それらKGM-2を有するゲルを沈める。

全層皮膚等価物の3.文化（FTSE）

1. 6-7日間培養しFTSEFCS濃度（5％、2％、および0％FCS）降順。次に低いFCS濃度が2〜3日ごとに培地を変更します。このために、完全に培地を除去し、新鮮な培地の1.6ミリリットルを追加します。
2. 7日目に、完全培地を除去。
   注：そうしながら、ピペットの先端でFTSE表面に触れないでください。
3. 滅菌ピンセットで6ウェルプレートの1ウェルに挿入するたびに配置します。 FTSE表面を濡らしていないことを確認、ウェル当たり1.5ミリリットル空輸媒体を追加します。さらに14日間、2〜3日ごとに培地を変更します。
   注：メディアの充填レベルは、FTSEのメニスカスまでです。

4.組織学的分析

1. 固定し、FTSEのパラフィン包埋
   1. 培地を除去、新鮮な24ウェルプレートにインサートを転送し、各ウェルに、4％パラホルムアルデヒド、1.6を加えて組織を固定し、室温で2時間、組織をインキュベートする。注意！パラホルムアルデヒドは、ヒュームフードの下で操作し、有毒である。転送組織埋め込みカセットにFTSE。水で洗浄することにより、残りの固定液を除去し、昇順エタノール濃度を用いて組織を脱水。
   2. 真ん中の縦のカットによる皮膚同等物を分割します。下向きに切断面を持つパラフィン充填金属ベース金型に2枚を配置します。バッキングとして金型の上に組織カセットを追加します。
   3. 適切な顕微鏡スライド上にスライドマウント、3-5程度のスライスをカットし、straitening、40℃の水浴上でそれらをフロート。徹底的に乾燥スライス。
2. ヘマトキシリン​​＆エオシン（H＆E）および免疫組織化学（IHC）染色
   1. 場所は、ラックに挿入し、60℃で1時間インキュベートする。パラフィンが溶融していることを確認します。ステインは、標準化された概要染色などのH＆Eとのスライスを再水和。
   2. H＆E染色のために50％エタノール、4倍の脱イオン水、1×ヘマトキシリン​​、1×塩酸、電子を1倍、エタノールで2回、エタノールで3回、キシロールで70％96％4倍ガラス染色キュベットを準備thanol（13.7ミリリットル1 MのHCl広告200ミリリットルの50％エタノール）、1×タブ水、1×エオシン及び2×2プロパノール（100ミリリットルの脱イオン水中1グラムのエオシン）。
   3. 場所はスライドを脱パラフィンし、再水和するキシロールIIにキシロールIおよび10分で10分をスライド。ディップは、エタノール50％エタノール70％、3回で3回、エタノールでエタノール96％I、3回で96％IIを3回スライドさせる。脱イオン水でスライドを回転させます。ヘマトキシリン​​染料を区別するために、塩酸 - エタノールで2倍を浸し。脱イオン水ですすいでください。ブルーイングのために、場所は、タブの水に5分をスライド。エオシン染色のために、場所はエオシンで1分をスライドし、脱イオン水で、その後洗い流してください。脱水、ディップスライドはエタノール96％エタノール中で70％、2×2×2-プロパノールII中で5分間、2プロパノールI中で5分間に置き、キシロール中で5分間IキシロールIIで5分。 H＆E染色した後、細胞核が赤く染色される青色、細胞質と細胞外マトリックスに染色される。
   4. 抗原回復のために、キシレンでパラフィンを除去し、染色のためのスライスを再水和。スライスを配置スチームクッカーでと、予熱した10 mMのクエン酸緩衝液（pH 6）で20分間脱パラフィンし、再水和のスライスを調理。
   5. 撥液性スライドマーカーペンまたはダイヤモンド針を有する洗浄緩衝液の代わりスライド（PBS緩衝液+ 0.5％ポリソルベート20）、円スライス。
   6. 湿気チャンバー内でスライドを置きます。各スライスに100μlの3％過酸化水素溶液を添加することにより、内因性ペルオキシダーゼをブロックする。注意！皮膚や眼への接触の場合は非常に危険な。個人用保護具を取り扱ってください。洗浄は、洗浄緩衝液中でスライドする。
   7. 一次抗体を適用し、室温で1時間インキュベートする。洗浄は、洗浄緩衝液で3回スライドさせる。ここから先、サンプルは暗所に保管する必要があります。
   8. 特異的な抗原 - 抗体結合の検出のためにビオチン - ストレプトアビジンの検出システムを使用する。
   9. 1分間ヘマトキシリン​​で核を対比。スライドを脱水し、マウントします。
   10. 逆顕微鏡を用いた画像のサンプル。

5。自動化された創傷装置を用いて損傷（AWD）

1. 70％エタノールおよび紫外光で作業領域を消毒することでAWDを準備します。目的のサイズ（ 例えば、1ミリメートル）のドリルヘッドが装着されていることを確認します。
2. 滅菌ピンセットを用いて、オートクレーブ処理サンプルキャリアプレートの指定された領域に皮膚等価物を置きます。ドリルヘッド下のソケットにサンプルキャリアプレートを置きます。
3. スピン速度：次のように創傷のパラメータを設定する制御ソフトウェアを使用して、15,000 rpmでの、浸透：1.5ミリメートル。推進：100ヘルツ。これらのパラメータは、個別に各サンプルタイプのために定義される必要がある。 AWDに創傷パラメータを転送します。
4. 手続きが負傷開始します。ソケットからサンプルキャリアプレートを取り外します。転送には、滅菌ピンセットを用いて培養に用いるインサートに戻すFTSEを負傷した。
5. 再生の調査のためのインキュベーター（37℃、5％のCO _2）で負傷FTSEの文化に進みます。アルternatively、任意の時点で、組織学的分析のためのモデルを使用しています。

結果

孤立したHDFとHEKは、形態で、典型的なマーカーの発現の両方で異なっている。 HEKの形態は敷石状形態によって説明することができるのに対し、HDFは、典型的な紡錘状の形態を示した。細胞は、FTSEのためにそれらを使用する前に、免疫組織化学的染色（ 図1）によって特徴付けられた。 HDFは、線維芽細胞のマーカーであるビメンチン（ 図1A）に陽性である。主要HEKは非常初期分化タンパク質、サイトケラチン14（ 図1B）が、ほぼ無後期ケラチノサイト分化タンパク質、サイトケラチン10（ 図1C）を発現する。

初代培養の後、我々は、細胞培養フラスコから細胞を剥がし、FTSEの生成のためにそれらを使用する。 FTSEは気液界面（ 図2B）で14日間培養したsubmers培地条件（ 図2A）の下で7日間培養した。このプロセス中、fはかなり東証契約。 21日以内にHEKは（ 図2...

ディスカッション

インビトロで細胞は通常、細胞がプラスチック表面に付着した二次元細胞培養物中で増殖させる。しかしながら、これらの培養条件は、細胞が生体内で成長する生理学的三次元の条件を反映していない。三次元の条件の下では、細胞は、天然の細胞 - 細胞および細胞 - マトリックスの添付ファイルを形成することができ、三次元に遊走する。特にin vivoでの状況の類似治癒皮膚創傷における細胞遊走及びマトリックスの生成は、創傷治癒の重要な要素であるように、意味のあるデータを生成することが極めて重要である。

これらの条件を模倣するために、我々は、ヒト初代細胞で構成され、皮膚および皮膚の表皮層の両方を反映していることFTSEを開発した。空気-液体界面での培養の2週間、HEK、異なる分化段階でケラチノサイトのいくつかの層から成る表皮と角質層を形成する。 Furthermore、真皮層は、I型コラーゲンは、ヒドロゲル中に埋め込まれているHDF、から構成されている。培養時間の間、HDFは、モデル（ 図2B）の有...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
トリプシンEDTA(1:250)0.5%DPBS	PAA	L11-003	0.05%
ダルベッコs リン酸緩衝生理食塩水	Sigma	D8537
コラーゲン (0.1% 酢酸で 6 mg/ml)	Produced in house
フィブロネクチン ヒトタンパク質、血漿 (50 &マイクロ;g / ml)	Life Technologies	33016-015
	Nunc	140627
6ウェルプレート	Nunc	140685
24ウェルプレート	Nunc	142485
顕微鏡スライド	R. Langenbrinck	03-0070<
>DMEM, high glucose	Life Technologies	11965-092	89% (445 ml)
ウシ胎児血清	バイオ &FCSを売る	。ADD.0500	10% (50 ml)
ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/ml)	Life Technologies	15140-122	1% (5 ml)
Keratinozyten 培養培地 (500 ml):
Keratinocyte Growth Medium 2	Promocell	C-20111	89% (445 ml)
ケラチノサイト増殖培地 2 サプリメントパック	プロモセル	C-39011
ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/ml)	Life Technologies	15140-122	1% (5 ml)
Gel neutralization solution (250 ml):
>Dulbecco's Modified Eagle Medium, high Glucose Powder with L-Glutamine		PAA G0001,3010	93% (232.5 ml)
サメ軟骨由来のコンドロイチン硫酸ナトリウム塩	Sigma	C4384-1g	1% (2.5 ml)
ウシ胎児血清	バイオ &FCSを売る	。ADD.0500	3% (7.5 ml)
HEPES	Sigma	H3375-1kg	3% (7.5 ml)
Skin model submers medium (500 ml):
>ケラチノサイト増殖培地2	プロモセル	C-20111
ケラチノサイト増殖培地2 サプリメントパック	プロモセル	C-39011
子牛胎児血清	Bio &FCSを売る	。ADD.0500	5%-2% (25 ml-10 ml)
ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/ml)	Life Technologies	15140-122	1% (5 ml)
Skin model air-liquid interface medium (500 ml):
>Keratinocyte Growth Medium 2
Growth Medium 2 Supplement Pack	Promocell	C-39011	のみを追加:インスリン、ヒドロコルチゾン、エピネフリン、トランスフェリン、CaCl<サブ>2
ペニシリン-ストレプトマイシン(10,000 U / ml)	Life Technologies	15140-122	1%(5 ml)
CaCl2(300 mM)	Sigma	C7902-500g	0.62% (3.1 ml)
Histology:
>IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP	DCS	PD000KIT
Vimentin antibody	Abcam	ab92547
CK14 antibody	Sigma	HPA023040-100µl
CK10抗体	Dako	M7002
Filaggrin 抗体	Abcam	ab81468
H&E染色:
メイヤー´s Haemalaun	AppliChem	A0884,2500
キシロール	シグマ Aldrich	296325-4X2L
エタノール	Σ Aldrich	32205-4X2.5L
HCl Σ	Aldrich	H1758-500ML
Eosin	Sigma Aldrich	E4009-5G
2-Propanolol	Σ Aldrich	I9516-500ML
取付ミディア	シグマ アルドリッチ	M1289-10ML