ヒト乳癌組織および細胞株からマンモスフェア形成アッセイ

サマリー

フローティングマンモスフィアアッセイは、マウスに移植すると懸濁状態で生存し、腫瘍形成が促進される幹様乳がん細胞のサブセットを調査することができます。 このプロトコルは、in vivo腫瘍形成の代理である球形成能力の便利なin vitro測定を提供すると同時に、幹関連転写ランドスケープの分析を容易にします。

要約

より分化した子孫を生じることながら健康な組織に似ては、多くの血液および固形の悪性腫瘍は、現在、自己再生幹様癌細胞のサブセットで、階層的に組織化されると考えられている。非幹腫瘍の大きさと比較して強化された化学療法および放射線抵抗性を有することが、乳癌、これらの癌幹細胞を標的と理解とは、重要な研究分野となっている。マンモスフェアアッセイはまた、広く遡及sphere-を同定する能力について用いられるようになっている：CD44、CD24、およびALDH活性を含むマーカーは、将来に向かって、免疫不全マウスに移植したときに増強された腫瘍形成性を示す細胞を単離するために蛍光活性化細胞選別（FACS）を用いて評価することができる単一の幹細胞様のクローンから発生セルを形成する。ここでは、適切な細胞株または一次患者サンプルからマンモスフィアの培養、彼らの継代、及び球体Fを推定する計算のためのアプローチを概説orming効率（SFE）。まず、適切な計画とマンモスフェア実験の解釈の重要な考慮事項と落とし穴を議論する。

概要

幹様がん幹細胞が率いる腫瘍細胞系列の存在が大幅に腫瘍の不均一性の我々の理解に追加されました。腫瘍におけるいくつかの表現型の多様性は遺伝的に異なるクローンのクローンの成長から生じませんが、かなりのコンポーネントは、エピジェネティックな違いに起因すると表示されます。癌細胞は、特定の遺伝子の活性化または抑制を経由して幹、前駆、および分化した状態の間で（時には可逆的に）遷移することができる表現のプログラム^1から3。これは、現在調節因子を提供する隣接癌、間質、または免疫細胞の傍分泌シグナル伝達と関連して、その結果自己分泌シグナル伝達を細胞内で発現された遺伝子発現プログラムを反映して、細胞内因性または外因性の要因を反映して、そのようなの程度microenviromental条件よい低酸素症^2,4,5。

革新的な系統は、アプローチをトレースするが、それらのインビボニッチ⁶で推定される癌幹細胞を研究する当社の能力進めています^{- 8、}球形成アッセイは、少なくとも使用されるアッセイ条件下では、幹細胞のように振る舞うように乳癌細胞」の可能性を推定するための普及した、便利なアプローチのまま。これは、しばしば膜マーカーCD44およびCD24 ^9、及び酵素ALDH（アルデヒドデヒドロゲナーゼ^）10の活性レベルの発現によって精製癌幹細胞について遡及的な方法は....

プロトコル

以下の手順では、倫理的にインペリアル·カレッジ、ロンドンによって承認されている。

ヒト乳癌細胞株からの一次マンモスフィアの1世代

注：無菌培養フードの下で、次の手順を実行します。

1. マンモスフェアメディア2mMのL-グルタミン、100 U / mlペニシリン、100 U / mlストレプトマイシンを補充したDMEM / F12を含む準備する。 、10ng / mlの組換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF; R＆D Systems社）及び1×B27サプリメント、20ng / mlの組換えヒト上皮細胞増殖因子（シグマEGF）を添加することによって使用直前に完全培地を調製する。
2. 接着性のMCF-7またはMDA-MB-231細胞（または任意の乳癌細胞株; 70〜80％コンフルエンス）を含むフラスコから培地を吸引除去は、1×PBSで2回洗浄し、細胞をトリプシン処理。
3. 5分間室温で200×gで遠心分離細胞。マンモスフェアメディア1-5 mlの上清と再懸濁細胞をデカントします。ピペット40μmのセルストレーナーキャップフィルタ上下に、必要に使用した場合、単一細胞懸濁液を得た。単一細胞懸濁液が形成された（ない場合は、3回まで細胞懸濁液を注射器25 G針を使用）していることを確認するために血球計数器を使用してください。
4. FACS経由必要な分離株のCD44 + ....

結果

異なるサンプルまたは異なる処理を施したものは播種初期セルに対して正規化した後に形成マンモスフィア>40μmの数が変化してもよい。三重で成長し、各治療のためにマンモスフェア形成効率（MFE）を計算します。これは、異なる播種密度を用いた実験を比較することを可能にする。データは、最高の理想的な陽性および陰性対照を、棒グラフに表示し、三つ組のウェルで標準偏差を表示している。一貫して60〜80％コンフルエンスの間に非接着性プレートに付着細胞を移す。慎重な細胞計数は正確に治療の効果を定量化することが不可欠である。この重要なステップはよく同じ処理とは別に、複数の懸濁液を調製することにより、検索結果に寄与している変動率を推定します。測定される細胞濃度が同じウェルと著しく異なる場合には、（ 図2）を計数アプローチを精製考える。

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ディスカッション

プライマリとセカンダリのマンモスフィアの成功評価は、マンモスフィアは、最小限の球凝集に、単一のクローンから形成する十分に低い密度でメッキされる細胞に依存しています。しかし低すぎる密度で、数が少なすぎるマンモスフィアは、統計学的治療の効果を区別するために形成することができる。播種密度は、彼らは彼らの球の形成効率が大幅に変化することができるので、使用される各細胞株について最適化する必要があります（低E-カドヘリンを発現するものが少なく安定しており、短期のマンモスフェア培養^18を形成することができる）。この最適化段階は、単一細胞のクローン成長からほとんどのプライマリとセカンダリの球形成の結果を確認する必要があります。ウェルごとに1つの細胞をプレーティングすることは、完全にクローンマンモスフェア形成を確実にする唯一の方法であり、新たに得られた試料¹³の自己再生/分化率を定量化するために推奨することができる。しかし、このアプローチは、複雑な要因に苦しんでいる：マンモスフェアが形成1％の効率は、96ウェルプレートあたり単一マンモスフェアが得られると、効率が懸濁された細胞間のシグナリングパラクリン成長因子の.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
DMEM/F12	ロンザ	CC-3151
2 mM L-グルタミン	Sigma アルドリッチ	G8540
100 U/ml ペニシリン &ストレプトマイシン	Sigma Aldrich	P4083
20 ng/ml 組換えヒト上皮成長因子 (EGF)	Sigma Aldrich	E9644
20 ng/ml 組換えヒト塩基性線維芽細胞成長因子 (bFGF)	R&D systems	233-FB-025
1x B27 supplement	Invitrogen	17504-044
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)	Thermo Scientific	12399902
0.5% トリプシン/0.2% EDTA	Sigma Aldrich	59418C
子牛胎児血清	First Link UK	02-00-850
トリパンブルー	Sigma Aldrich	93595
低アタッチメント6ウェルプレート	コーニング	CLS3814
コラゲナーゼ1A型	Sigma Aldrich	C9891
ヒアルロニダーゼ	Sigma Aldrich	H3506
滅菌カミソリの刃	Fisher Scientific	12443170
滅菌	Fisher Scientific	11758353
滅菌マイクロ解剖はさみ	シグマアルドリッチ	S3146

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