ここでは、アミロイドベータの脳定位固定剤を直接注入するためのプロトコルを紹介します。この方法論は、アミロイドベータが脳ニューロンに及ぼす短期的な影響に対処するための代替のin vivoマウスモデルを提供します。
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この記事について
サマリー
要約
アルツハイマー病は、高齢化に影響を与える神経変性疾患です。疾患の重要な神経病理学的特徴は、アミロイドβの過剰産生と罹患個体の脳領域におけるアミロイドβ斑の沈着です。年間を通して、科学者は、アミロイドベータ病理を複製しようとする多数のアルツハイマー病のマウスモデルを生成しました。残念ながら、マウスモデルは、選択的に、疾患の特徴を模倣します。神経細胞死、アルツハイマー病患者の脳における顕著な効果は、顕著に、これらのマウスに欠けています。ニューロンに最も毒性であることが証明されているアミロイドβの形 - - 定位脳へしたがって、私たちと他の人が直接アミロイドβの可溶性オリゴマー種を注入する方法を採用しています。このレポートでは、選択脳領域におけるアミロイドベータレベルを増加させるこの手術法を文書化するために雄のC57BL / 6Jマウスを利用しています。ザ注入ターゲットは、コリン作動性回路によって接続されている前脳基底部と一緒に、この脳の構造ため、海馬の歯状回である疾患における変性の領域のいずれかを表します。細胞死における同時増加とブロカの対角バンドの垂直肢におけるコリン作動性ニューロンの損失がある間定位注入を介して歯状回におけるアミロイドβの上昇の結果は、1週間以内に歯状回におけるニューロン損失の増加を明らかに前脳基底部の。これらの効果は、2週間まで観察されます。我々のデータは、現在のアミロイドβ注入モデルは、短期的に特定の領域のニューロン死に対処するための代替的なマウスモデルを提供することを示唆しています。このモデルの利点は、アミロイドベータが、空間的および時間的な方法で上昇させることができるということです。
概要
アミロイドβ（Aβ1-42）で構成されているアミロイド斑沈着は、アルツハイマー病（AD）の病理の重要な特徴です。多くの研究は、組換えオリゴマーAβ1-42の高いまたは毒性レベルが神経細胞死、シナプスジストロフィー、損失および機能障害を誘発することが示されています。ならびに学習および記憶の欠損1-4。影響を受けた脳領域は、海馬、皮質、及び前脳基底核と扁桃体の5,6のような皮質下構造を含みます。これまで、ADのAβ1-42病状をシミュレートしようとする多数のトランスジェニックマウスモデルが存在します。歪みに応じてこれらの動物は、ADの病理学的特徴の選択を検討するのに有用であることが判明しています。残念ながら、2トランスジェニックライン、APP23および5XFADを除いて、これらのマウスは完全にニューロン損失、ADの重要な側面を複製することはありません。でもAPP23と5XFAD、神経細胞死のobserで観察された神経細胞の損失でVEDは、微妙な年齢依存し、いくつかの選択領域7,8に単離しました。
野生型マウスの脳へのオリゴマーAβ1-42の直接注入はamyloidopathy 1,9,10の神経細胞死の側面を複製インビボモデルに優れたを提供します。一般的に利用するトランスジェニックマウスモ....
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プロトコル
注：すべての動物実験では、実験動物の管理と使用のための制度や国のガイドラインに従いました。
1.外科手術器具およびソリューションの準備
- すべてのステンレス鋼の外科手術用器具をオートクレーブ。
- 無菌の分子等級脱イオン蒸留水で200プルーフ無水エタノールを希釈することにより、70％エタノールを調製します。
- ハミルトンシリンジに29 G針を取り付けます。汲み上げ、1分間繰り返しナノ純水を噴射してハミルトン注射器と針の内部を清掃してください。 70％エタノールで、この手順を繰り返します。
- ハミルトンシリンジからプランジャーと針を外します。空気は、層流フードO / Nで部品を乾燥させます。
- 使用前に、30分間紫外線を針及び注射器を照射します。
- 0.9％の体積濃度を最終重量に分子グレードの水に塩化ナトリウムを溶解して生理食塩水を調製します。 Sterili0.2μmの細孔のフィルターを通してそれをフィルタリングすることによってソリューションをぜ。
2.オリゴマーAβ1-42の準備
- FA」など13の出版物に記載されているように単量体化とは、正確に5 mMのDMSO中で組換えヒトAβ1-42を再懸濁します。 <....
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結果
ヒト組換えオリゴマーAβ1-42の調製本発明の方法は、モノマー、ダイマー、トリマー、およびテトラマー（ 図1A）からなる可溶性オリゴマー種をもたらします。これらの低分子量のAβ1-42の種ではなく、原線維およびプラークは、ニューロン1,4,9,17-19に最も毒性であることが、多数の設定で示されています。オリゴマーAβ1-42は、マウスの脳内の神経細胞死を誘導するかどうかを確認するには、Aβ1-42（100μMストック溶液4μl）を9ヶ月齢の野生型C57BLの1半球に海馬のDGに注入しました/ 6Jマウス。 C57BL / 6Jための海馬の重量は、約0.018グラムであると推定され、従って、Aβ1-42の送達は、約100μgの/ gであったれます。 Aβ1-溶解に使用されるDMSOの等量のから成って-同じマウス脳の反対側のDGは、制御/媒体溶液を注入しました42（1×）をPBSで希釈した-比較のために。上述したように、以前にスクランブルか、我々が以前に.......
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ディスカッション
成功したAβ1-42注入を達成するために、実験者または外科医は、必要があります：1）無菌技術を使用します。 2）正しく、正確な座標を持つ対象の脳領域を特定します。 3）適切にAPとML軸に水平に脳と定位フレームにマウスを確保することができます。 4）精度のマイクロマニピュレーターを操作する能力を有します。 5）適切な術後ケアを確保します。これらの重要なステップに従っている場合、マウスは観察されない感染症の手術に耐える必要があります。
in vitroでの研究と一致して、私たちと他の人は、Aβ1-42が直接海馬に注入されたことが示されているADの主要な特徴の一つを描いた、神経細胞死1,4,9,10を誘発します。変性1のマーカーの増加によって補完される歯状回の体積に減少によって示されるように変性は、注射部位の近傍で明らかです。また、T彼はコリン作動性標識の低下やBF 1,10におけるTUNEL陽性染色の増加によって示されるように、海馬に突出ニューロンが逆行で.......
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開示事項
著者は、彼らが競合する金融利害関係がないことを宣言します。
謝辞
この作品は、神経疾患や脳卒中の助成金（CMT）にNS081333の国立研究所によってサポートされていました、アルツハイマー病協会の助成金NIRG-10から171721と国立精神衛生研究所（UHに）MH096702を付与し、高齢化資金によるアルツハイマー病研究に関する国立研究所（YYJとJBに）コロンビア大学パイロットグラントAG008702でセンター。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| ケタミンHCl(100 mg / ml) | ヘンリーシャインメディカル | 1049007 | 1kgあたり100mgケタミン |
| ラジン(20mg / ml) | ヘンリーシャインメディカル | 利用不可 | 1kgあたり10mgキシラジン |
| ブプレネックス(0.3mg / ml) | ヘンリーシャインメディカル | 1217793 | 動物1kgあたり0.1mgブプレネックス |
| A&β;1-42 | David Teplow/UCLA | 利用不可 | 100 μM;このアミロイドは、論文 |
| A&betaで使用されました。1-42 | Bachem | H-1368 | Teplow lab A&betaのアミロイドの代わりに使用できます |
| 。1-42 | American Peptide | 62-0-80B | のアミロイドの代わりに使用できます |
| 。1-42 | American Peptide | 62-0-46B | A&βを比較するためのコントロールペプチドとして使用できます。1-42 |
| NU4 抗体 (Oligomeric Amyloid Antibody) | Gift from William Klein/Northwestern U. | :2,000希釈抗 | はご利用いただけません |
| (ポリクローナルウサギ) | EMD Millipore | AB9234 | Nu4 の代わりに使用することができます。エンドユーザーがテストする必要があります |
| 6E10 抗体 (モノクローナルマウス) (アミロイド抗体) | Biolegend | sig-39320 | 1:1,000 希釈 |
| ChAT 抗体 (ポリクローナルヤギ) | Millipore | AB144P | 1:100 希釈 |
| デッドエンド 蛍光 TUNEL システム | Promega | G3250 | メーカーの指示に従ってください。 |
| DAPIとProlong Gold Antifade ReagentをDAPIで | Invitrogen | P36935 | スライドを隠すときに使用 |
| Fluorogold | Fluorochrome, LLC | 利用不可 | 2% 溶液 |
| 無水エタノール (200プルーフ) | Fisher Scientific | BP2818-4 | 消毒および消毒のための 70% エタノールの製造 |
| EC6625BOX | A&betaを分離するため;1-42 | ||
| Novex Tricine SDS ランニングバッファー (10X) | Life Technologies | LC1675 | 10-20% トリシンゲルのランニング用 |
| Novex Tris-Glycine Transfer Buffer (25X) | Life Technologies | LC3675 | 10-20% トリシンゲルの転写用 |
| SuperSignal Western Blot Enhancer | Thermo Scientific | 46640 | A&β;1-42信号;メーカーのプロトコールに従う |
| Protran BA79 Nitrocellulose Blotting Membrane, 0.1 μm | GEヘルスケアライフサイエンス | 10402088 | 10-20%トリシンゲルを転写するため |
| Xcell SureLock Mini-Cell | Life Technologies | EI0001 | 電気泳動 10-20%トリシンゲルを実行するためのaparatus |
| GenTeal潤滑剤アイジェル | バルティス | は利用できません | 手術中にマウスの目を湿らせておくため、地元の薬局で見つけることができます < |
| リフレッシュオプティヴ潤滑剤点眼薬 | アラガン | は利用できません | 手術中にマウスの目を湿らせておくために、地元の薬局で見つけることができます。GenTeal |
| Betadine | Stoelting | 50998 | |
| ラウンド/テーパードスパチュラの | VWR | 82027-490 | 動物の口を開くための |
| ブルドッグ セリファイズ クランプ (ジョー ディムス 9X1.6 mm;長さ:28 mm) | ファインサイエンスツール | 18050-28 | オプション。注射時に頭皮の皮膚を離すための |
| ストレートファインハサミ(刃先25mm;長さ11.5cm) | ファインサイエンスツール | 14060-11 | 皮を切るため |
| #3メスハンドル | ファインサイエンスツール | 10003-12 | |
| #11外科用ブレード | ファインサイエンスツール | 10011-00 | 皮切開を行うため |
| 学生標準パターン鉗子(先端寸法2.5x1.5mm;長さ 11.5 cm) | Fine Science Tools | 91100-12 | 縫合中に頭皮を閉じたまま保持するため |
| トリマーコンボキット | ケントサイエンティフィック | CL9990-1201 | 髪を剃る場合 |
| T/ポンプ 温水リサーキュレーター | ケント・サイエンティフィック | TP-700 | 手術中の動物の温暖化用 |
| 蘇生可能なウォーマイニングパッド (5インチ x 10インチ) | ケントサイエンティフィック | TPZ-0510FEA | 手術中に動物を温めるためにT /ポンプ温水リサーキュレーターに取り付けるため |
| コードレスマイクロドリル | ストールティング | 58610 | 0.8 mmのスチールバリを使用して頭蓋骨に穴を開けます |
| ラボ マウスとマウス付きの標準定位固定装置器具新生児ラットアダプター | Stoelting | 51615 | |
| Just for Mouse Stereotaxic Instrument | Stoelting | 51730 | Stoelting Cat. #51615 |
| Quintessential Ligtaxic Injector | Stoelting | 53311 | |
| Dry Glass Bead Sterilizer | Stoelting | 50287 | 滅菌用ステンレス製器具 |
| 滅菌外科用ドレープ (18" x26") | Stoelting | 50981 | |
| Hamilton Syringe 50 ml, Model 705 RN SYR, NDL | Hamilton Company | 7637-01 | 脳注射用; 異なる溶液に異なるシリンジを使用 |
| 29 G Needle, Small Hub RN NDL | Hamilton Company | 7803-06 | 脳注射用ハミルトンシリン |
| 1 ml BD ツベルクリンシリンジ | VWR | BD309659 | 麻酔と生理食塩水の投与用 |
| 30 G 針 (0.5インチ) | VWR | BD305106 | 麻酔と生理食塩水の投与用 |
| ポータブル電子 CS シリーズ スケール (Ohaus) | VWR | 65500-202 | 動物の体重を量って麻酔線量を決定するため |
| ホットプレート (トッププレート 寸法 7.25x7.25 インチ) | VWR | 47751-148 | 動物の温暖化用 手術後 |
| ソフシルクシルク縫合糸 C-1 カッティング3/8, 12 mm | Covidien | S1173 | 創傷閉鎖用 |
| Vetbond 組織接着剤 (3M) | Santa Cruz Biotechnology | sc-361931 | オプション:創傷閉鎖の補助用;縫合糸と一緒に使用します。 |
| 綿先端木製シャフト滅菌アプリケーター | フィッシャーサイエンティフィ | 22-029-488 | 創の洗浄と乾燥用 |
| ッシャーブランドスーパーフロストプラス顕微鏡スライドフィ | ッシャーサイエンティフィック | 12-550-15 | 脳切片の収集用 |
| VWR マイクロカバー ガラス 24 X 50 mm | VWR | 48393241 | 顕微鏡スライドの取り付け用 |
| Thermo Scientific Nalgene シリンジ フィルター 0.2 μm | フィッシャーサイエンティフィック | 194-2520 | 生理食塩水の滅菌用 |
| Viscot Medical | Medline | VIS1422SRL91 | 頭蓋骨の座標をマーキングするため |
参考文献
- Baleriola, J., et al. Axonally Synthesized ATF4 Transmits a Neurodegenerative Signal across Brain Regions. Cell. 158 (5), 1159-1172 (2014).
- Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in neurodegener....
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