方法論記事

「マスト細胞ノックイン」マウスを用いた生体内肥満細胞の機能解析

DOI：

10.3791/52753

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2015年5月27日

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1Department of Pathology, Stanford University School of Medicine, 2Department of Microbiology & Immunology, Stanford University School of Medicine

この記事について

サマリー

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イン ビトロ 由来肥満細胞の生成方法、肥満細胞欠損マウスへのそれらの生着、異なる解剖学的部位における生着マスト細胞の表現型、数および分布の分析について述べた。このプロトコルは、 生体内のマストセルの機能を評価するために使用することができます。

要約

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マスト細胞(MC)は、様々な組織に存在する造血細胞であり、特に皮膚、気道、消化管などの外部環境に曝露される部位に豊富に存在する。IgE依存性アレルギー反応における有害な役割で最もよく知られているMCは、毒や侵入細菌や寄生虫に対するホスト防御の重要なプレーヤーとしても出現しています。MC表現型および機能は、解剖学的位置によって異なる可能性がある微小環境要因、または免疫応答の発達のタイプまたは段階に基づいて影響を受ける可能性がある。このため、MC機能に関する洞察を得るために、インビトロ法よりもインビボアプローチを支持してきました。ここでは、マウス骨髄由来培養MC(BMC)の生成方法、遺伝的MC欠損マウスへの導入、異なる解剖学的部位における養子転移の数と分布の分析について述べた。この方法は、"マストセルノックイン"アプローチと名付けられ、過去30年間、生体内のMCおよびMC由来製品の機能を評価するために広く使用されてきました。近年開発された代替アプローチに照らして、この方法の利点と限界について議論する。

概要

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マスト細胞(MC)は、多能性骨髄前駆物質1-3から生じる造血細胞である。骨髄の進入に続いて、MCの前駆体は、局所的な成長因子1-3の影響を受けて成熟したMCに発展する様々な組織に移行する。組織常駐型のMCは、皮膚、気道、胃腸管などのホスト環境のインターフェースに戦略的に位置し、外部侮辱に対する第一線の防御線として3-6と動作する。多くの場合、MCは「ベースライン」の表向きの特性と解剖学的位置に基づいてサブ分類されます。マウスでは、「結合組織型」のMC(CTMC)および粘膜MC(MC)1~3,7,8という2種類のMCが記載されている。CTMCは、しばしば、小脳および神経線維の近くに位置し、滑膜腔に存在し、MMCは腸内および呼吸粘膜1-3の上皮内位置を占める。

多くの方法論が、MC9-13の生物学的機能を研究するために適用されてきた。多くのグループは、細胞株(ヒトMCラインHMC114またはLAD215,16など)、インビトロ由来MC(ヒト末梢血由来MC17、マウス骨髄由来など)のいずれかを使用してインビトロアプローチに焦点を当てています。 培養したMC[BCMCs]18、胎児皮膚由来培養MC[FSCCs]19および腹膜細胞由来....

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プロトコル

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すべての動物のケアと実験は、国立衛生研究所のガイドラインに従い、スタンフォード大学の制度的動物ケアと使用委員会の具体的な承認を得て行われました。

1. 骨髄由来培養マスト細胞(BMC)の生成と特性評価

注:ドナーBMCCsは、レシピエントMC欠損マウスと同じ遺伝的背景の骨髄細胞から生成されるべきである。男性由来ドナーBMCは、雌マウスの生着には適していない。女性由来ドナーBMCは、男性と女性の両方のレシピエントに正常に生着します。

  1. 骨髄抽出.
    1. 滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を6ウェル培養プレート(1回1個)に注ぎ、氷の上に置きます。
    2. 解剖器を70%エタノールに浸して殺菌する。
    3. 二酸化炭素(CO2)吸入によってドナーマウスを安楽死させ、続いて子宮頸部脱臼を行い、その後、操作部位に70%エタノールをマウスに噴霧する。
    4. 骨の骨の骨を切断せずに大腿骨、脛骨および脛骨を抽出するために無菌解剖器を使用してください。
    5. 鉗子で骨を固定しながら、滅菌はさみ(またはメスの刃)を使用して骨からすべての組織を削り取る(そしてフィブラを捨てる)。すべての骨が収集されるまで氷の上にPBSに骨を置きます。
    6. 滅菌組織培養フード内の残りのステップをすべて実行します。滅菌器具を使用して、....

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結果

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「マスト細胞ノックイン」アプローチの概要を 図1に示し、BMCの生成、MC欠乏マウスに生着する細胞の数(実験計画に基づいて示された数を変更することができます)、および注入部位に応じて着実と実験の間隔(この場合は異なる場合)が含まれています。 例えば、MC細胞質顆粒中の保存されたメディエーターの含有量は、時間38と共に着実に増加する。 図2 は、IL-3の供給源として20%WEHI-3細胞条件培地に含有するDMEM培地における1、15および45日後のBMCの代表的なフローサイトメトリー分析およびトルイジンブルー染色を示す。なお、45日間培養したBMCMCは95%純粋で、多数の細胞質顆粒を含み、生着実験に使用できますが、15日間培養した細胞は生着に適していません。 図3 は、i.d.生着後4週間(図3A)、腸間膜窓(図3B)および腹腔(図3C)i.p.生着後6週間、およびi.vの生着.......

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ディスカッション

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最初の説明 38 から約30年が経過したところで、"マスト セル ノックイン" アプローチは、MC が生体内で何ができるか、または何ができないかについての貴重な情報を提供し続けています。MCの機能は長い間アレルギーにおけるその役割に限定されると考えられていた。「マスト細胞ノックイン」アプローチを用いて生成されたデータは、MCが他の機能の中で、特定の病原体4,39または毒28,31に対する宿主防御において重要な役割を果たすことができるという証拠を提供することによって、この見解を変えたか、あるいは特定の免疫応答を抑制することができる29,34,40。

我々のプロトコル記述では、骨髄由来培養MC(BMC)の生成と生着に焦点を当てることにした。 しかし、MCは胚性幹細胞(胚性幹細胞由来培養MC[ESCCc])41から直接培養することもでき、また、遺伝的に適合する場合には、これらの細胞をMC欠損マウスへの生着にも.......

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開示事項

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著者らは開示するものは何もない。

謝辞

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N.G.はフランスの「フォンダシオンは、ラ・レシェルシュ・メディカルFRMを注ぐ」とフィリップ財団からのフェローシップの受領者です。R.S.は、ルシル・パッカード小児健康財団とスタンフォードNIH/NCRR CTSA賞番号UL1 RR025744によってサポートされています。P.S.はマックスケイド財団のマックスケイドフェローシップとオーストリア科学アカデミー、オーストリア科学基金(FWF):J3399-B21のシュレーディングフェローシップによってサポートされています。S.J.G.は、国立衛生研究所の助成金U19 AI104209、NS 080062、およびカリフォルニア大学のタバコ関連疾患研究プログラムからの支援を認めています。L.L.R.は、関節炎国立研究財団(ANRF)と国立衛生研究所助成金K99AI110645からの支援を認めています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1% 抗生物質-抗真菌剤溶液Corning cellgro30-004-Cl
3 ml シリンジファルコン309656
35 mm x 10 mm ディッシュCorning cellgro430588
5 ml ポリスチレン丸底チューブファルコン352058
酢酸 氷河 フィッシャー サイエンティフィA35-500
アルシアンブルー8GXRowley Biochemical Danver33864-99-2
Allegra 6R CentrifugeBeckman
Anti-mouse CD16/32 (clone 93) 精製eBioscience14-0161-81
2-メルカプトエタノールSigma AldrichM7522
BD 1 ml TB シリンジBD シリンジ309659
BD 22 G x 1 (0.7 mm x 25 mm) ニードルBDプレシジョングライドニードル205155
BD 25 G 5/8 ニードルBD シリンジ305122
BD 30 G x 1/2 ニードルBD プレシジョングライド305106
ブルー MAX Jr, 15 ml ポリプロピレン コニカルチューブファルコン352097
クロロホルムフィッシャー・サイエンティフィックC298-500
サイトシール 60 マウンティング ミディアムリチャード・アラン・サイエンティフィック8310-4
Cytospin3ShandonNA
DakoCytomation ペンDakoS2002
ダルベッコ モディファイド イーグル メディウム (DMEM) 1xCorning cellgro15-013-CM
エタノールSigma Aldrich E7023-500ml
ウシ胎児血清 熱不活化Sigma AldrichF4135-500ml
FITC 標識 IgG2b K ラット アイソタイプ コントロールeBioscience14-4031-82
フルオレセイン イソチオシアネート (FITC) 標識抗マウス KIT (CD117; クローン 2B8)eBioscience11-1171-82
ホルムアルデヒドフィッシャー サイエンティフィックF79-500
ギムサ染色 修飾シグマ アルドリッチGS-1L
アイソセシアヘンリー・シャイン アニマルヘルス29405
May-Grunwald StainSigma AldrichMG-1L
Multiwell 6 well platesFalcon35 3046
Olympus BX60 MicroscopeOlympusNA
Paraplast Plus Tissue Embedding MediumFisher Brand23-021-400
PE Conjugated IgG Armenian Hamster Isotype ControleBioscience12-4888-81
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 1xCorning cellgro21-040-CV
フィコエリトリン (PE) 結合抗マウス FceRIa (クローン MAR-1)eBioscience12-5898-82
ヨウ化プロピジウム染色溶液eBioscience00-6990-50
組換えマウス IL-3Peprotech213-13
Safranin-o 認証Sigma AldrichS8884
組織培養フラスコ T25 25 cm2Beckton Dickinson353109
組織培養フラスコ T75 75 cm2Beckton Dickinson353110
トルイジン ブルー 1% 水性LabChem-IncLC26165-2
組換えマウス SCFPeprotech250-03
ック

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kitamura, Y. Heterogeneity of mast cells and phenotypic change between subpopulations. Annu. Rev. Immunol. 7, 59-76 (1989).
  2. Galli, S. J., Borregaard, N., Wynn, T. A. Phenotypic and functional plasticity of cells of innate immunity....

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