移植のためのカプセル化サーモ前脂肪細胞の脂肪組織デポへ

サマリー

ここでは、腹腔内脂肪組織での熱産生のために脂質を消費し、肥満マウスのエネルギー散逸を増加させる異化細胞のカプセル化のためのプロトコルを提示します。

要約

細胞カプセル化は、半透過性膜内に生存細胞を捕捉するために開発されました。移植カプセル化細胞は、長期生存を達成するために、処置される宿主の組織中に低分子量の代謝産物を交換することができます。半透膜は、移植されたカプセル化された細胞は、免疫系による拒絶反応を回避することができます。カプセル化手順は、例えば、インスリン、他のホルモン、およびサイトカインなどの生物活性化合物の制御放出を可能にするように設計されました。ここでは、肥満マウスの腹腔内脂肪組織における熱産生及びエネルギー散逸のための脂質を消費異化細胞、（熱発生）のカプセル化のための方法を説明します。サーモ異化細胞のカプセル化は、肥満の予防と治療に潜在的に適用可能であること、および2型糖尿病があります。異化細胞の別の潜在的なアプリケーションは、アルコールまたは他の毒性代謝物および環境汚染物質の解毒を含むことができます。

概要

慢性疾患の発生増加^1は、治療用細胞集団²の移植に関する研究を刺激してきました。同系または同種異系幹細胞は、これらのアプリケーション²のために最も一般的に使用される細胞型です。しかし、これらの治療は、移植後の幹細胞の分化と移動の制御を可能にしないと、効率的なコストされていません。有益な機能を有する遺伝的に改変された細胞の移植は多くの疾患の治療を改善すると予想しています。しかし、遺伝子の細胞改変は宿主の免疫系によって認識され、したがって、これらの治療は、免疫抑制^3が必要です。インスリン産生細胞のカプセル化は、チャン博士⁴によって開発されました。技術は、塩化カルシウム溶液中に浸漬されたアルギン酸塩の液滴中の細胞のカプセル化に基づいています。アルギン酸分子は、（M）マンヌロンとグルロン酸（G）で ​​構成され、CAによって接続することができ²⁺。ゲル化後、ビーズを、ポリ-L-リジン（PLL）溶液に懸濁させます。このステップの間、PLLは、カプセルの膜を確立アルギン酸分子中のGとMに結合します。カプセルの膜の多孔度は、MとPLLの濃度、インキュベーション時間、温度を変化させることによって調節することができます。 PLLの結合はまた、アルギン酸塩の種類と濃度に依存します。のCa ²⁺イオンで ​​架橋されたアルギン酸塩マトリックスは、生理的環境中またはリン酸とクエン酸イオン濃度の高い共通の緩衝溶液中で不安定です。これらのバッファは、アルギン酸からのCa ^2+を抽出し、コアを液化することができます。アルギン酸塩コアの液状化は、細胞の移動および増殖のためのカプセルの内部の空間を提供します。ポリカチオン性ポリ-L-リジン（APL）とポリアニオンのアルギン酸に封入された細胞は、免疫グロブリンのために不浸透性であるが、毒素の栄養素の流入と流出を持っています。これらのAPLの特性は、長期のsuを有効に遺伝的に異なるホストへの移植後にカプセル化された細胞のrvival。エリオットらは、9年後の移植⁵人の患者にカプセル化されたブタの膵臓細胞を機能の生存を報告しました。

カプセル化技術は、マイクロカプセル化（3-800ミクロン）およびマクロカプセル（千ミクロンよりも大きい）に分類することができます。マイクロカプセルは、マクロカプセル⁶よりも耐久性があります。 1964年のチャン博士らによるその発見以来、マイクロカプセル化は広く、インスリン、他のホルモン、および生理活性分子^7を製造同化細胞のカプセル化のために使用されてきました。これらの治療は、線維症、免疫応答⁸を含む宿主組織内のいくつかの課題に直面していました。最初は、バイオポリマーの品質に関連する副作用が解決されました。しかし、同化細胞の移植は、依然としてホルモンの結果として、そのような線維症などの副作用を開始overpr特殊な腺の外側oduction。

ここ数十年では、肥満や2型糖尿病は、大流行^9に達しています。大人の人の30％以上は、世界中の過体重および肥満である^10。増加腹腔内（IAB）脂肪形成は、慢性炎症の発生率を増加させ、2型糖尿病、心血管疾患、特定の癌および他の病的状態^11-13を促進します。いくつかの証拠は、IABの脂肪に関連する病因が特定の脂肪細胞によって回避することができることを示唆しました。最近の研究では、IAB領域への皮下の脂肪細胞の移植は、代謝を改善し、インビボで ¹⁴げっ歯類の肥満およびインスリン抵抗性を減少させることができることを示しました。肥満とインスリン抵抗性の効果的な低減は、熱^15,16の形でエネルギーを放散することが可能な熱発生、脂肪細胞と関連しています。脂肪細胞の産熱変性は、安定なトランスフェクションによって達成することができますこのような脱共役タンパク質1（UCP1）またはUCP1および他サーモ^15,16遺伝子の発現を調節する遺伝子のミトコンドリアのプロトン脱共役に関与する遺伝子の。我々の最近の研究では、アルデヒドデヒドロゲナーゼの欠乏1 A1（ALDH1A1）が ^17,18、これらのマウスにおいて、肥満およびインスリン抵抗性を減少させるIAB脂肪の熱発生リモデリングをもたらすことを示しました。なお、熱発生ALDH1A1欠損（ALDH1A1 - / - ）のカプセル化前脂肪細胞は、IAB脂肪¹⁸の治療のための新規治療機会を示唆し、肥満の野生型マウスでIAB脂肪の同じ治療効果を媒介します。実験的な設定では、カプセル化された細胞は、費用対効果の高い方法¹⁹内の特定の細胞集団の効果を研究するために研究者を可能にします。ここでは、熱発生異化細胞株とその研究室のカプセル化と肥満のマウスモデルにおける治療的適用の方法について説明します。プロトコルは、Tを説明しますマイクロカプセルの製造（ 図1）のためのHREE相：アルギン酸ビーズ（ 図1A）、ポリカチオン性ポリ-L-リジン（PLL）マイクロビーズの表面（ 図1B）上の膜の形成および除去の形成アルギン酸コア（ 図1C）。

プロトコル

研究プロトコルは、オハイオ州立大学の倫理委員会によって承認されました。動物実験は、IACUCプロトコルによって承認されました。すべての手順は、層流とレベル2生物学的安全キャビネットの下で行いました。我々は、すべての標準的な安全要件と手順に従いました。 ^17、18に記載されているように、マイクロカプセルの製造のためのマイクロカプセル化技術が行われています。

材料の1の準備

1. オートクレーブ処理生理食塩水（水中の0.9％NaCl）で2％アルギン酸ナトリウム溶液10mlを準備します。生理食塩水中の0.05％PLL溶液を調製します。前日これらのソリューションを用意し、一晩攪拌します。使用前に0.22μmフィルターでソリューションをフィルタリングします。
2. 0.9％NaCl溶液に50 mMのクエン酸ナトリウム及び100mMのCaCl _2を用意し、それらをオートクレーブ。
3. すべてのソリューション、針、電極、およびビーカーをオートクレーブ。目詰まりを回避するために、ワイヤで十分にきれいな針。
4. （102マイクロカプセルがよく毎cm ^2のために必要とされており、カプセル¹⁸あたり約500個の細胞がある）カプセルに使用する細胞の適切な量を決定します。 200万細胞あたりアルギン酸ナトリウムの1ミリリットルを使用してください。
5. 「線維芽細胞増殖培地は、「10％ウシ血清を含む用意し、高グルコースで100 U / mlペニシリン/ストレプトマイシン（4,500 mg / Lのグルコース）ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）。
   1. DMEM、10％ウシ胎児血清、10μg/ mlインスリン、1μMのデキサメタゾン、0.5mMの3-イソブチル-1-メチルキサンチン、および100 U / mlのペニシリン/ストレプトマイシンを含有する「分化培地I 'を準備します。
   2. DMEM中で「分化培地II 'を含む10％ウシ胎児血清、10μg/ mlのインスリン、および100 U / mlペニシリン/ストレプトマイシンを準備します。
6. 10ミリリットルラジオ免疫沈降アッセイバッファごとにプロテアーゼ阻害剤錠剤を含む溶解緩衝液を調製する（RIPA緩衝液）。

2.アルギン酸マイクロビーズの調製（図1A）

1. 細胞培養フラスコから古い培地を除去します。 10mlのPBSで細胞を洗浄します。 0.25％トリプシン-EDTA（1コンフルエントのT175フラスコ当たり2ml）で懸濁液中の細胞を持参してください。
2. 血球計数器を用いて細胞懸濁液中の細胞をカウントします。細胞懸濁液から10ミリリットルのアリコートを使用し、製造業者の説明書に従って細胞をカウントします。室温で5分間480×gの遠心分離培地中に残存する細胞を遠心します。
3. ステップ1.4で説明したようにアルギン酸ナトリウムで細胞ペレットを一時停止します。 5ミリリットル注射器にアルギン酸ナトリウム - 細胞溶液を移します。
4. 23ゲージの針を追加し、溶液中の気泡を除去し、空気1mlのポケットを作成するための注射器を反転。
5. カプセル化の針注ぎ口の下の100mMのCaCl ₂溶液144ミリリットルを含む小さなビーカー（180ミリリットル）を配置します。先端approximでカプセル化に電極を取り付けately 2.5センチメートルの100mMのCaCl ₂溶液の表面の上。
6. しっかりとシリンジポンプでのアルギン酸ナトリウム - 細胞溶液を含む注射器を置きます。注射器の開口部にゴムチューブを取り付けます。アルギン酸ナトリウム - 細胞溶液がチューブの途中に入るまで、プランジャーを押してください。 5.4 kVのに電圧を調整します。シリンジポンプの12.06ミリメートルの直径を設定します。 3ミリリットル/時の速度を調整します。ポンプを起動します。カプセル化をオンにして、5.4 kVの電圧を維持します。
7. フードのウィンドウを閉じ、アルギン酸マイクロビーズの形成が終了するまで、不要な振動を避けることができます。すべてのソリューションは、針を通過した後、PLLでコーティングする前に、追加の20分間の100mMのCaCl ₂溶液中のアルギン酸ボール状のマイクロビーズを固めます。

PLL 3.コーティングマイクロビーズ（図1B）

1. アルギン酸ナトリウムセルボール状のマイクロビーズを含むビーカーを削除し、これらがMicroBを転送50ミリリットルの遠心チューブにEADS。マイクロビーズペレットからのCaCl ₂溶液を除去します。
2. 0.9％NaClを30mlのを追加することにより、アルギン酸セルボール状のマイクロビーズを洗ってください。そっと手でチューブを振ります。マイクロビーズは、重力によって沈殿させた後、25ミリリットルピペットで0.9％のNaClを削除します。合計3回の洗浄のためにさらに2回繰り返します。
3. アルギン酸ナトリウム溶液の各1ミリリットルのための0.05％PLL溶液10mlを使用してください。 10分間分1,000回転で0.05％のPLLと渦を追加します。
   注意：通常、10分PLLコーティングのために十分です。
4. PLLコートを形成した後、PLL溶液を除去し、3.2に記載したように、カプセルを3回洗浄します。

アルギン酸コアの4除去（図1C）

1. 50mMのクエン酸ナトリウム溶液30mlを加えます。 5分またはすべてのアルギン酸ナトリウムが溶解するまで待ってください。ステップ3.1.1で説明したように洗浄を3回カプセル。
2. 0.9％のNaClを削除し、50mlチューブに培養液の20ミリリットルを追加します細胞培養フラスコに細胞を含むすべてのカプセルを転送します。標準的な細胞培養条件^18歳未満のカプセル化された細胞を処理します。

異種移植と細胞間の代謝物の流入/流出の宿主細胞間相互作用やキネティクス（図2）を研究するためのインビトロ適用5.

1. 共培養のためにコンフルエントになるまで24ウェルプレート上で培養された宿主細胞。脂肪前駆細胞を培養するため「線維芽細胞増殖培地 'を使用します。
2. コンフルエント宿主細胞を含む24ウェルプレートにマイクロカプセルを転送します。単層（ウェルの102マイクロカプセル/ cm ^2の ） ^を達成するために、マイクロカプセルを追加します。
3. 6日間分化培地IIへの前脂肪分化培地Iと分化48時間ごとに、変化媒体を誘導します。 RIPA緩衝液中で細胞を溶解します。ウエスタンブロットを用いて、タンパク質の発現を分析するために条件当たり50μgのタンパク質を使用してください。

Treatmためのインビボ応用6.肥満のENT（図3）

1. 麻酔の麻酔の導入および維持のための酸素と2％のイソフルランのための酸素と4％のイソフルランを混ぜます。つま先のピンチにより十分な麻酔深度を確認してください。
   1. 乾燥から角膜を保護するために、目のかゆみ止め軟膏を適用します。
2. このような緑色蛍光タンパク質（GFP）のような恒久的に人工蛍光タンパク質で標識されたカプセル化細胞を使用します。
3. カプセル化された細胞を注入するために3ミリリットルの注射器と20ゲージの針を使用してください。
   1. 図3に示すように、生殖腺と腎臓の間腹腔内領域に配置されている各IAB脂肪デポに0.2mlのPBSに懸濁し、0.5×10 ^6個の細胞を注入します。の平均重量を有するマウスは、このPBSの容量とセル数を使用します40g添加しました。異なる重量または用量依存効果の決意のために持っているマウスでは細胞数と音量を調整します。

結果

図1は、マイクロビーズの生産の各ステップは、顕微鏡下で制御することができたことを示している。 図2（a）は、共培養する方法脂肪細胞をカプセル化された細胞の単層で示している。 図2Bは、脂肪細胞/マイクロカプセルの共培養を用いた定量的研究の代表例であること脂肪細胞の前記溶解物を、ウェスタンブロットを用いて分析したセクションで説明されました。カプセル化細胞は、この実験で分析されませんでした。千倍希釈プライマリATGLおよびβアクチン抗体を1で使用しました。アクチンβするATGLの割合は、3つの独立した実験の平均±SDとして示されています。同様の共培養アプローチは、mRNAを分析し、共培養中にカプセル化細胞と脂肪細胞の相互作用の効果を研究するために使用することができます。サーモALDH1A1をカプセル化されたデータが示す- / -脂肪細胞はencapsulaに比べて脂肪細胞におけるATGLリパーゼおよび脂肪分解¹⁸の有意に高いレベルを誘導しますテッドWT脂肪細胞。

ディスカッション

種々の方法は、乾燥、押出し、および乳剤¹⁹を含む細胞をカプセル化するために使用されてきました。この方法では、アルギネートビーズをPLLでコーティングし、アルギン酸塩コアをカプセル化を完了するために溶解され、針を通して押し出されます。この方法は、長年使用されているが、所望のサイズおよび形状の球形ビーズの形成は依然として困難です。カプセルのサイズは、アルギン酸ナトリウム溶液を、押出機の直径と針先端とのCaCl ₂溶液²⁰との間の距離の粘度に非常に依存します。針の先端とのCaCl ₂溶液の表面との間のより短い距離は、より小さなビーズが生産されています。記載されているプロトコルは、細孔（<32 kD）のでAPLの産生をもたらします。孔径は、実験前に^18に記載されているように、蛍光免疫グロブリン（> 32 kD）の蛍光小ペプチドを用いて試験することができます。このよ細孔のIZEを2週間、および少なくとも80日間で¹⁸脂肪組織へのin vivoでの移植後のin vitro...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
封止装置(VAR V1)	Nisco	LIN-0042	なし
KD 科学シリンジポンプ	KD scientific	780100Y	なし
オリンパス顕微鏡	オリンパスオプティカル	IX70-S8F2	なし
アルギン酸ナトリウム	Sigma	MKBP8122V	なし
ポリ-L-リジン臭化水素酸(PLL)		Σ 020M5006V	なし
塩化カルシウム		Sigma SLBJ2662V	なし
クエン酸ナトリウム三塩基性二水和物	Sigma	030M0200	なし
塩化ナトリウム	Σ	SLBD2595V	なし
Mini-PROTEAN TGX Gels	Bio-Rad	456-1093	なし
ATGL 一次抗体 (ウサギ由来)	Cell Signaling	2138S	なし
二次抗体 (抗ウサギ)	LI-COR	926-68071	なし
Radio-Immunoprecipitation Assay (RIPA) buffer	Boston BioProducts	D25Y6Z	なし
リン酸緩衝液生理食塩水 (PBS)	Σ	RNBD2893	なし
トリプシン	Gibco	25200-056
なし コルチゾン 10 かゆみ止め軟膏	コルチゾン 10	C4029138	なし
ダルベッコ改変鷲 ミディアム (DMEM)	Gibco	11965-092	なし
新生仔牛血清 (CS)	Σ	N4762	なし
ウシ胎児血清 (FBS)	Sigma	F4135	無
3-イソブチル-1-メチルキサンチン(IBMX)	Σ	I0516	なし
デキサメタゾン		Σ D4902	無し
インスリン(ウシ)	Σ	I5879	なし
プロテアーゼ阻害剤カクテル錠	ロシュ	4693159001	なし

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