有害化学物質への曝露後の内皮細胞の遊走の評価

サマリー

特定の疾患の病態生理学を理解し、治療介入のための新しい戦略を特定するために、早期の内皮細胞(EEC)の移動の調査が重要です。次のプロトコルは、EECの調査に適応した細胞遊走を評価する技術について説明しています。

要約

（硫黄および窒素マスタードのようなアルキル化化学兵器を含む）の化学物質への曝露は、創傷治癒障害を含む臨床症状の過多を引き起こします。創傷治癒の生理学的過程は非常に複雑です。いずれかの脈管を通って（小説の形成）または血管新生（既存の血管の出芽） - 肉芽組織の形成は、予備的な創傷閉鎖をもたらし、新たな毛細血管のネットワークを提供し、このプロセスの重要なステップです。 vasculo-と血管新生の両方は、内皮細胞の遊走を向け機能が必要です。このように、初期の内皮細胞（EEC）移行の調査は治癒障害の化学誘起される傷の病態生理を理解し、潜在的な治療的介入のための新規な戦略を特定することが重要です。

我々は、エージェントの露出をアルキル化した後、創傷治癒の障害を評価し、TRのための潜在的な候補化合物を試験しましたeatment。私たちは、このプロトコルで概説技術のセットを使用していました。定量EECのケモキネシスを調査する改変ボイデンチャンバーを説明します。また、質的移行を評価するための軌道分析と組み合わせた創傷治癒アッセイの使用が示されています。最後に、乱れた細胞遊走の基礎となるメカニズムを識別するために、ミトコンドリア膜電位の調査のための蛍光色素TMRMの使用を示します。以下のプロトコルは、EECの調査のために適応されている基本的な手法について説明します。

概要

細胞遊走は、皮膚損傷後の開発、様々な疾患、および創傷治癒を含む多くの生理学的および病態生理学的プロセスにおいて重要です。

皮膚損傷に続いて、炎症は、損傷または壊死組織および造粒予備創傷閉鎖を駆動し、脈管（小説形成）または血管新生（既存の小胞の出芽^）1-3を介して、新しい毛細血管のネットワークの形成を可能にするが削除されます。 vasculo-と血管新生の両方が内皮細胞の移動を必要とします。血管の成長ネットワークは、最終的には角質化を受けるケラチノサイト増殖に酸素と栄養素を運ぶ新しい上皮を形成し、創傷閉鎖を提供するために不可欠です。

内皮細胞の障害の移行は、障害^4,5創傷^治癒の根底にある原因です。したがって、初期の内皮細胞の遊走を評価する方法がpathophysiolを探索するために必要とされます細胞遊走障害の術とは、治療的介入のための新規の戦略を特定します。

アルキル化剤（ 例えば、硫黄、窒素マスタード）への皮膚暴露は、障害⁶創傷^治癒を引き起こします。このような化合物が原因政治的に不安定な地域や比較的単純な合成における既存の備蓄に強い懸念の理由を20世紀に、いくつかの紛争で化学兵器として使用され、残ってました。硫黄マスタードは、​​最初1822年に合成されたが、SM暴露の分子および臨床病理学を詳細に理解されておらず、SMの暴露のための解毒剤が同定されていません。

いくつかの研究は、理解し、SM暴露後障害、創傷治癒をモデル化するために、その効果を確保することができる潜在的な候補化合物を試験するために行われています。シュミットら （2009）は、MOUにおけるSMと同様の特性を持つアルキル化化合物をクロラムブシルの効果を試験しましたSE胚様体モデルおよび血管形成⁷の劇的な、時には99％以上の減少を発見しました。この副作用は、ほとんどの生理的条件下で、血管内皮前駆細胞の増殖および移動によって支配され、開発の段階で顕著でした。したがって、これらの細胞は、アルキル化剤に特に敏感であることが確認されました。 Steinritz ら （2010）に、マウス胚様体モデルにおいて、特にSMの毒性を低減する能力について、特に、N-アセチルシステイン（NAC）およびアルファリノレン酸（ALA）中の反応性酸素種（ROS）の捕捉剤をテスト血管形成^8を復元します。一時的な保護効果は、過剰なROS形成は、創傷治癒にSMの副作用に貢献する可能性があったことを示し、観察されました。これらの効果は一時的なものであり、2つの候補化合物は、長期⁸の血管形成および創傷治癒を回復することが可能ではないかもしれません。 HoweveR、これらの実験は、細胞遊走の研究を可能にしました複雑な3Dモデルで行いました。従って、我々は、その後血管形成⁹の過程において重要な役割を持っているEECの細胞遊走に有益な効果のためにNACとALAをテストしました。

また、細胞極性、細胞遊走に必要とされるという証拠があります。 ROSの形成をもたらすミトコンドリア機能不全は、細胞極性を損なうことが示されたので、有害な細胞の移動に影響を及ぼし得ます。したがって、ミトコンドリア機能に関して、生細胞イメージングを行い、ROSスカベンジャーの効果を調べました。以下のプロトコルは、EEC、Boydenチャンバーアッセイ、細胞トラッキング解析および詳細におけるミトコンドリア機能の評価のためにTMRMの使用を含む創傷治癒アッセイの栽培のための一般的な要件について説明します。 EEC栽培と移行のための実験プロトコルの重要な側面が強調されています。

プロトコル

以下のプロトコルは、初期の内皮細胞の移動の調査のための手法について説明します。血管内皮細胞の適切な培養は、内皮表現型の適切な増殖および維持を確実にするために、ゼラチンを用いた細胞培養フラスコのプレコーティングを必要とします。

細胞培養フラスコの1プリコート

1. 0.1％の最終濃度になるように0.1 M PBS中のゼラチンを溶かします。
2. （詳細は特定のオートクレーブの手順を参照するための）液体オートクレーブ処理のためのパラメータで溶液をオートクレーブ。
3. 無菌の細胞培養フラスコ（T25細胞培養フラスコのため、例えば、少なくとも5 ml）でのオートクレーブ処理ゼラチン溶液の十分な量を加えます。
4. 少なくとも30分間、インキュベーター（37℃、5％CO _2を必要としないが、干渉せず）内にフラスコを移し。
5. 残りのゼラチン溶液を除去します。その後プレコートフラスコを使用します（参照細胞培養）またはs使用するまで無菌条件下で引き裂きました。

初期の内皮細胞の2細胞培養

注：以前に^10,11説明したように胚性幹細胞由来の早期内皮細胞（EEC）はPECAM-1陽性細胞分画の磁気活性化細胞選別によって区別マウス胚様体から得ました。

1. DMEM中でゼラチン被覆細胞培養皿に培養EEC、15％FCS、50 U / mlペニシリン、50 U / mlのストレプトマイシン、200μMのL-グルタミン、100μMのβメルカプトエタノールおよび1％非必須アミノ酸を補充しました。無菌条件下で細胞を処理します。 37℃、5％CO ₂で細胞を培養し、95％の湿度サブコンフルエンス（最大80％）になるまで。
2. 5比：サブ合流点に、1でセルを分割します。注：内皮細胞の剥離は重要なステップです。
   1. RTのACCUTASEで細胞を収穫。 、メディアを取り出し、PBSでリンスし、25単位cm ACCUTASEの1ミリリットルを追加します ^2。
   2. 細胞が分離するまで、2〜10分間室温でフラスコをインキュベートします。細胞を分散し、所望のアプリケーションに転送します。注：播種した細胞は、37℃のインキュベーターに格納されている場合、それが起こるようACCUTASEの化学的中和は必要ありません。しかし、ACCUTASE活性もFCSを含むDMEMを添加することによって低下させることができます。

3.ボイデンチャンバー

注：ボイデンチャンバーアッセイは8μmの孔径を有する光不透明なポリエチレンテレフタレートインサートシステムを使用して実行されます。

1. プレコートフィルターインサート（細胞培養ウェルの内部その適合は、このようにBoydenチャンバーを作成する）、少なくとも30分間、0.1 M PBSに溶解した0.1％ゼラチンを500μlを加えることにより。
2. 細胞は有毒化学物質にさらされる場合は、細胞収穫前に、特定の実験計画に応じて露光します。注：細胞を12.5μgのクロラムブシル/ mlのDMEMに曝露しました24時間。具体的な実験計画に関しては、命令が異なる場合があります。
3. 収穫EEC計数セルチャンバーを用いて細胞数を決定します。注：自動計数装置を使用することができるが、注意して使用する必要があります。マニュアル細胞計数は、より正確であり、強くお勧めします。
4. ボイデンチャンバーの下室区画に500μlの細胞培養培地を追加します。
5. 上室区画にフィルタインサートあたり500μlの細胞培養培地中で正確に10 ⁴ EECを追加します。気泡を除去します。
6. 正確に8時間、インキュベーターのフィルタインサートをインキュベートします。
7. PBSで一度洗浄し、細胞固定のための25分間両方の区画に0.5ミリリットルの4％パラホルムアルデヒドを含む培地を交換してください。 0.1 M PBSでフィルターが、少なくとも3回洗浄します。
8. メスで膜を切除。
9. 核staininのためにDAPIを含む封入剤を有する2つのガラスカバースリップ間の膜をマウントgです。向きに注意してください。膜の下室側に向かって移動した細胞のみがカウントされていることを確認します。
10. 400Xの倍率で蛍光顕微鏡を用いて、膜の下室側に向かって移動した細胞をカウントします。移動した細胞（ 図1A、1B）との膜孔を混同しないでください。生物学的複製（条件当たり少なくとも3生物学的反復）の合理的な数を調査します。

4.創傷治癒アッセイ

1. DIC顕微鏡を使用する場合、プラスチック表面ベースの培養皿またはウェルプレートを回避するが、代わりにガラスベースのデバイスを使用します。利用可能な機器に依存して、慎重に細胞培養皿またはプレートを選択します。
   注：位相差顕微鏡を使用している場合は、プラスチックベースの料理を使用することもできます。
2. 適切な細胞培養装置にEECを養う（ライブセルイメージングに適した例えば 4センチガラスボトムシャーレ）80％コンフルエンスになるまで。重要：合流を完了するために、細胞を培養しないでください。
3. 滅菌10μlのピペットチップを用いて単層を傷つけ。皿表面上にあまりにも多くの圧力なしそっと先端を押して、分離した細胞を除去するために、0.1 M PBSで二回other.Washに一方の側からスムーズに直線状に移動してください。
4. 培養皿に培地の十分な量を追加します。該当する場合は、調査する必要がある化合物を追加します。
   注：15 NGを含む1.5 mlの培地/ mlのアルファリノレン酸を添加しました。
5. ライブセルイメージングが可能な顕微鏡下で培養皿をマウントします。 5％CO _2、37℃、加湿雰囲気を確認してください。
   注：加湿媒体の蒸発を避けるために特に重要です。
6. 10分間隔で24時間かけてタイムラプス画像を取得します。大きなファイルサイズを計画します。注意：512×512ピクセルの解像度が通常は十分です。しかし、我々は、少なくとも1,024×1,0の画像を使用することをお勧めします24。
7. = 0時間tでのギャップ幅を測定し、tの= 24時間顕微鏡で提供されるソフトウェアの長さツールを使用するか、オープンソースソフトウェア（ 例えば、ImageJの）を使用します。注意：一般に、特定の画像取得及び解析ソフトウェアは、製造業者によって提供されます。そのため、ソフトウェアの使用に関する技術的な詳細については、マニュアルを参照してください。

5.細胞追跡

1. DIC顕微鏡を使用する場合、プラスチック表面ベースの培養皿またはウェルプレートを回避するが、代わりにガラスベースのデバイスを使用します。利用可能な機器に依存して、慎重に細胞培養皿またはプレートを選択します。
   注：位相差顕微鏡を使用している場合は、プラスチックベースの料理を使用することもできます。
2. 適切な細胞培養装置で補充したDMEM中に5×10 ⁴ EEC種（ 例えば、24マルチウェルプレート）、37℃で1〜2日間、95％湿度、5％CO ₂で細胞を養います。
3. 細胞は80にまで成長してきた場合には％コンフルエンス、それぞれの試験物質（例えば、12.5μgのクロラムブシル/ mlのDMEM）の存在下で、メディアと文化の新しいメディアで細胞を除去します。常に（個々のアッセイ系に依存して、24時間）一定時間、37℃での対照細胞（溶媒で処理し、 例えば、エタノール）が挙げられます。
4. 生細胞イメージング（37℃、5％CO ₂及び95％湿度）が可能な顕微鏡下で培養皿をマウント。事前に定義された間隔で、24時間かけてタイムラプス画像を取得します。 10分間隔で画像を取得します。
5. ImageJのプラグインMTrackJを使用して手動でEECの追跡を行います。視野からランダムに10個のセルを選択し、MTrackJのコマンドを「追加」を使用して時間内にポイント当たりのデータポイントを追加することで、その動きを追跡します。

注：MTrackJは[。Meijering、 Mtrackj「http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/」]で無料で利用可能で、ImageJがご利用できますです。ルで[Rasband、 ImageJの。 "http://rsbweb.nih.gov/ij/"]。MTrackJプラグインについての詳細なマニュアルは、「http://www.imagescience.org」で入手できます。

ミトコンドリア膜電位の6ライブセルイメージング/評価

1. 80％のコンフルエンスまで適切な細胞培養装置（ライブセルイメージングに適した例えば 4センチガラスボトムシャーレ）にEECの育成。
   重要：合流を完了するために、細胞を培養しないでください。
2. 該当する場合は、化学物質に細胞を公開します。注：細胞は、24時間12.5 / mlのクロラムブシルに曝露しました。具体的な実験計画に関しては、命令が異なる場合があります。
3. テトラメチルDMSO中（TMRM）の10mMストック溶液を調製します。光から保護します。注：ストック溶液は-20℃で保存することができます。
4. （：1,000希釈1）10μMの濃度での作業溶液に細胞培養培地中の原液を希釈します。光から保護しますできるだけ早く使用しています。注：作業溶液は、いくつかの時間（> 1時間）室温で維持することができる、しかし、新鮮なワーキング溶液の調製を強くお勧めします。
5. 1ミリリットルの作業溶液の新鮮な細胞培養培地（ローディング溶液）の2μlを添加します。
6. ローディング溶液で細胞培養培地を交換し、細胞をロードします。 37℃、5％CO ₂加湿雰囲気（インキュベーター）で15分間インキュベートします。注意：ほとんどすべての蛍光指示薬は、時間をかけて生細胞によってエクスポートされます。したがって、長期のロードまたは遅延解析を避けます。
7. 洗浄することなく、生細胞イメージングに適した顕微鏡下で皿を置きます。重要：蛍光指示薬は、したがって、不要な光の露出を避けるため、光に非常に敏感です。
8. 異なる画像間の比較可能性を確保するために取得パラメータを変更せずに画像を取得します。

結果

アルキル化剤への皮膚暴露は、紅斑、水疱形成および創傷治癒障害に関連する皮膚潰瘍を引き起こします。創傷治癒は、内皮細胞の移動に基づいているリンパ管のおよび脈管が必要です。定量的な移行はボイデンチャンバーアッセイを使用して評価することができます。アルキル化剤クロラムブシルのEECの図1Cの露光に示すように、細胞遊走⁹の有意な減少をもたらしました。直接24時間クロラムブシルへの曝露後、ROSスカベンジャーのアルファリノレン酸（ALA）の添加は、有意にほぼ対照のレベルに、この表現型を救出します。

ボイデンチャンバーアッセイは、移動した細胞の数（量）を評価するための適切なツールです。しかし、このアッセイは、細胞の移動挙動に関する情報を提供していません。2図は、未露光EECは傷と癒しのお尻にギャップを閉鎖することが可能であることを示しています24時間⁹内AY。これとは対照的に、アルキル化剤クロラムブシルに曝露さEECは、アッセイ⁹創傷^治癒に...

ディスカッション

有害化学物質への皮膚暴露は、しばしば深刻な創傷治癒障害をもたらします。根底にあるメカニズムは不明な点が多いです。創傷治癒は、異なる位相（止血、炎症、増殖およびリモデリング）で構成され、複雑なプロセスです。細胞移動は、しかし、それは、肉芽組織の形成のために最も重要であり、すべての段階に関与しています。ここで、新しい血管が脈管の脈管形成またはいずれかによって形成されています。

両方のプロセスは、前駆体と早期内皮細胞の影響を受けない移動を必要とします。細胞遊走および乱れ細胞移動のための基礎となるメカニズムを解明の評価は、毒物誘発される創傷治癒障害に対する新たな治療戦略を開発するために、関連性の高いです。

細胞遊走は、異なるアプローチによって評価することができます。一般的に使用される技法は、本来の抗体antigを分析するために導入されたBoydenチャンバーアッセイでありますアンは、白血球¹³の走化性の原因となりました。このアッセイは、化学誘引物質に応答して、下部コンパートメントにトランスウェルインサートの上部コ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ボイデンチェンバー
Corning FluoroBlok 組織培養(TC)処理インサート、24ウェル - 3 µm	Corning Incorporated	#351151
Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC) 処理インサート、24 ウェル - 8 µm	Life Sciences	#351152
(for use with Falcon Insert 24 well Companion Plate (353504)
Wound  healing assay
ガラス底皿	Word Precision Instruments, Inc.	#FD35-100
ミトコンドリア電位
TMRM (tetramethylrhodamine methyl ester)	Life Technologies	#T669
Cell culture
Accutase	PAA, Pasching, Austria	# L11-007
α-Linolenic	acid Fluka (Sigma), Steinheim, Germany	# L2376
Chlorambucil	Fluka (Sigma)、シュタインハイム、ドイツ	# 23125
Gelatin	Sigma-Aldrich、シュタインハイム、ドイツ	# G2500-100G

の評価