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方法論記事

乳癌細胞における腫瘍形成の阻害剤を同定するための軟寒天コロニー形成アッセイの活用

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DOI：

10.3791/52727

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2015年5月20日

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1Department of Baker Institute for Animal Health, Cornell University, 2Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University, 3Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, University of Massachusetts Medical School

この記事について

サマリー

ここでは、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ(PADI)酵素阻害剤であるBB-Cl-アミジンがin vitroで乳がんの腫瘍形成性に及ぼす影響をテストするための軟寒天コロニー形成アッセイの使用を文書化しています。

要約

>jove_content<生体内での腫瘍進行のメカニズムを調査することの本質的な困難さを考えると、半固体マトリックス中で細胞が増殖する能力を測定する軟寒天コロニー形成アッセイ(以下、軟寒天アッセイと呼ぶ)のような細胞ベースのアッセイは、依然として癌研究の特徴です。この手法が従来の2D単層または3Dスフェロイド細胞培養アッセイと比較した場合の主な利点は、3D細胞環境がin vivoで見られる環境とほぼ同じであることです。重要なことに、軟寒天アッセイは、新規化合物や治療条件が細胞の増殖と遊走に及ぼす影響を厳密に試験するための理想的なツールも提供します。さらに、このアッセイは、遺伝的摂動の文脈における細胞形質転換の可能性を定量的に評価することを可能にします。私たちは最近、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ2(PADI2)を潜在的な乳がんバイオマーカーおよび治療標的として特定しました。ここでは、PADI阻害剤であるBB-Cl-アミジン(BB-CLA)がヒト上皮内がん(MCF10DCIS)細胞の腫瘍原性に及ぼす影響を試験することにより、前臨床の抗がん研究における軟寒天アッセイの有用性を強調します。

概要

非形質転換(正常)細胞と形質転換細胞の両方が、2D単層培養で容易に増殖することができます。この形態の接着性細胞増殖は、分裂促進刺激がない場合、細胞が微小環境内で急速に分裂しないことが多いin vivoで起こるものとはまったく異なります。一方、軟寒天アッセイは、半固体アガロースゲル1内の懸濁液中で細胞が増殖してコロニーを形成する能力を測定することにより、腫瘍原性を定量化するため、2D培養システムとは異なります。この設定では、形質転換されていない細胞は、細胞外マトリックス(ECM)への固定がないと急速に増殖することができず、アポトーシス(アノイキスとして知られるプロセス)を受けることができません。対照的に、悪性形質転換を受けた細胞は、ホスファチジルイノシトール3-キナーゼ(PI3K)/AktやRac/Cdc42/PAKなどのシグナル伝達経路の活性化により、足場依存性を失います。したがって、これらの細胞は、半固体の軟寒天マトリックス2内で増殖し、コロニーを形成することができる。

軟寒天アッセイの一般的な使用法は、PADI阻害剤などの特定の化合物がin vitroで腫瘍の成長を抑制できるかどうかをテストすることです。一般に、コロニー数またはコロニーサイズは、アッセイからの定量的な読み出しであり、対照群と治療群の間で比較して、細胞腫瘍形成性の違いを評価できます。したがって、コロニー形成が薬物濃度の増加と逆相関していることがわかれば、その薬物はin vitroでの腫瘍原性の効果的な阻害剤であるという結論を導き出すことができます。一方、薬物がコロニー形成に影響を及ぼさない場合、その薬物は適切な投与量でないか、または有効な腫瘍形成阻害剤ではありません。このアッセイは、ソフト寒天アッセイを使用して薬物の抗腫瘍効果をテストするだけでなく、特定の遺伝子と腫瘍形成との関係を調べるためにも使用できます。例えば、PADI2の発現を抑制する腫瘍形成性への影響は、PADI2特異的なsiRNA処理によって対処することができます。

PADIsは、シトルリン化または脱イミン化として知られるプロセスで、正に帯電したアルギニン残基を中性に帯電したシトルリンに変換することにより、タンパク質を翻訳後修飾するカルシウム依存性酵素です3-5。私たちは最近、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ2(PADI2)が新規の乳がんバイオマーカーとして機能する可能性があること、およびPADI阻害剤が早期乳がんの候補となる治療法であることを発見しました6。例えば、我々は以前に、「pan-PADI」阻害剤であるCl-アミジンが2次元単分子膜を用いて乳がん細胞の増殖を抑制し、この阻害剤が3次元腫瘍スフェロイドの増殖を抑制することを実証した6。このレポートでは、これらの研究を拡張し、新しいPADI阻害剤であるBB-CLAがMCF10DCIS乳がんコロニーの増殖を抑制する有効性をテストすることにより、軟寒天アッセイの有用性を強調します7。この実験にMCF10DCIS細胞を使用したのは、それらが非形質転換ヒトMCF10A細胞の発がん性誘導体であり、PADI2タンパク質8の定常状態レベルが高いためです。私たちは、PADI2酵素活性がこの細胞株の腫瘍形成性に重要な役割を果たしており、BB-CLAを介したPADI2活性の阻害が癌の進行を抑制するという仮説を立てています。

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プロトコル

3％の2-ヒドロキシエチルアガロースの調製

  1. 清浄な乾燥した100mlのガラス瓶に、2-ヒドロキシエチル0.9gのアガロースを添加（アガロースVII）を蒸留水30mlに続きます。
  2. 電子レンジ15秒間混合し、穏やかに渦巻きます。アガロース粉末が完全に溶解するまで、この手順を少なくとも3回繰り返します。
  3. 15分間この溶液を含むボトルをオートクレーブ。
  4. アガロース溶液は、さらに、使用前に室温まで冷却します。この溶液を室温で保管してください。

底層の調製：0.6％アガロースゲル

  1. 取り扱いの際にピペットで固化からアガロースを防止するために、37℃のインキュベーターで事前に暖かい、いくつかの5ミリリットルと10ミリリットルピペット。
  2. 部分的にボトルの蓋や電子レンジで15秒のための前作られた3％の2-ヒドロキシエチルアガロース溶液を緩めます。そして、静かに別の15秒のためのソリューション、電子レンジが渦巻きます。注意：agaroを旋回するときは注意してくださいSEソリューションソリューションは、空気にさらされると波及することができたときに上昇するためです。
  3. ボトル内の残留固体ゲル、さらに数秒間マイクロ波が存在する場合。
  4. 途中で固化からアガロース溶液を防止するために、次のステップの間に45℃の水浴中でアガロース溶液の入ったボトルを保管してください。
  5. 37℃の水浴中で暖かいMCF10DCIS媒体。注：MCF10DCISメディアはDMEM / F12、5％ウマ血清、5％のペニシリンストレプトマイシンから成ります。
  6. 転送滅菌50mlコニカルチューブに予め温めたピペットを用いて、3％アガロース溶液3ml。
  7. すぐに暖かいMCF10DCISメディアの12ミリリットルを加え、穏やかにメディアとアガロースを混合するためにコニカルチューブを反転。それは後にコロニー計数を妨害するように気泡を形成しないようにしてください。
  8. ゆっくりと気泡を形成することなく、6ウェル培養プレートの各ウェルにこの混合物を2mlを加えます。
  9. 6ウェル培養プレートのhorizo​​ntaをインキュベートLLY 1時間4℃で平らな面には、混合物が固化することを可能にします。
  10. 混合物が固化した後、30分間37℃のインキュベーターにプレートを配置します。底層が使用できるようになりました。

細胞を含有する層の調製：0.3％アガロースゲル

  1. トリプシン処理MCF10DCIS細胞および4×10 4 / mlの細胞濃度になるように、それらを希釈します。
  2. 予め温めたピペットを用いて、3％アガロースの2ミリリットルを取り、滅菌50mlコニカルチューブに移します。
  3. すぐにコニカルチューブにMCF10DCISメディアの8ミリリットルを加え、穏やかにメディアとアガロースを混合することが反転します。任意の気泡を形成することは避けてください。
  4. MCF10DCIS細胞（4×10 4 / ml）を2ミリリットルを取り、BB-CLA（0μM（DMSO）または1μM）で処理します。
  5. 1：1希釈、0.6％アガロースで細胞を混ぜます。
  6. 細胞 - アガロース混合物の1ミリリットルを取り、静かに6ウェル培養pの底層の上に追加します後期（2×10 4細胞/ ml）。
  7. 上層が固化することを可能にするために、少なくとも15分間、4℃で平坦な面に水平に6ウェル培養プレートに置き。
  8. 混合物が固化した後、給電層を追加する前の週の37℃のインキュベーターにプレートを配置します。

フィーダー層の4製造：0.3％アガロースゲル

  1. 電子レンジ15秒あらかじめ用意された3％の2-ヒドロキシエチルアガロース溶液。静かに別の15秒のためのソリューション、電子レンジが渦巻きます。
  2. 45℃の水浴中でアガロース溶液のボトルを平衡化します。
  3. 37℃の水浴中でMCF10DCIS媒体を温めます。
  4. 50mlコニカルチューブに暖かいMCF10DCISメディアの9ミリリットルで3％アガロース溶液1mlを混合し、穏やかにメディアとアガロースを混合するために反転します。気泡を形成することは避けてください。
  5. BB-CLA（0μM（DMSO）または1μM）との混合物を扱います。
  6. 静か用なし（この混合物の1ミリリットルを追加明は、底部とソフト層を含む6ウェル培養プレートの各ウェルに）泡。
  7. 混合物を固化することを可能にするために、少なくとも15分間、4℃で平坦な面に水平に6ウェル培養プレートに置き。
  8. フィーダー層が固化した後、37℃のインキュベーターにプレートを配置します。
  9. コロニー形成が観察されるまで、新しいメディアで細胞を補充するために、既存のフィーダー層の上に、0.3％アガロース/中/処理溶液の1ミリリットルを重ねることによって、この給紙手順を毎週繰り返します。注：柔らかくフィーダー層で寒天は非常に柔らかく、従って、フィーダー層からの追加の栄養素が容易に細胞に到達するために、細胞を含有する層中に拡散しています。

5.データ収集

  1. 軟寒天における細胞成長の2.5週間後、光学顕微鏡を用いて、各ウェル中のコロニーの数を数えます。定量化を容易にするために、透明性の上にグリッドを印刷しにグリッドを添付6ウェルプレートは、細胞がカウント中にある場所を特定するのに役立ちます。 （各コロニーの直径によって定量化されるように）、コロニーサイズが異なりますので、採点されるコロニーを判断するための基準コロニーサイズを事前に定義。例えば、70ミクロン以下のデータ分析が大きいのコロニーの大きさがあります。
  2. さらにコロニー形成を防止し、将来のカウントのために4℃でサンプルを保管してください。乾燥からゲルを防ぐためにパラフィルムで6ウェル培養プレートをシール。

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結果

軟寒天コロニー形成アッセイは、癌細胞の腫瘍形成能を記録幅広い用途に使用することができます。この手法の主な利点は、半固体マトリックスが選択的足場に依存しない方法で増殖できる細胞の増殖に有利に働くということです。この特性は、主に癌細胞によってではなく、正常細胞によって示されます。我々は、主に薬剤による腫瘍増殖阻害の有効性を試験するために、この技術を使用して、乳癌細胞の腫瘍形成能にPADI遺伝子を含む目的の我々の遺伝子の過剰発現または枯渇の効果を試験します。ここでは、PADI2過剰発現MCF10DCIS細胞（図1及び2）の腫瘍形成阻害に対するBB-CLAの効果を評価しました。

結果は、BB-CLAが有意MCF10DCIS細胞由来のコロニーの形成を阻害することを実証する。3図は 、そのPADI阻害剤の存在下で、T DMSO対照と比較した場合、ここで両方のコロニー形成及びコロニーサイズの減少がありました。 [注：BB-CLA DMSOに溶解し、従って、DMSOを対照として使用した。】BB-CLAはDMSOためのコ...

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ディスカッション

軟寒天におけるコロニー形成の速度は、細胞型9によって異なり。したがって、細胞の数を最適化し、それに応じて調整されるべきで開始します。提案さ始動範囲は6ウェルプレートを使用してあたり4×10 2〜1×10 5細胞の間です。また、コロニーの大きさは、各細胞の増殖速度に応じて変化します。そのため、コロニーの大きさのために事前に定義されたカットオフは、下流定量分析のための個々のコロニーに注釈を付けるために必要とされます。ここでは、70ミクロンは最初のプレーティング由来の非増殖細胞の混入を避けるために、定量化されたよりも大きなコロニー。

3Dアガロースゲルを製造する際に最適な成長のために、それは、通常、2次元細胞培養に使用される同一の細胞培養培地を使用することが望ましいです。しばしば回培地を交換することは、したがって、細胞が新しい培地に適応できるようにする追加の継代を必要とする、細胞の増殖速度を変化させるためです。例えば、MCF10DCIS細胞は、RPMI-1640、DMEM、またはDMEM / F12培地中で最適に増殖させることができます。 M...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

技術的なアドバイスを提供してくださったコーネル大学のRichard Cerione博士、Marc Antonyak博士、Kelly Sullivan氏、そしてオリンパスの倒立顕微鏡を共有してくださったコーネル大学のGerlinde Van de Walle博士に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ツァイス Axiopotカール ツァイス 顕微鏡1021859251
倒立顕微鏡オリンパスCKX41
DMEM/F-12ロンザ BioWhittaker12-719F
HyClone ドナー 馬血清フィッシャー サイエンティフィSH30074.03
ペニシリン ストレプトマイシンライフ テクノロジーズ 15140-122
2-ヒドロキシエチルアガロース:タイプVII、低ゲル化温度Sigma-Aldrich39346-81-1
ック

参考文献

  1. Hamburger, A. W., Salmon, S. E. Primary bioassay of human tumor stem cells. Science. 197, 461-463 (1977).
  2. Wang, L. H. Molecular signaling regulating anchorage-independent growth of cancer cells. Mt Sinai J Med. 71 (6), 361-367 (2004).
  3. Vossenaar, E. R., Zendman, A. J., van Venrooij, W. J., Pruijn, G. J. PAD, a growing family of citrullinating enzymes: genes, features and involvement in disease. Bioessays. 25 (11), 1106-1118 (2003).
  4. Horibata, S., Coonrod, S. A., Cherrington, B. D. Role for peptidylarginine deiminase enzymes in disease and female reproduction. J Reprod Dev. 58 (3), 274-282 (2012).
  5. Mohanan, S., Cherrington, B. D., Horibata, S., McElwee, J. L., Thompson, P. R., Coonrod, S. A. Potential role of peptidylarginine deiminase enzymes and protein citrullination in cancer pathogenesis. Biochem Res Int. , 895343(2012).
  6. McElwee, J. L., et al. Identification of PADI2 as a potential breast cancer biomarker and therapeutic target. BMC Cancer. 12, 500(2012).
  7. Knight, J. S., et al. Peptidylarginine deiminase inhibition disrupts NET formation and protects against kidney, skin and vascular disease in lupus-prone MRL/lpr mice. Ann Rheum Dis. , 1-8 (2014).
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  10. Hamburger, A. W., White, C. P., Dunn, F. E., Citron, M. L., Hummel, S. Modulation of human tumor colony growth in soft agar by serum. Int J Cell Cloning. 1 (4), 216-229 (1983).
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