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方法論記事

マウス脳低酸素性虚血の間に同時PET / MRIイメージング

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DOI：

10.3791/52728

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2015年9月20日

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1Department of Biomedical Engineering, University of California, Davis, 2Nuclear Magnetic Resonance Facility, University of California, Davis, 3Biomedical Imaging, Genentech, Inc, 4Department of Radiology, University of California, Davis

この記事について

サマリー

ここに提示された方法は、同時陽電子放出断層撮影法および磁気共鳴イメージングを使用します。脳低酸素虚血モデルでは、拡散およびグルコース代謝の動的変化は、負傷中および後に発生します。意味のあるマルチモーダルイメージングデータを取得する場合は、このモデルにおける進化と再生不可能な損傷が同時取得を必要とします。

要約

組織の水の拡散およびグルコース代謝の動的変化は、影響を受けた細胞内の生体エネルギーの乱れを反映して、脳低酸素虚血に低酸素症の間と後に発生します。拡散強調磁気共鳴画像法（MRI）は、低酸素性虚血によって、潜在的に不可逆的に、破損している領域を特定します。影響を受けた組織は、2-デオキシ-2-（18 F）フルオロᴅグルコース（[18 F] FDG）取り込みの陽電子放射断層撮影（PET）画像化によって検出可能でグルコース利用の変化。これによって動物モデルにおける傷害の迅速かつ可変性のために、データの両方のモードの取得は意味のあるPETやMRIのデータを相関させるために、同時に実行する必要があります。また、血管の違いによる低酸素性虚血性損傷における動物間変動は、マルチモーダルデータを分析し、データが個々の被験者に同時に取得されていない場合に、グループごとのアプローチの変化を観察する能力を制限します。メソッドのPここに憤慨中、1は前に同じ動物で拡散強調MRI及び[18 F] FDGの取り込みデータの両方を取得することを可能にし、低酸素チャレンジ後即時生理学的変化を調べるためです。

概要

世界的に、脳卒中は、死亡原因の第2位と障害1の主要な原因です。中に発生し、急性脳卒中イベントを以下の生化学的および生理学的事象のカスケードを迅速かつ組織の生存率と最終的な結果2への影響で発生します。低酸素性虚血性脳症（HIE）につながる脳低酸素虚血は、（HI）、最大0.3％、フル用語や早産出生、それぞれ3,4の4％に影響を与えると推定されます。 HIEを有する乳幼児の死亡率は20％、約15％です。 HIE生存者の25％は、恒久的な合併症は、精神遅滞、運動障害、脳性麻痺、てんかん3,4を含む傷害の結果として生じます。過去の治療的介入は、ケアの標準として採用の価値が証明されていないと、低体温に基づいて、最も高度な方法は、効果的に罹患率3,5を削減していることをコンセンサスがまだ到達しなければなりません。その他の問題OFの競合は、低体温と患者の選択6の投与方法が含まれます。したがって、神経保護および神経修復のための戦略は、まだ研究のために7肥沃な地域です。

脳HIのラットモデルは、1960年代から利用されてきたし、その後マウス8,9に適応させました。これにより、モデルの性質および連結の場所に、固有の変動が原因の動物10の間の側副流の違いの結果であります。結果として、これらのモデルは、中大脳動脈閉塞（MCAO）と同様のモデルに比べて、より可変である傾向があります。生理学的変化のリアルタイム測定は、レーザードップラー流量計ならびに拡散強調MRI 11で実証されています。中に、すぐに低酸素症の後、ならびに梗塞体積および神経などの急性転帰における脳の流れ、血液中の観察イントラ動物変動赤字は、マルチモーダルデータの同時取得と相関が有益であろうことを示唆しています。

同時陽電子放出断層撮影（PET）及び磁気共鳴イメージング（MRI）における最近の進歩は、前臨床イメージング12-14に新しい可能性を可能にしました。これらのハイブリッドの潜在的な利点は、前臨床用途のための組み合わせたシステムは、文献15,16に記載されています。多くの臨床前の質問は個々の動物を順次撮像することにより、または別個の動物群を画像化することによって対処することができますが、特定の状況 - 例えば、このようなイベントの各インスタンスは、ストロークが急激に病態生理を進化させると、独自に現れとして - それが望ましいとしても必要な作ります同時測定を使用しています。脳機能イメージングこのような一例を提供し、同時に2-デオキシ-2-（18 F）フルオロᴅグルコース（[18 F] FDG）PETとblooD-酸素レベル依存（BOLD）MRIは、最近、ラットウィスカ刺激試験14において示されています。

ここでは、低酸素性虚血性脳卒中における脳生理学の発症時に同時PET / MRI画像を立証することは定常状態ではありませんが、代わりに、迅速かつ不可逆的に低酸素チャレンジの間に変化しています。水拡散の変化は、MRIによって測定され、拡散強調画像（DWI）に由来する見かけの拡散係数（ADC）によって定量化として、臨床および前臨床データ17,18に脳卒中のためによく特徴づけられています。このようにMCAoなどの動物モデルでは、影響を受けた脳組織中の水の拡散が原因で、細胞傷害性浮腫18につながる生体エネルギーカスケードに急速に低下します。 ADCにおけるこれらの変化はまた、急性脳低酸素虚血11,19の齧歯類モデルにおいて観察されます。 [18 F] FDG PET画像化は、ローカルGLの変化を評価するために、脳卒中患者において使用されていますucose代謝20、及びインビボでの動物試験の小さい数は、脳低酸素虚血モデル22を含む、[18 F] FDG 21を使用しています 。再灌流でモデルを用いた研究では、後に梗塞開発23これらの代謝変化の相関は認められなかったが、一般的に、これらの研究は、虚血性の地域で減少したグルコース利用を示しています。これは不可逆的に損傷を受けたコア21と関連している拡散変化とは対照的です。これは、損傷の進行とのインパクトについて意味のある情報をもたらす可能性があるようにこのように、ストロークの進化中に同時の様式で、[18 F] FDG PETおよびDWIに由来する相補的な情報を得ることができることが重要です治療的介入。私たちはここで説明する方法は、PETトレーサーおよびMRIシーケンスの様々な使用することが容易に適しています。たとえば、[15 O] H 2 O PETDWIおよびMRIから灌流強調画像（PWI）と一緒にイメージングは​​さらに、虚血性半影の開発を模索し、ストロークイメージングフィールド内の現在の技術を検証するために使用することができます。

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プロトコル

全ての動物取り扱い及び手順は、本明細書に記載されており、動物実験によると：実験動物管理認定の評価のための協会によって承認されたプロトコルに従って行われた、in vivo実験（ARRIVE）のガイドラインでの報告（AAALAC）インターナショナルは、施設内動物実験を認定しましたそして、カリフォルニア大学デ​​ービス校で使用委員会。適切な手術は動物の任意の痛みや不快感の兆候が生じてはならず、適切な手順は、これらの兆候は、安楽死、鎮痛剤のまたはいくつかの場合には投与を含む、認められた場合取られるべきです。動物の右側を説明一方的な手順については、任意に選ばれました。

1.片側総頸動脈（CCA）連結

  1. 便利な立地の滅菌手術道具や材料を滅菌フィールドを準備します。確実加熱パッドは、パッド上にしっかりと配置された温度プローブを37℃に加温します。 ＆＃160;手術部位をカバーするために滅菌ドレープを使用してください。
  2. （0.5〜1リットル/分でイソフルラン、空気中の1〜3％）、動物を麻酔し、尾は反対側と仰臥位で動物を配置します。つま先をつまんで麻酔を確認します - 動物を適切に麻酔されている場合、これは何の反応を誘発してはなりません。目に眼軟膏を適用します。
  3. 1-2綿棒を使って上部の胸の部分に下の首に脱毛クリームを適用します。 1-3分待ってから、濡れたガーゼやアルコール綿棒を使用して髪やクリームを削除します。その後、綿棒切開の内部から外部への循環方法でベタジンの領域、および無菌手術用手袋に変更。
  4. 手術用ハサミを使用して、下の首の正中線に沿って約1センチの切開を行います。慎重に手術用はさみを使用して筋膜を囲むから外皮を分離します。
  5. 2マクファーソンマイクロアイリス縫合鉗子を使用して、損傷静脈またはdisturを避けるように注意しながら、筋膜から右総頸動脈を分離迷走神経をビンビン。
  6. 右側の鉗子を使用して、安定した位置に右CCAを体外に出します。乾燥を防ぐために生理食塩水を数滴を適用します。二重の正方形の結び目を用いて適切な右CCAの下に6-0絹縫合糸の長さ（2-3センチ）、およびライゲートを渡します。必要に応じて、再度、6-0絹縫合糸の第二の長さを使用して連結します。
  7. 右CCAを再配置し、滅菌スポンジチップを渡した綿棒を使用して開くから過剰な流体を清掃してください。 6-0絹縫合糸で切開を閉じます。 7ミリグラム/キログラムまでの局所リドカインを適用します。
  8. 動物が歩行（約30分）まで、麻酔から回復し、動物がイメージングのための準備ができるまで術後のモニタリングを行うことができます。

イメージング用2.準備：システムとハードウェアのチェック

  1. MRIとPETシステム用のハードウェアとソフトウェアをセットアップし、次のようにその機能を確認してください。すべての物理的な接続が確実に行われていることを確認し、ソフトウェアの設定が適切に選択されています。
    1. PETシステムは、空気冷却システムを使用して、5°Cの所定の動作温度であることを確認します。
    2. ビュー（FOV）のPETやMRIのフィールドを揃えるのMRIボアの内部マウントPETシステムは、既知の軸方向のオフセットを使用して中央に配置されます。 PETシステムのボア内部のMRIコイルをマウントし、PETシステムとMRI磁石センターとコイルを中央に配置します。
    3. パワーとバイアス電圧用PETエレクトロニクスをオンにします（注：手順は機器によって異なります）。 68 Geのシリンダーを使用してクイック（5分）スキャンを実行し、すべての検出器が動作している保証するために、得られたサイノグラムを確認してください。
    4. 必要に応じて同時登録目的のためのPET / MRIの変換行列に使用するデータを取得：18 F水溶液200μCiので三次元ファントム（例えば、3満たさ球）を記入し、PETとの15分間獲得。スキャンコントロールウィンドウで、マルチスライスマルチエコー（MSME）シーケンスを選択します（ 表1を参照してください ：解剖学的MRIデータを取得）。軸方向、矢状および冠状：すべての3つの主要な方向性について、この手順を繰り返します。
  2. 輸液ポンプの設定と動作を確認してください。一定注入の45分で総容量200μlを実現し、毎分4.44マイクロリットル、20gの動物における静脈内注射のための典型的な推奨限度にポンプを設定します。
  3. ヒーター動作を確認し、温度出力は、動物温かい（37℃）を維持するのに十分であることを確認します。温度および呼吸モニタリングは、動物のベッドの上で動物の配​​置の準備のために動作していることを確認してください。
  4. （0.5 L /分：O 2を 57.2ミリグラム/分および0.575グラム/分でN 2で）O 2とN 2流量計の動作を確認した圧縮空気をオフ源とO 2とN 2との両方の電源を入れることにより、ソースの。流量計を損傷する危険性を回避するために、十分な入力圧力なして、電源を入れないでください。
  5. そのイソフルランvを確認aporizerは十分に満たされています。イメージングの前に、1〜2％でイソフルラン麻酔の流れを開始し、0.5〜1リットル/分。
  6. 麻酔、呼吸パッド、およびヒーターシステムがしっかりと機能的に配置されていることを確実にすることにより、動物のベッドを準備します。追加のPET / MRI共同合わせ精度、基準マーカー（例えば、画像化のために注入されたのと同様の濃度で放射性トレーサーで満たされたキャピラリーチューブ）は、視野内の動物のベッドに取り付けることができます。

3.イメージングワークフロー

すべての必要な機器のチェックが完了した後、以下のように、画像に進みます。

  1. イソフルランで動物を麻酔し、（5cm未満チューブ28 G針、PE-10）尾静脈カテーテルを挿入し、ヘパリン化生理食塩水（10 mlの生理食塩水0.5 mlのヘパリン、千USP / mlの）を充填しました。動物および/または尾部を加温すると、カテーテル挿入の精度を向上させることができます。必要に応じて挿入部位にシアノアクリレート接着剤のドロップを置きますIVラインを確保します。
  2. 準備された動物のベッドに動物を転送します。動物の頭部が使用されている場合は代わりに、歯のバーや耳の棒で固定上顎切歯で、安全であることを確認してください。
  3. 乾燥を防ぐために、目に眼軟膏を適用します。直腸プローブ温度計を挿入します。温度と呼吸測定値が機能していることを確認してください。
  4. PE-10チューブと200μlのボリュームを構成するために約3メートル - 適切な長さのヘパリン処理したPE-10チューブに注入する（200μl中μCiの600の周りに）放射性トレーサーの投与量を描画します。輸液ポンプシリンジにこのチューブの一端を接続し、尾静脈カテーテルラインに他の、チューブにパンクを作成しないように注意して。
  5. 必ずMRIコイルの位置および任意の線やケーブル、特に麻酔チューブを乱さないようになって、磁石のボア内に前方に動物のベッドをスライドさせます。脳の中心がMの中心と整列していることを確認してくださいRIコイル、PETシステム、及びMRI磁石。
  6. ハイパワープリアンプの表示を観察することにより、インピーダンス（コイルの仕様を確認してください）と周波数（7テスラで 1時間、300 MHz）のミスマッチを最小限に抑え、コイルに調整ノブを回転させることにより、MRIコイルのチューニングとマッチングを行います。
  7. チューニングとマッチングした後（MRI）、スカウト画像を取得：RARE tripilotシーケンスを選択して、スキャンコントロールウィンドウからシーケンスを実行します。ステップ3.5と3.6、必要に応じて繰り返し、動物の位置を確認してください。ゼロ値にシムをリセットします。
  8. （MRI）は、脳内のボリュームにローカライズされた、ポイント分解分光スキャン（プレス）を取得するには：寸法3.9ミリメートル×6ミリメートル×9 mmの長方形の体積である （表1を参照）を押しシーケンスを実行します。 CalcLineWidthマクロコマンドを使用して、水の線幅を確認してください。半最大（FWHM）値全幅が許容範囲内にある場合（例えば、0.2 ppm）で、3.10に進みます。ない場合は、ステップ3に進みます。9。
  9. （ 表1参照 ）のFieldMapシーケンスを実行します（MRI）は、フィールドマップを取得します。 MAPSHIMマクロコマンドを実行し、線形及び二次（Z 2）ローカル調整を選択することで、多角度投影シム（MAPSHIM）について得られたデータを使用してください。手順を繰り返し3.8。
  10. （MRI）のDWIスキャン（ 表1参照 ）ためのスライス計画の位置：ジオメトリエディタを使用して、取得FOVは脳内の関心の所望の体積を取得するように配置されていることを確認。必要に応じて、結果として得られるスライスプランが整列されている場合は、それ以降のすべてのDWIスキャンのスキャンコントロールウィンドウでこのスライスプランをコピーします。取得を開始します。
  11. PET収集を調製し、開始する準備で（PET）、注入ポンプを起動します。カテーテルからの生理食塩水が注入された予め決定された遅延の後、放射性トレーサーのエントリを捕捉するために、（ 表1参照）PET収集を開始します。計数率を監視し、緩やかな増加を見て成功注入を示すカウントインチ
  12. 10〜15分後に、ステップ3.12と低酸素チャレンジ同時を開始します。低酸素チャレンジを開始するには、8％の酸素と92％の窒素を提供し、0.8％にイソフルランを減らすために所定の設定で、O 2とN 2の流量計に医療空気の流れと、すぐに電源を切ってください。入力圧力なしに流量計の電源は入れないでください。
  13. （MRI）ステップ3.12と同時に、ステップ3.10（「H1」をスキャン）で調製したDWI取得を開始します。
  14. （MRI）スキャンH1が完了した直後に、ステップ3.10で製造し、DWI取得は（「H2」をスキャン）を開始します。 、流量計の電源をオフに医療空気の流れを回復し、生理学的モニタリングに基づいて、適切な値にイソフルラン濃度を返すことによって、低酸素の挑戦を終了します。
  15. （MRI）後低酸素症DWIスキャンステップ3.10で製造し取得します。このスキャンが完了した後に輸液ポンプの電源を切ります。
  16. （MRI）はアナトを買収軸と矢状面でomical画像。スキャンコントロールウィンドウで- MSMEシーケンスを（ 表1を参照）を選択します。ジオメトリエディタを使用して、取得FOVは脳をカバーしていることを確認してください。
  17. 、動物を削除する際に歩行ケージに戻り、罹患の兆候を監視し、必要に応じて二次方法として頸椎脱臼に続いてCO 2の投与と安楽死。

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結果

図1は、6-0絹縫合糸で創傷を閉鎖する前に、総頚動脈の適切なライゲーションの結果を示しています。

この方法では、イメージングから得られるデータは、順番に指示し、また、画像取得方式や機器の設定を含む実験的な制限によって決定され、実験の時間的な配置に大きく依存します。これらおよびその他の考慮事項は、さらなる議論のセクションで検討されています。本明細書に記載されたプロトコルでは、機器（ 図2A）の物理的なセットアップは中、前途切れのないマルチモーダル画像取得を可能にし、（ 図2B）、低酸素チャレンジ（ 図2C）の迅速な導入後。

この動物モデルでは、多くの虚血性脳卒中モデルと同様に、拡散の変化は侮辱した後、急速に検出可能である（representat については、図3Aを参照してくださいアイブ例）。基本的に脳HIモデルを変えることは...

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ディスカッション

同時解剖学的MRI、ダイナミックDWI-MRIおよび[18 F] FDG PETデータが正常に総頸動脈結紮後低酸素チャレンジの間に実験動物から取得しました。これは、脳内の虚血発作に関連する急速に進化する病態生理のマルチモーダルイメージングのための強力な実験パラダイムを表し、容易に他のPETやMRIシーケンス（神経炎症の例マーカー用）の放射性トレーサー、ならびに介入戦略の影響を研究するために拡張することができます中またはまもなく虚血性攻撃後。

脳HIモデルにおける低酸素チャレンジの間に同時PET / MRI画像を正常に実行するために、物流が考慮され、方法は、それに応じて調整する必要があります。潜在的に、実験の時間的な配置に影響を与える要因としては、これらに限定されないが、放射能の1）ソース - RAに応じて放射性核種の使用diotracer、半減期、及び比活性の必要条件は、これは、画像化された動物の可能な合計数に影響を及ぼし得ます。 2）部屋のレイアウト - これは使用チューブ、したがって、注入量の長さに...

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開示事項

JMとSWはジェネンテックの従業員です。

謝辞

著者は、カリフォルニア大学デ​​ービス校とジェネンテックで医学科での分子とゲノムイメージングセンターを承認したいと思います。この作品は、国立衛生研究所のバイオエンジニアリング研究パートナーシップ助成金番号R01 EB00993によってサポートされていました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
手術
用はさみRobozRS-5852
鉗子RobozRS-5237
ハートマン蚊用鉗子Miltex7-26
2x マクファーソン縫合鉗子、8.5 cm正確な外科用&サイエンティフィック・インスツルメンツ4473頸動脈を保持するために使用される鉗子のバンドで開口部の幅を小さくすることは有用
6-0 シリコンコーティングされた編組シルク縫合糸 3/8 C-1 針付きCovidien SofsilkS-1172
ホメオサーミックブランケットシステムハーバード装置507220F
瞬間接着剤(ジェネリック)
低酸素症
O2用流量計アリカット・サイエンティフィックMC-500SCCM-D
N2用流量計アリキャット・サイエンティフィックMC-5SLPM-D
O2メーターMSAAltair Pro
イメージング
7.05 テスラ MRIシステムブルカー・バイオスペック内径20cm、グラジエントセット付き。Paravision 5.1ソフトウェア。
ボリューム Tx/Rx 1H コイル、内径 35 mmBrukerT8100
PET システム(社内)4x24 LSO-PSAPD 検出器、
10x10 LSO アレイ (検出器あたり)、
1.2 mm クリスタルピッチ、深さ 14 mm、14 x 14 mm PSAPD.FOV:60x35 mm. 350-650 keVエネルギーウィンドウ。16 nsec タイミング ウィンドウ。
血管カニューレ挿入 デュモン鉗子RobozRS-4991
PE-10 ポリエチレンチューブBD Intramedic427401
輸液ポンプBraintree ScientificBS-300
動物監視およびゲーティング機器Small Animal Instruments Inc.Model 1025呼吸モニタリングのみ使用
体温調節機能付き動物用ベッド(社内)
です

参考文献

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