同軸ノズルを用いて多能性幹細胞のアルギン酸カプセル化

サマリー

私たちは、多能性幹細胞(PS細胞)を同軸ノズルを用いてアルギン酸ヒドロゲルカプセルに封入する方法を確立しました。 これにより、細胞が過度に凝集するのを防ぎ、浮遊培養で細胞が受けるせん断応力を制限します。 この技術は、PS細胞の大量生産だけでなく、幹細胞ニッチの研究にも応用できます。

要約

多能性幹細胞(PS細胞)は、再生医療や薬物スクリーニングにおける役割から、集中的な研究の焦点となっています。 しかし、これらの用途でPS細胞を利用するためには、大量培養システムの開発が必要となります。 浮遊培養はPS細胞の量産化に有望な培養法の一つですが、凝集の制御や培地からのせん断応力の抑制など、未解決の問題も残っています。 これらの問題を解決するために、同軸ノズルを用いたアルギン酸カルシウム(Alg-Ca)封入法を開発しました。 この方法では、_N2ガスを共流させることでカプセルのサイズを簡単に制御できます。 N2ガスの流量が高すぎると液滴が破壊され、不均一なサイズのカプセルが破壊されるため、制御可能なカプセルの直径は500μmより大きくなければなりません。 さらに、Alg-NaおよびCaCl₂の濃度が低いと、非球状のカプセルが形成されます。 Alg-PLLコーティングのないAlg-Caカプセルは容易に溶解し、細胞の収集を可能にしますが、Alg-PLLコーティングを施していないカプセルからは細胞が漏れ出す可能性もあります。 実際、アルギン酸-PLLコーティングは細胞の漏洩を防ぐことができるだけでなく、壊れにくいという特徴もあります。 この技術は、カプセル化により細胞外マトリックスや分泌因子の濃度など、細胞を取り巻く微小環境を改変できるため、幹細胞ニッチの研究やPS細胞の大量生産の研究に活用できます。

概要

人工多能性幹細胞(iPS細胞)は、再生医療におけるその役割から、現在、集中的な研究の源となっています。 しかし、組織の再生には膨大な量の細胞が必要です。 例えば、1型^{糖尿病患者1}に必要な膵臓細胞は約10億個です。 しかし、従来のディッシュ培養では1×10個の⁵細胞/^cm2しか得られず、1型糖尿病患者を治療するのに十分な幹細胞由来の膵臓細胞を得るためには、^1m2の培養面積が必要でした。 そのため、マイクロキャリア²や懸濁培養などの多能性幹細胞を大量培養するシステムの開発が再生医療に求められています。 懸濁培養は有望な大量培養法ですが、ヒトiPS細胞の直接懸濁培養では細胞の凝集を制御することが困難です³。 実際、浮遊細胞はせん断応力にさらされ、細胞損傷³または分化⁴を引き起こします。

浮遊培養に関連する問題を解決するために、ハイドロゲルベースのカプセル化の研究が行われてきました。 ハイドロゲルカプセルでは、細胞は培地の流れから保護されています。 以前の報告では、アガロース⁵、PEG⁶、アルギン酸塩(Alg)など、さまざまな種類のハイドロゲルを細胞カプセル化に使用することが文書化されています。 Alg-Caハイドロゲルは、アルギン酸溶液をCaCl₂溶液に滴下した直後に形成され、酵素やキレート試薬によって容易に消化されるため、Alg-Caハイドロゲルは細胞カプセル化に最も有用なハイドロゲルの1つです。

ここでは、同軸ノズルを用いてiPS細胞のアルギン酸を安定的にカプセル化するプロセスを確立しました。 N2ガス流を液滴形成に利用することで、油などの他の試薬を必要とせずに細胞を均一なカプセルに封入することができます。 この方法では、N₂の流速とCaCl₂とアルギン酸塩の両方の濃度が、カプセルのサイズ、形状、および均一性に影響を与える主要な動作条件です。 本稿では、ハイスピードカメラと顕微鏡を用いて、これらの運転条件を最適化した事例を紹介する。

プロトコル

1.準備材料

1. 10mMのHEPES緩衝液を準備します。 RTでpHを7.0に調整し、0.9％に塩化ナトリウムを加えます。
2. 1.1で調製したHEPES緩衝生理食塩水を混合することにより、5％アルギン酸塩溶液および10mM EDTA溶液を準備します。 RTでpHを7.0に調整します。
3. 121℃で20分間、試薬（1.1、1.2）をオートクレーブ。
4. 90、10％ES-修飾FBSおよびマイトマイシンC10μg/ mlのを含むDMEM内でインキュベートすることにより、フィーダー細胞として処理され、2.0×10 ⁶マウス胚性線維芽細胞（MEF）細胞、 - 1.2層状ゼラチンコーティングされた60ミリメートルの料理を準備します - 120分。
5. マウス人工多能性幹（iPS）皿上の細胞を5mlの存在ES修飾FBS、2-メルカプトエタノール、非必須アミノ酸、50μM、および抗生物質（20％を含むDMEM高グルコース中のフィーダー細胞を維持しますペニシリンGナトリウム、硫酸ストレプトマイシンを100μg/ mlと100単位/ ml、およびamphoteriの250 ng / mlでCINのB）。
6. シード4×10 ⁵ゼラチンコーティングされた60ミリメートル皿にiPS細胞と37℃、5％CO ₂でそれらをインキュベートします。インキュベーション中に、毎日培地を変更します。 3の後- 4日間培養し、37℃で0.02％EDTA、5％CO _2を含む0.05％トリプシンの500μlの1分間細胞をトリプシン処理。その後、培養皿を10回タップすることで細胞を剥離。
7. （3回千μlをマイクロピペットでピペッティングにより単一細胞に解離マウスiPS細胞を以下）ES-修飾FBSおよび抗生物質の10％を含むDMEM 2.5 mlを加え3分間160×gで遠心分離細胞懸濁液、上清を除去し、細胞をカウント。細胞計数の後、ゼラチンコートディッシュに回収した細胞を再シードし、MEF細胞からiPS細胞を単離するために30分間インキュベートします。細胞の計数した後（通常は1 - 3×10 ⁶細胞/皿を収集することができます）、上の4×10 ⁵ iPS細胞を再シード皿。

アルギン酸ハイドロゲルカプセルに2細胞のカプセル化

1. 1.5および1.6に記載の方法と同様の方法により細胞を収集します。 3分間160×gで遠心分離した後、三回HEPES緩衝生理食塩水でのiPS細胞ペレットを洗浄します。 HEPES緩衝化生理食塩水で細胞を再懸濁した後、それ以外の場合はノズルを詰まらせる可能性が大きな凝集体を除去するために40μmのセルストレーナーを通して細胞懸濁液を濾過します。
2. HEPES緩衝生理食塩水内の細胞懸濁液2mlを、5％ALG-ナトリウム溶液3mlを混合します。最後に、3％のALG-Na溶液中で細胞懸濁液5mlを得られます。細胞密度は、望ましくは10以上⁶細胞/ mlです。
3. 5ミリリットルシリンジに細胞懸濁液を収集した後、注射器に同軸ノズル（ 図1A、B）をインストールし、シリンジポンプに設定してください。同軸ノズルの外針を通してN ₂ガ ​​ス流量（リットル/分より低い）を放出し、内側ノズルを通して細胞懸濁液を追い出します。
4. 0.5％のCaCl ₂溶液250ml中に液滴を収集し、10を待つ- 60〜90 rpmで攪拌しながら、ゲル化のために20分。

アルギン酸カプセルの3処理（オプション）

1. 0.05％、37℃で5分間、5％CO _2（w / v）のポリ-L-リジン（PLL）溶液をALG-カルシウムカプセルをインキュベートします。
2. HEPES緩衝生理食塩水でカプセルを洗浄した後、それらの表面上の電荷を中和するために10％FBSを含むDMEM中でそれらを培養します。コーティングされたカプセル（ 図1C）として、それらを利用しています。
3. 5分間、10mMのEDTAを含むHEPES緩衝生理食塩水でカプセルをインキュベートします。 EDTA処理したカプセルは、中空カプセル（ 図1C）として利用されます。

4.文化アルギン酸カプセルの細胞を収集

1. 37℃および5％CO ₂で振とうしながら75 rpmでカプセル化された細胞をインキュベート10日間。
2. 収集し、10分間CO _2を 37℃で、10mMのEDTAでカプセルをインキュベートし、5％。 3分間1,000×gで遠心分離することにより、PLL処理なしのアルギン酸カプセルから細胞を収集します。
3. 5分間5,000×gで - アルギン酸塩カプセルはPLLで処理している場合は、シリンジに取り付けられた1000でそれを遠心針で上下にピペッティング10回の周りによってALG-PLL膜を破ります。針の直径は、カプセルサイズ25 G（260μm）の針が、この実験で使用されているよりも低くなければならない（600ミクロン）
4. あなたは、細胞からのmRNAのサンプルを収集したい場合は、遠心分離した後、壊れたALG-PLL膜から厳密に細胞ペレットを収集します。残りのALG-PLL膜は、おそらくmRNA精製を防ぎます。

結果

プロトコル2.5で、排出されたアルギン酸塩溶液は直ちに放出（ - H図2A）の後に球状をなします。懸濁液を1L / minより低いN ₂流量で排出された場合、液滴の大きさが均一（ 図2I）です。 N ₂流量は、1L /分よりも大きい場合には、液滴（ 図2G、白矢印）を分解し、液滴の大きさは、不均一（ 図2J）となります。これを考えると、この方法を使用して500ミクロン未満の液滴を調製することは困難です。

ALG-NA（3％以上）の濃度が十分に（ 図3E-H、K、I）であればゲル化工程（プロトコル2.4）では、ALG-Naが_塩化カルシウム溶液中の球状ALG-カルシウムカプセルを形成される液滴。しかし、ALG-ナトリウム（3％未満）の低濃度は、非球面せ、カプセルの非滑らかな形状（ 図3A-D、I）、そのコー​​ティング...

ディスカッション

カプセル化培養物を直接懸濁培養物と比較することができます。浮遊培養は、カプセル化方法よりも多能性幹細胞を大量に得るための簡単​​な方法です。しかし、懸濁培養中の細胞の凝集を制御することは依然として困難です。カプセル化方法において、細胞凝集は、カプセル内に限定されるので、十分に制御することができます。以前の刊行物は、大きな細胞塊が自由懸濁培養⁷で登場し、一方カプセル化された細胞は、均一な大きさの凝集体を形成することを示しました。さらに、以前の報告は、強力な攪拌がPS細胞の直接懸濁培養における細胞死を引き起こすことを実証しました。このように制限された撹拌速度を必要とします。対照的に、カプセル化もサスペンション条件下で剪断応力から細胞を保護することができます。懸濁液中の細胞を成長させる際のカプセル化方法は、したがって、運転条件の自由度を可能にします。

「ove_content>はカプセル化は、量産プロセスの変更だけでなく、幹細胞研究の両方のための有用なツールである。幹細胞のカプセル化は、細胞外マトリックスおよび増殖因子を含む、幹細胞のニッチを研究するのに有用である。いくつかの研究者がいることを実...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
マウス胚線維芽細胞	Cell Biolabs	SNL 76/7
マウス人工多能性幹細胞	理研 バイオ研究センター	iPS-MEF-Ng-20D-17
DMEM 高グルコース	GIBCO	11995
ES qualified FBS	GIBCO	16141079
抗菌剤	GIBCO	15240
非必須アミノ酸	GIBCO	11140
2-メルカプトエタノール	GIBCO	21985-023
ESGRO 白血病抑制因子	メルクミリポア	ESG1107
トリプシン/EDTA	GIBCO	25300
26 G/16 G 針	星星精堂
10ml シリンジ	テルモ	SS-10ESZ
ナトリウム 塩化物	和光	191-01665
HEPES	SIGMA	H4034
アルギン酸ナトリウム	和光	194-09955
塩化カルシウム	和光	039-00475
ポリ-L-リジン (MW=15,000-30,000)	SIGMA	P7890
EDTA	同人堂	345-01865
シリンジポンプ	AS ONE
顕微鏡	オリンパス	IX71
顕微鏡	ライカ	DM IRB
ハイスピードカメラ	NAC 画像技術	Memrecam HX-3