この共免疫沈降プロトコルは、ヒト細胞におけるインフルエンザAウイルスの核タンパク質と抗ウイルスMx1タンパク質との間の相互作用を研究することを可能にします。このプロトコルは、Mx1およびインフルエンザAウイルスの核タンパク質の共免疫沈降を成功させるためのN-エチルマレイミドの重要性を強調しています。
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この記事について
サマリー
要約
タンパク質間の相互作用を研究することは、その機能を理解するための鍵となります。複雑なサンプル中のタンパク質と他の高分子との相互作用を研究するために頻繁に使用される非常に強力な方法は、共免疫沈降と呼ばれます。記載された共免疫沈降プロトコルは、抗ウイルス性粘液ウイルス耐性タンパク質1(Mx1)とそのウイルス標的の1つであるインフルエンザAウイルス核タンパク質(NP)との間の相互作用を実証し、さらに調査することを可能にする。プロトコールはトランスフェクションされた哺乳動物細胞から始まりますが、インフルエンザAウイルスに感染した細胞を出発物質として使用することも可能です。細胞溶解後、ウイルスのNPタンパク質を特異的抗体でプルダウンし、得られた免疫複合体をプロテインGビーズで沈殿させます。NPのプルダウンの成功と抗ウイルスMx1タンパク質の共免疫沈降は、その後、ウェスタンブロッティングによって明らかになります。Mx1とNPの共免疫沈降を成功させるための前提条件は、細胞溶解バッファー中のN-エチルマレイミド(NEM)の存在です。NEMは遊離チオール基をアルキル化します。おそらく、この反応は、Mx1、そのウイルス標的、または未知の第3成分の特定のコンフォメーションを保持することにより、弱いおよび/または一過性のNP-Mx1相互作用を安定化させます。共免疫沈降実験の重要な制限は、タンパク質がタンパク質Gビーズまたは抗体に非特異的に結合することによって引き起こされる、汚染タンパク質の不注意なプルダウンです。したがって、誤検知結果を除外するための制御設定を含めることが非常に重要です。記載されている共免疫沈降プロトコルは、異なる脊椎動物種由来のMxタンパク質とウイルスタンパク質、任意のタンパク質のペア、またはタンパク質と他の高分子との相互作用を研究するために使用することができます。弱い相互作用や一過性の相互作用を安定させるためのNEMの有益な役割は、各相互作用ペアについて個別に検証する必要があります。
概要
ミクソウイルス抵抗（MX）タンパク質は、ウイルスの病原体に対する先天性免疫防御の重要な部分である。これらのタンパク質は、I型およびIII型インターフェロンにより誘導される大ダイナミン様GTPアーゼである。対応のMx遺伝子は、1つまたは複数のコピーのほぼすべての脊椎動物に存在し、それらの遺伝子産物は、 オルソミクソウイルス科 （ 例えば 、インフルエンザウイルス）、 ラブドウイルス科 （ 例えば 、水疱性口内炎ウイルス）、 ブニヤウイルス科 （ 例えば含む、広範囲のウイルスを阻害する。 、ラクロスウイルス）およびレトロウイルス （ 例えば、ヒト免疫不全ウイルス-1）1-4。それは、これらのタンパク質は、これらのウイルスの任意の明白な共有の一次配列モチーフのないウイルスのような幅広い配列を、認識かは不明である。潜在的に、それらのウイルス標的にはMxタンパク質の相互作用を分析する他の宿主細胞因子との高次複合体を含む、トン分子機構を理解するのに役立ちます帽子は、ウイルスとそのホスト間の軍拡競争に進化してきた。
哺乳類のMxタンパク質およびウイルス標的の間の相互作用は、ヒトMxAの最も広く研究されてきた。人間のMxAはオルトミクソウイルス、インフルエンザAおよびThogotoウイルスを含む多くのウイルスの複製を阻害すること....
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プロトコル
注：以下のトランスフェクションおよび共免疫沈降プロトコルは9センチメートルシャーレ形式のために確立されている。他の形式のプロトコルをスケーリング後も可能である。
ヒト胚腎臓（HEK）293T細胞を播種1.
- 10％ウシ胎児血清、2mM L-グルタミン、0.4mMのピルビン酸ナトリウムを補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）12mlの9cmのペトリ皿あたり1.2×10 6細胞でのトランスフェクションの前にHEK293T細胞を一日に播種、 0.1mMの非必須アミノ酸、100 U / mlペニシリン及び0.1mg / mlのストレプトマイシン。
- 細胞を37℃で16時間、5％CO 2を成長させる。
- 視覚的にトランスフェクション前に反転光顕微鏡で細胞の形態および生存を検査。細胞は、最適なトランスフェクション効率のためのサブ集密にする必要があります。
HEK293T細胞の2リン酸カルシウムのトランスフェクション
注意：9 cmディッシュあたりpCAXL-Mx1の1-3μgのとの組み合わせでpCAXL-NPまたは空pCAXLプラスミドの使用0.5〜1μgの。全試料中の全プラスミドDNAの等量を使用する。必要に応じて、空のプラスミドで調整します。
- ....
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結果
N-エチルマレイミドは、システインプロテアーゼ（ 図1）を阻害するために、例えば 、不可逆的に遊離のチオール基を修飾するために用いることができる有機化合物である。
抗ウイルスMx1のタンパク質は、インフルエンザAウイルスの核タンパク質と相互作用することによりウイルス複製を阻害する。ここで説明する最適化された共免疫沈降プロトコルは、このNP-Mx1の相互作用を研究することができます。 HEK293T細胞を、インフルエンザNPタンパク質の非存在下または存在下での抗ウイルスMx1のタンパク質のための発現ベクターでトランスフェクトした。次に、NPタンパク質は、NP特異的モノクローナル抗体を用いた全細胞溶解物から、プルダウンした。 図2は、Mx1のタンパク質が共発現NPの存在下で共免疫だけであることを示している。 NPの非存在下でのMx1のの可能性非特異的共免疫沈降は、抗NP抗体によるまたはにMx1のの非特異的結合によってMx1のタンパク質の非特異的なプルダウンいずれかによって引き起こされるプロテインGビ.......
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ディスカッション
抗ウイルス性タンパク質およびそれらのウイルス標的の間の相互作用を研究することは、これらのタンパク質の抗ウイルス機構の詳細を理解することが非常に重要である。これは、ウイルスとそのホストが共同どのように進化したかに新たな洞察を与え、新たな抗ウイルス戦略の開発のための基礎となり得る。ここで説明する最適化された共免疫沈降プロトコルは、マウスMx1のタンパク質とそのウイルス標的、インフルエンザNPタンパク質間の相互作用を研究することができます。 NP-Mx1の相互作用がNEM（ 図3）の非存在下では検出不可能であるように、このプロトコルの最も重要な側面は、溶解緩衝液中のNEMの添加である。今日まで、それはNEMの存在は、この相互作用を検出することが重要である理由は不明である。しかし、このプロトコルは、システインが関与している場合は特に、特定のタンパク質立体構造の安定化に依存する他の弱いおよび/または一時的な相互作用を研究するのに有用である可能性があります。
アン一般に、共免疫沈降アッセイの重要な制限は、高親和性で相互作用パートナーのいずれかの立体配座エピトー.......
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開示事項
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言。
謝辞
この作品はFWO-ブラーンデレン、IOFプロジェクトIOF10 / STARTT / 027とゲント大学特別研究助成BOF12 / GOA / 014によってサポートされていました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| DMEM 高グルコース | Gibco | 52100-047 | |
| N-エチルマレイミド | Sigma | E-3876 | Toxic |
| Igepal CA-630 | Sigma | I-30212 | 別名 NP40 |
| プロテアーゼ阻害剤 カクテル | Roche | 11 873 580 001 | |
| 抗NPモノクローナル抗体 | NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository | NR-4282 | 腹水 クローン A1 と A3 の腹水ブレンド |
| 抗 RNP ポリクローナル血清 | NIH Biodefense and Emerging Infections 研究リソース リポジトリ | NR-3133 | A/Scotland/840/74 (H3N2) |
| Protein G Sepharose 4FF | GE Healthcare | 17-0618-01 | |
| Hyperfilm ECL 18 x 24 cm | GE Healthcare | 28-9068-36 | |
| ECL ウェスタンブロッティング基板 | Pierce | 32106 |
参考文献
- Verhelst, J., Hulpiau, P., Saelens, X. Mx proteins: antiviral gatekeepers that restrain the uninvited. Microbiol Mol Biol Rev. 77 (4), 551-566 (2013).
- Goujon, C., et al. Human MX2 is an interferon-induced post-entry inhibitor of HIV-1 infection. Nature.....
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再版と許可
