塩化第二鉄誘発性頚動脈および腸間膜血管に血栓症のマウスモデル

サマリー

マウスにおけるFeCl₃誘発血栓症モデルは、ここで説明されています。腸間膜血管の生体内顕微鏡観察と頸動脈の血流測定により血栓の成長を監視する方法が提示されます。

要約

重度の血栓症とその虚血性結果、例えば心筋梗塞、肺塞栓症、脳卒中などは、世界的な主要な健康問題です。塩化第二鉄損傷は、露出した静脈または小径および大径の動脈における血栓の形成を迅速かつ正確に誘発するための確立された技術です。このモデルは、血栓症の病態生理学の研究、新規抗血栓薬の発見と検証、およびこれらの新薬剤の作用機序の理解において重要な役割を果たしてきました。ここでは、マウスの腸間膜血管および頸動脈に対するこの技術の実施について紹介します。この方法は、循環する白血球と血小板を蛍光色素で標識し、露出した腸間膜の生体内顕微鏡検査により、血栓の形成につながる損傷した血管壁でのそれらの蓄積を観察する方法を説明しています。頸動脈では、血栓形成による閉塞をドップラープローブで血流をモニタリングすることで測定します。

概要

血栓症および抗血栓薬の有効性の評価の開発に関与するメカニズムの研究は、十分に実験動物モデルを確立が必要です。大型動物モデルは、それらが齧歯類¹よりヒトに類似大型船を提供するように使用される最初でした。しかし、高コストは、必要な大きな施設とそれらを操作する上での困難は、遺伝的にそれらの使用に大きな欠点であり、げっ歯類の予備試験は決定的な結果を²与えた後に大型動物は、現在後期前臨床研究に制限されています。トランスジェニックおよびノックアウト株の広い可用性とインビボ試験のために必要な抗血栓薬の量を最小限に抑え、その小さなサイズで、マウスは主に血栓症の研究のために使用されています。したがって、血栓障害のいくつかのモデルは、マウス³で開発されてきました。

多くの確立された血栓症モデルがintimを混乱させる血栓⁴の形成を誘導する血流のサブ内皮細胞外マトリックスの暴露に続いて、血管壁の層。血栓は/及び凝固カスケード^5を活性化する組織因子の曝露または血小板の活性化を引き起こすコラーゲンの曝露から生じ得ます。いくつかの技術が、初期血管損傷を達成するために使用されます。 Pierangeli らは大腿静脈⁶のマイクロサージェリーツールを使用して機械的破壊モデルを開発しました。 Kikushi ら緑色光（540 nm）の⁷と関心の血管壁の特定の励起に続いて内皮細胞の脂質二重層内に蓄積する光反応性化合物（ローズベンガル）を投与することからなるモデルを説明しました。損傷はまた、短い高強度のパルスレーザー照射⁸によって誘導することができます。別の技術は、最初にラットの頸動脈に設立します塩化第二鉄（FeCl _3を ^）9の局所適用に構成されています。この場合、容器の露出は、内皮細胞¹⁰の脂質過酸化及び破壊を引き起こすのFeCl ₃で生成されたフリーラジカルに起因します。損傷は、血小板粘着及び凝集、並びに白血球の動員を誘発するいくつかの接着分子の発現を誘導します。これは、白血球、特に好中球は、血栓¹¹につながる血液凝固カスケードの活性化に重要な役割を果たしていることが実証されています。この方法は、凝固カスケードを再現するのに適しています。研究者らは、ヒトにおける血栓症は、主に病気の例で発生しているのに対し、このマウスモデルにおいて、血栓症は、通常、健康な血管において誘導され、心に留めておく必要があります。アテローム性動脈硬化の血管。

このモデルは、実装が非常に簡単であり、また、マウスにおいて有効であるように、それは今、主に使用される血栓症のモードですin vivo試験での小動物用L。また、この技術は、血管の様々な血栓の形成を誘導する可能性を提供します。ターゲット容器は大口径（頸動脈、大腿、大静脈）または小径（腸間膜、精巣挙筋^）12-14の動脈または静脈することができます。より最近では、それはまた、脳卒中¹⁵のモデルを開発するために、近位中大脳動脈で使用されました。血栓形成は、直接血小板および白血球の蛍光標識した後、生体顕微鏡検査によって観察または温度プローブまたはドップラープローブ^12,16,17との血流の減少を測定することによってモニターすることができます。このような閉塞時間、血栓形成時間または血栓サイズなど、い​​くつかのパラメータは、検討してもよいです。容器間の生理的な違いは、得られた血栓の大幅な変動に結果を検討しました。そのため、研究者らは、通常、彼らがmeasuするパラメータに応じて標的血管を選択します再および/またはそれらが調査する疾患の設定。典型的には、頸動脈のモデルは、大静脈の研究は、深部静脈血栓症の研究のために、より関連性の高いのに対し、心筋梗塞や脳卒中に関連するアテローム血栓症の研究のためのより適切です。異なる容器のアクセスも血栓の成長を測定するために使用される方法を決定します。例えば、腸間膜血管が生体内顕微鏡観察および血栓形成のダイナミクスの研究のためのこのモデルは非常に適して作るのアクセスが容易です。頸動脈は、血流の測定を可能にし、閉塞性血栓症を研究するための優れたモデルを提供しアクセスしにくいが、大きいです。

塩化第二鉄誘発される血栓症モデルは、この病理学の理解に多大な進歩を提供してきました。これは、血栓形成^18,19におけるフォン·ヴィレブランド因子の役割に焦点を当てた多くの研究で使用されています。遺伝MODIと組み合わせfication技術は、それは、血栓性疾患に関与する多くの特定の遺伝子の同定を可能にしました。ラムラニら 。例えばJAK2 ^{V617F遺伝子}のノックインが不安定血餅²⁰の加速形成に関連していることが示されています。 Zhang らは、P2Y12血小板受容体の生理的意義を調査し、血小板に特異的にこの受容体を過剰発現するトランスジェニックマウスのみを、FeCl _3を ²¹で損傷した腸間膜動脈においてより迅速で安定した血栓の形成を示したことを実証しました。フィブリン分解プロセスにおける組織型プラスミノーゲン活性化因子（tPA）およびウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（uPA）の重要な役割は、この方法²²において検討されています。さらにこのモデルはまた、 インビボで多くの新規薬剤のフィブリン溶解能力をテストする簡単かつ正確な方法を提供します。例えば、Wang らは、目のためにこのモデルを使用しています活性化血小板²³を標的と新規組換えプラスミノーゲン活性化因子のE前臨床検証。この方法は、ダニ、吸血コウモリ、及び蚊の唾液から、またはターゲット^24〜27の固有の識別とヘビの毒から単離された治療用タンパク質の検証を可能にしました。これらの例は、塩化第二鉄モデルの汎用性を実証します。本稿では、二つの方法に焦点を当て、二つの異なる容器の種類に塩化第二鉄誘発される血栓症を研究します。腸間膜血管および頸動脈。

プロトコル

動物に関わるすべての実験はアルフレッド医学研究および教育分署動物倫理委員会（E / 2015分の1534 / B）によって承認されました。すべての外科的操作は、全身麻酔下で行われ、動物がどの段階でも痛みを経験しませんでした。記載されている全ての実験は、非回復しています。

1.準備

1. フィルターペーパー（1ミリメートル×2ミリメートル）の薄​​いバンドをカットします。
2. 新たに4％の塩化第二鉄の2つの溶液を調製し（w / v）の6％（W / V）の脱イオン水に希釈しました。 0.22μmのを介して濾過し、PBS中のローダミン6G液0.3％を、準備します。
3. シリンジラッパーの白いプラスチックの小片（5ミリメートル×1センチ）カット。

生体顕微鏡で観測された2腸間膜細動脈の血栓形成

1. 10-12週齢の雄のC57BL / 6野生型マウスを秤量し、腹腔内注射しかしケタミンの混合物（100mg / kg）およびキシラジン（10mg / kg）で麻酔に応じ。つま先、尾および/または皮膚のピンチに反応し、角膜および眼瞼ピンチからの反応性、およびウィスカの動きが存在しないことによって麻酔の深さを監視します。必要に応じて、動物の麻酔を維持するために、ケタミンの第二の用量（50mg / kg）を注入します。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を適用します。 37℃に調整し、加熱パッド上に配置された小さなペトリ皿にマウスを置きます。
   注：IP注射は、動物のための痛みをもたらす可能性があるが、この不快感の持続時間は（3秒未満）最小限になります。注射に伴う痛みや不快感は、経験豊富で有能な人材と適切な針のサイズ（25 G）を使用することによって最小化されるであろう。すべての手順の後、頸椎脱臼が続くケタミンとキシラジンの過剰投与を使用して、すべての動物を安楽死させます。
2. 皮膚に約3cmの腹部正中切開を行い、慎重に腹膜を切りました。
3. ペットの側にマウスを置きますRI料理は、静かにその腸を体外に出す、慎重にペトリ皿の表面に適切な容器を持って来るために2綿棒で腸間膜を広げます。繊細なワイパーと正しく乾燥させます。
   NOTE：腸間膜血管の動きを制限するために、パパベリンは、腸の蠕動運動を阻害するために使用することができます。
4. 血管を拡張し、白血球と血小板を標識するために29 Gシリンジでマウスの尾静脈にローダミン6G（0.3％）の30μLを注入するために温水にマウスの尾を浸します。
5. 倒立顕微鏡下でペトリ皿を置き、明視野チャネルを使用して、選択された細動脈に焦点を当てています。
6. 6％（w / v）の塩化鉄（III）でろ紙のバンドを浸し二鉗子で動脈に濾紙を適用します。最初のものは、ろ紙、穏やかに関心のある領域にそれを押して第二のものを保持します。ろ紙の堆積後の最初の10秒で血栓形成を観察します。
   注：それは非常にCOMMです囲まれた微小血管系とろ紙の堆積と優しく圧力の精度を傷つけるためにでこの問題を制限することが重要です。
7. ろ紙、：（ピーク励起557 nmの発光ピーク576 nmのTRITCチャネル）蛍光顕微鏡により血栓形成を観察します。血栓にローダミン6Gおよびそれらの凝集を取り上げてきた循環白血球と血小板を観察することは、識別することは容易です。
8. 塩化鉄（III）への曝露の1分後にろ紙を脱いで、血栓の形成を監視し続けます。 PBSで容器を洗ってください。
9. ローダミン6Gと血小板および白血球の標識で強調血栓の動的生成を観察し、記録します。画像をキャプチャし、血栓の大きさを測定します。本明細書に提示される画像は、TRITC蛍光チャネルにおける対物4X、ものの、倒立生体顕微鏡を用いて得ました。
10. Fすべての手順をollowing、頸椎脱臼が続くケタミンとキシラジンの過剰摂取を用いて動物を安楽死させます。

3.頸動脈血栓形成は、血流速測定により評価し

1. 10〜12週齢の雄をC57BL / 6マウスを秤量し、腹腔内注射しかしケタミン（100mg / kg）およびキシラジン（10mg / kg）の混合物に応じて麻酔。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を適用します。
2. 37℃に調整し、加熱パッド上に、足に粘着テープを使用して、手術用顕微鏡下でマウスを修正しました。
3. 1つのワイパーの外に小さな枕を作り、少し頭を上昇させるために、マウスの頭の下にそれをテープで固定します。 （上の歯を使用します）鼻をプルダウンするトングと糸ループを使用してください。これは、簡単にアクセスするための頸動脈の領域を露出します。
4. ダウン胸骨へ、直接顎の下の皮膚の小さな深さ5mmの切開を行います。
5. FAを分析SCIAと分岐上記左または右総頸動脈のいずれかの断片を分離します。
6. 慎重イン間の動脈とそれらを分離するための神経ピンセットをご紹介します。近い動脈に実行して神経を妨害し、血管への損傷を引き起こすことができるように頸動脈のあまり触れないように注意してくださいしないでください。動脈の5mm以上のセクションを分離します。
7. 任意の液体がFeCl _3をを妨害することを防ぐため、適切にワイパーと動脈の領域を乾燥させます。
8. のFeCl _3は、周囲の組織に浸していないので、総頸動脈の単離された部分の下に小さな白いプラスチック片を入れてください。この目的のために、ゆっくりと動脈の下にプラスチック製の用紙をスライドさせ、次に第1のピースをもたらすために第二の鉗子を使用しています。
9. 4％（w / v）の6％（w / v）の塩化第二鉄で濾紙を​​浸し、動脈の周りにそれをすべて置きます。
10. 3分間の露光後、ろ紙を脱いで、WエリアをPBSで洗浄し、乾燥i番目のワイパー。
11. 損傷領域で容器の周りにドップラーフロープローブを配置し、流れの変化の記録を開始。成体マウスの健康な総頸動脈では、流れは、通常、約1ml /分です。注意！塩化第二鉄とプローブの接触は、任意の接触は避けるべきであるので、プローブを損傷します。本明細書に提示されるデータは、ナノドップラーフロープローブ0.5 PBSを備えた遷音速システム株式会社流量計、TS420血管周囲モジュールを得ました。
    注：塩化第二鉄の濃度が異なるオクルージョン時間が生じる血栓形成の動態を変更することができます。このように、塩化第二鉄（w / v）の6％への曝露は、塩化第二鉄（w / v）の4％に曝露よりも​​速く閉塞をもたらします。
12. すべての手順の後、頸椎脱臼が続くケタミンとキシラジンの過剰投与を使用して、すべての動物を安楽死させる、慎重にドップラープローブを清掃してください。

結果

ローダミン6Gの蓄積を明らかにする腸間膜の蛍光生体顕微鏡観察は、FeCl _3をすることによって損傷した血管壁に沿って、血小板と白血球を標識しました。部分的な血栓形成の進行は200ミクロンの腸間膜血管（ 図1）でモニタされます。血栓がゆっくりと表示され、FeCl _3をへの暴露の最初の分（ 図1、tは60秒=）の後に明らかに識別可能です。 40秒のFeCl ₃に浸したろ紙を除去した後、血栓症が急速に進行し、最終的に（ 図1、T = 100秒）観察容器全体のセクションの壁上に存在します。

図1：血栓の成長は、腸間膜血管に蛍光生体顕微鏡で観測された画像は15秒で撮影した...

ディスカッション

塩化第二鉄誘発される血栓症モデルは、優れた研究ツールです。この研究で示されるように、実装が非常に容易であり、生体顕微鏡またはドップラー流量計と組み合わせて使用​​する場合には、血栓形成の良好なリアルタイムモニタリングを提供します。長時間露光とのFeCl ₃の濃度を調整する、それはまた、非閉塞または閉塞のいずれか血栓を生成する可能性を提供しています。

しかし、この方法はまた、いくつかの制限を有します。頸動脈において、主な欠点は、閉塞時間を効果的に修正することができるが、モデルの再現性を正確に血栓サイズおよび成長速度^10を制御するために、あまりにも弱いままであることです。いくつかのグループは、モデル^28,29の標準化に取り組んできました。オーエンスら 。信頼性と再現性の閉塞時間は、実際に、そのような年齢のようなすべての変動要因を減少させることによって得ることができることを示唆しマウス、マウスの遺伝的背景、利用麻酔、塩化第二鉄の博覧会のための技術および塩化第二鉄溶液²⁸の濃度。ドップ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Whatman クロマトグラフィー ペーパー	GE Healthcare	3030917
塩化鉄 (III) 40% (w/v)	VWR	24212.298
ローダミン 6G	シグマ	R4127
倒立顕微鏡	オリンパス	IX81
デジタル白黒カメラ	オリンパス	XM10
ドップラー流量計	Transonic	TS420
ナノドップラーフロープローブ	Transonic	0.5 PBS
ケタミン	ホスピラ	0409-2051-05
キシラジン(ランプン)	バイエル	75313
ペトリ皿	Sarstedt	82.1472
インスリン注射器 (29 G)	BD 超微細	326103
綿チップ アプリケーター	BSN 医療	211827A
Dynek dysilk 縫合糸	Dynek Pty Ltd	CS30100
Dulbecco のリン酸塩緩衝生理食塩水 (PBS)	Gibco life technologies	21600-069
加熱パッド	Kirchner	T60