神経変性疾患のショウジョウバエモデルにおけるクライミング欠陥の定量分析

Summary

私たちは、神経変性疾患のモデルとして、Drosophila melanogasterにおける最適化された安価で信頼性の高いネガティブジオタキシスアッセイを提示します。軽度の自発運動障害に対してより感受性が高いため、このアッセイは潜在的な遺伝的相互作用と薬物標的のスクリーニングに役立ちます。

Abstract

神経変性疾患に起因する機関車の欠陥は、無症候性変性の年後に、疾患の遅発性の症状であることができ、したがって、現在の治療の治療戦略は治癒的ではありません。全体exomeシーケンスを使用することにより、遺伝子の増加は、ヒトの移動において役割を果たすことが同定されています。これらの遺伝子の同定にもかかわらず、これらの遺伝子は、正常な機関車の機能に重要であるかは知られていません。そのため、治療目的の新規標的を同定するために、これらの遺伝子の役割を解明するためのモデル生物を利用し信頼性の高いアッセイは、これまで以上に必要とされています。我々は以前より穏やかな欠陥の検出を可能にし、時間をかけてこれらの欠陥を評価する能力を有する負の走地性アッセイの感作されたバージョンを設計しました。ガラス中で行われるアッセイは、ワックスバリアフィルムで封止されているシリンダー、メス。閾値距離を増加させることによって、17.5℃に上昇させます私たちは穏やかなモビリティ機能障害を検出するのに高い感度を観察している2分の実験期間をMと増加。アッセイは、費用対効果がされており、再現性の高い結果を得るために広範囲の訓練を必要としません。これは、運動欠陥のショウジョウバエの変異体では、候補薬剤をスクリーニングするための優れた手法になります。

Introduction

パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、および遺伝性痙性対麻痺のような壊滅的な神経変性疾患は、ますます認識されています。残念ながら、これらの神経変性疾患のほとんどは、治療せずに残っ​​ています。このような全体exomeシーケンシングなどのゲノムワイドな、公平な遺伝子検査の広範な臨床使用は、ヒト機関車の障害に関与している遺伝子の数の増加につながっています。この進歩にもかかわらず、初期後期への病理学的進行は、これらの疾患でとらえどころのないままになります。 ショウジョウバエは、制御された空間及び時間的に遺伝子の要件を研究するための遺伝的ツールとのうちの1つを提供します。また、 ショウジョウバエは、パーキンソン^1、アルツハイマー^2、知的障害^3,4およびとりわけてんかん^5,6などの神経学的状態のための薬剤のスクリーニングに有用であることが証明されました。私たちの目的は、効果的なコストを開発することでしたまだモータ性能の小さな変化を検出するのに十分な感度であろう、高スループット分析を可能にする信頼性の高いアッセイ。

ショウジョウバエクライミング挙動に関する遺伝子変異及び/又は環境条件の影響を定量化するために使用されるいくつかのアッセイがあります。アッセイのほとんどは負の走地性、またはクライミングアッセイとして知られて登るハエの自然な傾向を生かします。 Benzer ^7は走光性の研究のために使用されるカウンター現在の装置はまた、重力走性を研究するために使用することができることを1967年に提案しました。それ以来、Ganetsky ⁸および他の多くの^{9 -12は}最初のアッセイ上に構築されてきました。原理は、バイアルにハエの既知の数を配置し、ハエがバイアルの底に落下させ、硬い表面に対して強くバイアルをタップすることです。それは生得的行動であるように、ハエは、重力に反対し、バイアルの上部に登るしようとします。このアッセイは、定量的およびmeasuです割り当てられた時間期間の間に、バイアル上のマーカーを越えて上昇しているどのように多くのハエのres。代わりにハエクライミングの総数の速度の測定は、信頼性の高いパラメータとなり、ハエの基準の数は¹³に有意ではなかった場合の欠陥を示しています。

クライミングアッセイは、パーキンソン病¹⁴を含む多くの神経変性疾患の研究に有用であることが証明されました。しかし、我々は、機関車の欠陥は、神経変性が既に病理学的研究¹⁴に見られる時に検出されない場合があることに留意しました。したがって、従来のアッセイの使用は、疾患の発症の初期段階を研究するための能力を制限することができます。病理学の後の段階の間に機関車の欠陥の外観は、その進行の完全な救済のためのあまりに高度である疾患を反映することができます。

これは、従来のクライミングアッセイの感度を持つ潜在的な問題を提起します。 tradiの潜在的なことができないこと軽度の機関車の欠陥を検出するため的なクライミングアッセイはハエを登るために必要とされた高さに帰することができます。正常に10〜20秒で2〜5センチメートルの高さを乗り越えるために、従来のアッセイ^15,16対策ハエの数。

Protocol

キイロショウジョウバエの研究は、アルバータ州の研究指針の大学を遵守していました。

1.フライコレクション

1. 食品を含む25ミリメートルX 95ミリメートルの回収バイアル中のCO _2（g）の麻酔と場所を使用して、20ハエを収集します。
2. 水平にハエを含むストアバイアルは、バイアル底に蓄積する可能性のある液体でハエをトラップ避けるために。
3. 約15時間、インキュベーター中で45％の湿度で22℃で少なくとも21時間、ハエをインキュベートします。暗サイクル：12時間の明とインキュベーターを設定します。

2.クライミングアッセイ

1. 翌朝は、メスシリンダー250mlのガラスに単一バイアルから20ハエを転送します。それを一定の日常を維持するために、シリンダの位置をマークします。遺伝子型間の交差汚染を防止するために、遺伝子型ごとにガラスシリンダーを使用してください。各実験及びROの最後に洗います遺伝子型との間でそれらをテート。
   1. 温度22℃、湿度40％であった（視覚の潜在的な欠陥がある場合、または赤色光）は、周囲の光の中で実験を行います。概日リズムの交絡を回避するために、常に一日の同じ時間に実験を行います。
2. 任意のハエ（ 図2）の漏れを防止するためのバリア膜（ワックスフィルム）とシリンダーの上部をシール。
3. 三脚にビデオカメラを設定します。 250ミリリットルの190ミリリットルライン上の焦点カメラは、シリンダ（17.5センチメートル）を卒業しました。
4. シリンダーの底部に、食品バイアルに死んだハエの数をカウントします。死亡率としてこの番号を記録します。
5. 非常に軽く内側底面にハエを変位させるように十分な力で繰り返しクローズドセルフォームパッドに対してシリンダーをタップします。カメラの記録を押すようにもう一方の手を使用しながら10回 - 5をタップします。
6. カメラの「録音」ボタンを押してください。
7. VIDを開始EOカメラ記録とは別個の非リズミカルなパターンでシリンダーを6回タップします。
8. ハエが最後のタップされた時点から2分間各試験を実施し、選択した各時点で17.5センチメートル（190ミリリットル）（10秒ごとに定量化）の高さを横切るハエの数を記録します。注：シリンダーのマーキングミリリットルを直径に応じて、1気筒モデルから別のものに変化します。エラーを回避するには、使用される各気筒の高さを測定します。
9. 裁判が終わった後、95％エタノールにハエを処分。
10. すべての複製が新鮮なハエとするたびにテストされるまで繰り返して、2.9に2.1を繰り返します。
    注：5の複製は、変異が運動に強い影響を持つ十分であるかもしれないが、20ハエ（200ハエ）の10の生物学的反復は、より小さな差を検出することをお勧めします。
11. 実験の完了後、再使用する実験用食器洗い機、乾燥O / Nでのシリンダを洗浄します。

3.分析

1. ANALY各フライ試験のZE動画。各10秒は、ターゲットラインを通過したハエの総数を記録します。
   1. フライバックダウン登っまたは低下した場合、-1のように飛ぶし、レコードはバックダウン登ったり下ったハエと同じ数として目標ラインと交差するように、次のフライを数えます。 15 ^番目のフライが目標ラインを下回った場合、（16 ^番目が飛ぶ）ラインを通過する次のハエは、15 ^{番目、16番目を}飛行していないと考えられています。
2. 裁判に残るハエの数を得るために、ハエ（20）の合計数から死亡を引きます。各時点で、ターゲット·ラインの上のハエの画分を得ました。
3. 各時点での各割合をプロットする（ 図3参照 ）。
4. 120秒のデータポイントでパフォーマンスを分析し、2基が存在する場合、またはANOVAとボンフェローニ修正と多重比較のための事後テストは、（計画および計画外の共同のためのテューキーのためのスチューデントt検定を行いますmparisons）。コルモゴロフ-スミルノフ^17はまた、正規と同等の分散を確認するために行われるだけでなく、コントロールに変異群の分布を比較するためにテストします。
5. 、老化を介してデータを現在進行赤字（ 図4）があるかどうかを確認するために、異なる年齢のハエで120秒に（2日、1週間、2週間）を登るハエの割合をプロットします。

Results

登山は強く、再現可能な動作です。 （ - 30秒25）実際、1日齢の野生型ハエが急速に目標距離クライミング性能に達します。変異体ハエがターゲットに登ることができないことを完了するために、穏やかな（または遅延）からパフォーマンスの範囲を提示します。我々は2つ​​の異なる突然変異対立遺伝子とここにこれを説明します。最初のものはspastin遺伝子（温泉^5.75）18の完全な欠失によって引き起こされる遺伝子spastinの深刻な対立遺伝子です。この行で（TM6bと温泉^5.75）1日齢のハエも、2分後に、WTクライミングのパフォーマンスに到達しません。この変異体のラインは、バイアル法（ 図1A、B）を使用していても重度の欠陥を呈します。同じ遺伝子のためのが、同じグループ（スパTM3と^17-7）18によって公開不完全な欠失を有する変異体を研究する際に、ここで提示された方法の利点は、より明白になります。その場合、8日間の性能アップが正常（ 図1C-Fであります図3）、または遺伝的相互作用の結果であることが保証されま...

Discussion

ショウジョウバエはすでにパーキンソン病¹⁴および他の神経変性条件^1,2に優れたモデルであることが証明されました。 ショウジョウバエで利用可能な遺伝子ツールに加えて、そのゲノムは非常に神経疾患¹⁹に関与する遺伝子のために保存されています。 （全体exomeシーケンシングを含む）ゲノムワイド遺伝子スクリーニング法の出現は、人間の運動障害に関連する候補遺伝子の大きなリストを提供し続ける可能性が高いです。これらの条件のための治療法の開発は、神経変性の初期段階に関与する病理学の我々の理解を高めるために、動物モデルが必要になります。 ショウジョウバエの使用と負の走地性アッセイは、機関車の欠陥に関与する遺伝子を同定し、その後の表現型の救済のための候補薬剤をスクリーニングする、安価で信頼性の高い方法を提供します。これは、分子、電気生理学的に加算して、撮像証明T帽子は、同じ動物モデルで得ることができます。クライミングアッセイを使用して、他は正常人の運動を破壊遺伝子についてハエ突然変異体における運動欠陥を再現しています。それにもかかわら...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ショウジョウバエ株			株は実験に応じて選択されます。部屋とインキュベーター内の温度と湿度は、ハエが静まりすぎたり濡れすぎたりしないように制御し、一貫している必要があります。
ビデオカメラ			デジタルビデオカメラなら何でも構いません。近くにある被写体にピントを合わせることができることを確認してください。
メスシリンダー	キンブル	20028W	メスシリンダーのモデルが異なれば、直径も異なる場合があります。したがって、高さを測定することが重要です。
コンピュータ			はどんなモデルでもかまいません。私たちはコンピュータを使ってハエの登りを監視し、各時点でのハエの数を記録しました。