ルシフェラーゼレポーター遺伝子でRAW264.7細胞をトランスフェクト

サマリー

マクロファージ細胞株RAW264.7への

トランスフェクションは、異物に対する細胞の自然な反応のために困難です。ここでは、ルシフェラーゼレポーター遺伝子をRAW264.7細胞にトランスフェクションするための穏やかでありながら堅牢な手順について説明しました。

要約

生物医学研究において、望ましい遺伝物質の細胞へのトランスフェクションは避けられない手順です。数多くの方法が説明されていますが、特定の種類の細胞はこれらの方法の多くに耐性があり、トランスフェ^{クション効率が低く}1、これらの細胞タイプの研究を妨げる可能性があります。このプロトコールでは、ルシフェラーゼレポーター遺伝子をプラスミドDNAとしてRAW264.7マクロファージ細胞株に導入するための最適化されたトランスフェクション手順を提示します。2つの異なるタイプのトランスフェクション試薬(脂質ベースおよびポリアミンベース)が記載されており、RAW264.7細胞がトランスフェクション手順によって最小限に変化し、得られた実験データが実験的治療の直接的な結果であることを保証するために、プロトコル全体に重要な注意事項が示されています。トランスフェクション効率は他のトランスフェクション法と比較して高くないかもしれませんが、記載されている手順は、刺激に対する細胞の生理学的応答を変えることなく、RAW264.7のルシフェラーゼシグナルを検出するのに十分な堅牢性を備えています。

概要

細胞中の核酸のトランスフェクションは、科学研究における多様な用途を有します。例としては、遺伝子発現をダウンレギュレートする遺伝子発現の異なる遺伝子エレメントの役割を研究するために、（2）タンパク質発現プラスミドを、目的のタンパク質を過剰発現し、（3）低分子干渉RNA（1）レポーター遺伝子を含みます。特定の遺伝子の発現レベルを操作すると、そのような操作の差動効果を測定することによって、研究者は、選択された生物学的系における遺伝子の機能を推定することができます。必ずしもすべてのトランスフェクション方法は、同じトランスフェクション効率を提供し、さらに同一のトランスフェクション法は^、1に等しく、すべての細胞型をトランスフェクトしません。従って、異なるトランスフェクション方法は、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン、カチオン性脂質トランスフェクション、カチオン性非脂質性ポリマートランスフェクション、エレクトロポレーション、およびヌクレオ^2,3として開発されてきました。

マクロファージへのトランスフェクションはESPEですによるマクロファージが（メチル化）DNA ⁴由来の細菌を含む異物に非常に敏感であるプロの食細胞であるという事実にインターネット上の下記URLで難しいです。外来DNAの導入は、サイトカインおよび一酸化窒素^5,6の産生をもたらすToll様受容体9（TLR9）経路を活性化します。これら....

プロトコル

1.プラスミドDNA精製

1. 製造業者のプロトコルに従ってマキシプレップキットを用いてプラスミドDNAを抽出します。 TE緩衝液500μl中に再懸濁プラスミドDNA。
2. クロロホルム：フェノールを実行イソアミルアルコール抽出およびイソプロパノール沈殿残留細菌の汚染物質を除去します。 LPSの存在は、トランスフェクション⁹に干渉する。
   1. プラスミドDNAを、15秒間激しく振る：クロロホルム：イソアミルアルコール（1、pHが8〜25：24）500μlのフェノールを加えます。フェノールは重篤な皮膚の薬傷の原因となり、重大な損傷があるまで火傷を常に感じていないように麻酔薬です。クロロホルム：フェノール行うドラフト中イソアミル抽出をし、注意してください。
3. RTで5分間混合物をインキュベートします。室温で10分間、13,000×gで遠心分離します。新しい1.5 mlのコレクションチューブに上部の水相の350μlのを転送します。
4. 下の有機相を含むチューブにTE緩衝液350μlのを追加。 15秒間激しく振ります。室温で5分間、13,000×gで遠心分離します。同じ1.5ミリリットルのコレクションチューブに上層の水相の350μlのを転送します。
5. 3M酢酸ナトリウム（pH5.2）の70μLを加え、よく混ぜます。 100％イソプロパノール700μlのを追加します。よく混ぜ、室温で10分間インキュベートします。....

結果

図1は、RAW264.7における2つのトランスフェクション試薬のトランスフェクション効率を比較します。タンパク質/ポリアミンベースのトランスフェクションは、約5％の効率（ 図1A）をもたらした脂質ベースの試薬 ​​は、典型的には約25％のトランスフェクション率を与えました。トランスフェクション効率の差ものpGL3-IκBζプロモーターレポーター（ 図1B）でトランスフェクトされたRAW264.7細胞におけるルシフェラーゼシグナルが観察されました。これらのトランスフェクト細胞へのLPSの添加は、ホタルルシフェラーゼシグナル、IκBζプロモーターレポーターの増加転写活性の直接的な指標を増加させました。言い換えれば、この結果はLPSが以前の報告と一致^7,8、IκBζ遺伝子の発現をアップレギュレートすることが示唆された。 図2は、典型的な結果は、一例として、脂質ベースのトランスフェクションを使用して、我々の実験で得られ示します。 Fiのから個々の信号値を取得した後reflyルシフェラーゼ.......

ディスカッション

ここで説明するプロトコルは、単独でトランスフェクション効率に焦点を当てたが、細胞の生理的状態の効率と保全のバランスを取ることを目的としません。具体的には、私たちの手順は、トランスフェクション試薬の毒性を最小化し、ルシフェラーゼシグナルを最大化することに成功しています。

プロトコルにおける一つの重要なステップは、細胞の健康状態です。生い茂った培養物は、それらの生理機能が変化し、長時間のRAW264.7細胞の連続培養は、細胞¹⁰の表現型および機能を変更することができるように、トランスフェクションには適していません。低継代番号がたて解凍した細胞を、トランスフェクションのために使用することをお勧めします。

もう一つの重要な考慮事項は、トランスフェクション試薬の選択です。脂質ベースのトランスフェクション試薬は、典型的に起因使用および商業的入手の容易さの研究に使用されています。しかし、これらの試薬のいくつかはunintende引き起こさD（および通常は望ましくない）トランスフェクションされた細胞^{11,12<.......}

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit	Life Technologies	K210007	どのmaxiprepキットでも機能します
フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール	Life Technologies	15593-049	分子生物学グレード。フェノールは有毒であるため、可能であればドラフト内で作業してください。容器内に液体の2つの層が形成される場合は、下部の透明な有機層を使用してください。
DMEM	Thermo Scientific	SH30243.01	温かみ 37 °C;使用前のCウォーターバス。
ウシ胎児血清	Thermo Scientific	SH30396.03	56°Cで不活化;Cウォーターバスを45分間使用してください。
Opti-MEM	Life Technologies	31985-070	使用前に少なくとも室温まで温めてください。
XtremeGene HP DBAトランスフェクション試薬	Roche	6366236001	室温まで温めてからご使用ください。
GeneJuice	EMD Millipore	70967	使用前に室温まで温めてください。
5x パッシブ溶解バッファー	Promega	E1941	30 ml は、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステム
デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステム	Promega	E1910

に含まれています。