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方法論記事

慢性後のマウス脾細胞におけるDNA損傷と修復の測定

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DOI:

10.3791/52912

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2015年7月3日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Radiological Protection Research and Instrumentation, Canadian Nuclear Laboratories

この記事について

サマリー

マウス脾臓リンパ球への慢性的なin vivo低線量照射によって誘発される可能性のあるDNA損傷レベルとDNA修復能力の変化を評価するためのプロトコルが、フローサイトメトリーを使用してDNA二本鎖切断のマーカーであるリン酸化ヒストンH2AXを測定することによって提示されます。

要約

低線量放射線被曝は、高い放射線量によって生じる効果の量と質が異なる種々の生物学的効果を生成することができます。適切かつ科学的に正当な方法で、環境職業と公衆衛生の安全性に関連した質問に対処することは頻繁に正確に、放射線や化学物質をイオン化するような低線量の汚染物質の生物学的効果を測定する能力に依存しています。 DNA損傷と修復は、癌などのそれらの潜在的な長期的結果に起因する健康リスクの最も重要な初期の指標です。ここでは、マウス脾臓細胞におけるDNA損傷と修復のγ-及びβ-低線量の放射線に、インビボの曝露の慢性の効果を研究するためのプロトコルについて説明します。 DNA二本鎖切断、γH2AX呼ばれるリン酸化ヒストンH2AXの一般に受け入れられて、マーカーを使用して、我々は、DNA損傷のレベルだけでなく、評価することができる方法を示すだけでなく、変化しますDNA修復能に潜在的に生体内のエクスポージャーにおける低用量によって生成さ。フローサイトメトリーは、多数のサンプル中の免疫蛍光標識されたγH2AXの、高速で正確かつ信頼性の高い測定を可能にします。 DNA二本鎖切断修復DNAの十分な数の修復を誘発するために破壊生成するために2 Gyでの挑戦的な線量に抽出した脾細胞を曝露することによっておよび誘導を測定することによって評価することができる（1時間の照射後）および残留DNA損傷（24時間照射後）。残存DNA損傷は不完全修復と長期ゲノム不安定性と癌のリスクの指標となるであろう。容易にインビボ研究（ 例えば 、染色体異常、骨髄網状赤血球における小核頻度、遺伝子発現など） に 、このような測定することができる他のアッセイとエンドポイントと組み合わせることで、このアプローチは、生物学的効果の正確なコンテキストを評価することができの低レベルのストレス要因。

概要

広島·長崎原爆のと（マスメディアによって悪化）まれな原子力発電所事故の画像によって駆動、低または放射線と放射線の国民の恐怖をイオン化、非常に低用量のいずれかの潜在的な有害な影響を超える有意な論争は、非常につながっています厳格な放射線防護規制および潜在的に科学的に正当化されない規格。過去30年では、多くの報告は、有害性の欠如と低線量放射線1-4により誘発される潜在的に有益な生物学的効果の存在の両方を文書化しています。主要な放射線健康リスク因子は、放射線の高または中用量を受けた原爆被爆者の疫学的研究に基づいて推定、癌の確率です。 （そのように線形無閾値またはLNTモデルと呼ばない）、これらのデータの線形外挿は、低用量で癌のリスクを推定するために使用されます。しかし、このアプローチは、世界中の科学的受け入れを受信して​​いません重く5を議論されています。

これは、より多くの研究がこの問題を明確にし、おそらく放射線防護基準を改善するために必要とされることは明らかです。このような研究は、DNA損傷率、DNA修復と突然変異誘発など、そのようなエンドポイント（ヒトへの影響を推定するための最良の） インビボ動物モデルにおける慢性治療（環境および職業暴露の最良の近似）を関与させるべきです。これは、DNAが変異誘発および癌開発6につながる可能性が放射線の影響と不完全または誤修復を損傷するための主要な標的であることが知られています。

DNA二重鎖切断（DSB）は、DNA損傷の最も有害なタイプの一つであり、細胞死および腫瘍形成7につながる可能性があります。これは、確実かつ正確に、低線量放射線及び/又は化学的汚染物質のような他のストレスへの曝露後のDSBのレベルを測定できるようにすることが重要です。最も高感度で特異的なマーカーの一つDNA DSBのγH2AX8と呼ばれる、リン酸化ヒストンH2AXで、まだ他のマーカーおよび方法は、9,10を提案されています。これは、誘導されたDSBの近傍におけるH2AX分子の数千が、抗γH2AX抗体および蛍光顕微鏡11で免疫標識することによって、個々のDSBの検出を可能にするγH2AXの形成に関与していると推定されます。反応は30分〜60をその最大値に達し、非常に迅速です。証拠は、γH2AXは切断の部位への他の修復因子を誘引することによって、壊れたDNA末端を固定し、（12に概説）他の修復タンパク質のためのアクセスを提供するために、クロマチン構造を修飾することによってDNA DSBの修復を促進することが存在します。 DNA DSBの修復が完了すると、γH2AXは、リン酸化脱および/ ​​または分解を受け、新たに合成されたH2AX分子はクロマチン10の影響を受けた地域でγH2AXを交換します。 γH2AXの形成と損失をすることができます監視、したがって、DNA DSB修復速度の正確な推定値を提供します。このアプローチは、放射線感受性13-15と相関することが示されている放射線と速度と残留DSBレベルの高用量を照射し、様々なヒト腫瘍細胞株におけるDSBの修復を研究するために使用されてきました。

我々は、この実験的なアプローチを変更し、DNA DSBレベルの慢性γ-及びβ線照射の低用量の効果を調べると（図1）を修復するために、in vivoでのマウスの研究に適用しました。まず、我々は、飲料水に溶解トリチウム水（HTO）、または有機的に結合したトリチウム（OBT）の形でトリチウム（水素-3）で放出されたいずれかの放射線をβにマウスの長期慢性暴露を実行するための方法を実証します。二つの形式は、蓄積および/または体内の異なる配布、したがって、異なる生物学的効果をもたらすことが期待されます。両方の形態は、原子力産業における潜在的な危険です。この処理それらの相対的な生物学的な有効性の評価のために重要である2つの放射タイプの正しい比較を可能にするための等価線量率でγ線への慢性暴露によって並列されています。ベータ放射線は、γ線照射、高エネルギー光子から、それは非常に異なる作り、電子から構成されています。これにより差に、Β-放射線は、主に内部の健康被害を表し、γ線と比較して異なる生物学的効果を生じることがあります。この合併症は、HTOによって放出されるβ-放射線への暴露の規制に重要な論争をもたらしました。このように、公共のために飲料水中のHTOの規制レベルはヨーロッパで100ベクレル/ Lからオーストラリアの75,000ベクレル/ Lに変化します。これは、γ線の等価線量にHTOの生物学的効果を比較することが重要です。第二に、DNA DSBの速度が検出免疫蛍光標識したγH2AXを用いた慢性露出の完了時に分離された脾臓細胞で測定されますフローサイトメトリーによってエド。これは、in vivoでの暴露によって与えDNA損傷の程度を評価することができます。しかし、このような低レベルの曝露がDNA DSBの任意の検出率を生成しない可能性があることを期待するのは賢明です。代わりに、いくつかの隠れた変更/応答は、DNA損傷を修復する細胞の能力に影響を与えることが期待されてもよいです。これらの変化は、見つかった場合、（有害な効果を生じる）刺激（有益な効果を生成する）または阻害のいずれであってもよいです。提案されたプロトコルは、被害のかなりの量を生成する放射線の高用量で抽出した脾細胞をチャレンジすることにより、このような変化を明らかにすることができます（ 例えば 、2 Gyで約50細胞あたりのDNA DSBまたは3生産- 。総γH2AXレベルの5倍の増加を） 。その後、γH2AXの形成および消失は、DSB修復の開始及び終了を反映し、フローサイトメトリーによりモニターされます。このように、基礎およびDNA DSBの治療によって誘導されるレベルではないだけを測定することができるが、また、はるかに高いストレッサーレベルによって誘発されるDNA損傷に応答して修復する細胞の能力に対する潜在的影響。

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プロトコル

すべてのマウス操作や処理手順は、地元の動物管理委員会が議会および/または動物のケアプログラムで記載され、承認ルールに従う必要があります。このプロトコルに記載されている全ての方法は、ローカルの動物管理委員会の承認を得て、動物ケアに関するカナダ評議会のガイドラインに従って実施しました。

注意：放射能を持つすべての作業は（を含む、放射性動物組織、寝具廃棄物の取り扱い、トリチウムの取り扱い、外部γ線照射に限定されない）立法府および/または放射線防護当局が定める規則に準拠する必要がありますし、許可することにより行うことが認定実験室および/または施設内の職員。

1.動物作業

  1. 動物のグループ化
    1. マウスは、外部組織から到着している場合は、動物施設で少なくとも10日間のために動物を慣らします。研究では、複数の治療群が含まれている場合は、動物の供給者がアルを送信できることを確認してください単一のバッチとしてL動物。
    2. 無作為に群当たり10匹のマウスの処置群にマウスを割り当てます。 C57BL / 6系統の雄マウスを使用している場合は、攻撃性の問題を軽減するために、それらの施設に非常に若いC57BL / 6雄のランダム化を事前に手配した動物のサプライヤーを持っています。
  2. 内部β-放射線にマウスの慢性暴露
    1. HTOとOBT（トリチウム化プロリン、アラニンおよびグリシンのアミノ酸の混合物）ソリューションの元の株式を希釈することにより、マウスの飲料水にトリチウム（10 kBq / Lと1 MBqで/ L）の作業濃度を準備します。
    2. 液体シンチレーションカウンターを用いて放射能を測定することによって、飲料水中のトリチウムの最終濃度を検証します。必要に応じて、濃度を調整します。
    3. トリチウム水へのアクセスを自由に提供することで、一ヶ月のために動物を扱います。処理水は、2週間の期間中に少なくなった場合は、より多くの水を追加します。それ以外の場合は、2週間後にボトルを変更します。
    4. 偽照射コントロールを扱いますマウス全く同じ。独立した「クリーン」ルームまたは空気からトリチウムクロスコンタミネーションを避けるために正の空気圧の下に別個の「クリーン」なラックに保管してください。
  3. 外部γ線にマウスの慢性暴露
    注：γ線照射施設/設備の場所によって異なります。
  4. 線量測定の利用可能な方法を使用して、所望の線量率を生成する放射フィールドを持つγ線源からの距離を決定します。動物ケージをカバーする領域内の放射線場の均一性を確認してください。
    注：1.7μGy/ hが1 MBqで/体におけるLトリチウムによって生成される線量率に相当します。
  5. 1ヶ月のステップ1.3.1で決定した距離で、マウスのケージを配置することによって、マウスを公開します。 30分にγ線照射の毎日の中断を最小限に抑えます。総吸収線量を測定するための熱ルミネッセンス線量計を使用してください。

2.犠牲とサンプリング

  1. 挿入された70ミクロンの細胞ストレーナー、15ミリリットル、1.5 mlチューブに無菌手術器具、60ミリメートルペトリ皿を準備し、すべての生物学的安全キャビネット内で、5％ウシ胎児血清（FBS）と場所を添加したRPMI培地。仕事の無菌性を確保することが重要です。
  2. 各60ミリメートルペトリ皿にRPMI培地の5ミリリットルを分注します。
  3. 地元の動物管理委員会により承認された方法を用いてマウスを生け贄に捧げます。頸椎脱臼は、このプロトコルで説明脾作業のために良い選択です。 （mFISH、サイトカラシンブロック小核または他の一般的なgenetoxicityアッセイのために、例えば、）他のアッセイのための血液サンプルが必要な場合は、イソフルランで麻酔した後、心臓内穿刺を使用しています。
  4. 頭があなたから離れて指しで、背側横臥位で動物を置きます。 70％エタノールでマウスを下にスプレーしてください。鉗子を使用して、尿道口に前方の皮膚をつかむと、会陰部でハサミで小さな切開を行います。
    1. この切開部から、唯一の下の筋肉壁を皮膚をカットしないように注意しながら、胸腔への腹側正中線に沿って切断。離れて正中線から皮膚を解剖。
    2. ピンセットで腹壁をつかみ、腹腔を開く筋肉壁の中央軸に沿って切断。
  5. 軽く滅菌ピンセットでそれを掴み、ゆっくりと同時ハサミで結合組織を切除しながら、それを引っ張ることによって、脾臓を切除。
  6. 1.5mlチューブ中の脾臓（脾臓の約1/10）と場所の小片をカット。スナップは、補助アッセイのために-80℃でその後の保存のために液体窒素中で凍結します。
  7. 前分配RPMI培地5mlで60ミリメートルシャーレ内の細胞ストレーナーに脾臓の残りの部分を配置します。
  8. 次のマウスに進みます。
    注：マウスの​​残りの部分はsacrificいる間抽出脾臓（最大2時間）、メディア、60 mmディッシュに保つことができますエド。 5〜15匹のマウスの間で、参加する人の数に応じて、一日で処理することができます。

脾細胞培養物の調製

  1. 湾曲した端部に滅菌ピンセットを用いて細胞ストレーナーの内部に細かく刻むことによって脾臓を均質化。
  2. セルストレーナーを取り外し、15ミリリットルチューブに60ミリメートル皿から濾過した細胞懸濁液を収集します。
  3. 残りの細胞を収集するために、メディアの5mlでセルストレーナーを洗浄します。
  4. RTで5分間、300×gで遠心分離管。
  5. 上清をデカントし、RPMI 10ml中のペレットを再懸濁します。
  6. RTで5分間、300×gで遠心分離管。
  7. 上清をデカントし、RPMI 5ml中のペレットを再懸濁します。
  8. 転送4 25ミリリットルの組織培養フラスコに細胞懸濁液1ml及びCO 2インキュベーター（37℃、5％CO 2、湿度80％）に移します

4.挑戦照射と定着

  1. 転送4℃で5分間、300×gで氷と遠心分離機に1.5mlチューブにステップ3.8から1mlの細胞懸濁液を、残りの。このサンプルで測定DNA損傷は、DNA修復曲線の構築のために両方の治療誘発性損傷及びt = 0のデータポイントを表します。
  2. 慎重に真空ポンプを用いて上清を吸引除去します。ゆっくりTBS緩衝液（20mMトリスpH7.4中、150mMのNaCl、2.7ミリモルのKCl）1ml中にペレットを再懸濁します。
  3. 4℃で5分間、300×gで遠心分離管。慎重に真空ポンプを用いて上清を吸引除去します。 TBS300μlの中に静かに再懸濁ペレット。
  4. 低速でボルテックスで混合しながら、-20℃の100％エタノール700μlを添加します。ふたを閉めて混合するために数回転倒。
  5. -20℃でサンプルを保管してください。エタノールで固定した脾細胞は、γH2AXシグナルにおける顕著損失なしに少なくとも12ヶ月間、-20℃で保存することができます。
  6. 挑戦的なγ-RADでステップ3.8からの脾臓細胞培養を照射利用可能な照射装置を用いて線量率≥200 MGY /分で2 Gyでのiation用量。
    注：この照射の目的は、修復機構に挑戦するDNA DSBを誘導することです。 X線は、この目的に使用することもできます。
  7. すぐにCO 2インキュベーターに文化を返します。
  8. 挑戦2 Gyの照射後1時間、生物学的安全キャビネットにインキュベーターから培養液を除去します。代表的なサンプルのアリコートを収集するには、静かに氷上で1.5mlチューブに分注し、細胞懸濁液の転送1ミリリットルを用いて細胞を再懸濁します。 CO 2インキュベーターに細胞培養物を返します。
  9. 4℃で5分間、300×gで遠心分離管。慎重に真空ポンプを用いて上清を吸引除去します。ゆっくりTBS 1mlのペレットを再懸濁します。
  10. 4.5 - 繰り返して、4.3を繰り返します。
  11. 24時間挑戦2 Gyでのγ線照射、収穫後、ステップ4.8で説明したように24時間サンプル=に固定 - 4.10。
TLE "> 5。抗γH2AX抗体による免疫蛍光ラベリング

注意：一般的に、15 - 1日30サンプルは免疫蛍光標識し、単一の実行で、フローサイトメトリーによりアッセイすることができます。治療群間の正確な比較を確保するために、各群からのサンプル（複数可）を含みます。詳細については、16を参照も参照してください。

  1. 処理されるサンプルの数のための管の標識されたセットを用意し、氷上に置きます。 12×75ミリメートルキャップされていないガラス管を使用してください。無菌性は、この作業は必要ありません。 （「第2抗体のみ」）のみの二次抗体で標識するために一つの追加の歴史的対照サンプルを含めます。研究内で実行すべてのフローサイトメトリーでは、この歴史的なコントロールサンプルを使用してください。
  2. 各チューブに氷冷TBSの0.5ミリリットルを追加します。
  3. 5秒間-20℃、渦から固定脾細胞を除去し、TBSで準備されたチューブに0.5ミリリットルのアリコートを転送します。 -20℃の保存に戻すサンプルの残りを置き、バックアップサンプルとして保持します。
  4. 4℃で5分間、300×gで遠心分離脾細胞。上清を除去し、穏やかに、1％FBSを含む氷冷TBS 1ml中にペレットを再懸濁
  5. 4℃で5分間、300×gで遠心分離細胞。上清を除去し、穏やかTST緩衝液1ml中に再懸濁ペレット（0.05％トリトンX-100、TBS中2％FBS）。氷上で20分間インキュベートします。
  6. 4℃で5分間、300×gで遠心分離細胞。上清を除去し、穏やかに1希釈した一次抗γH2AX抗体200μlにペレットを再懸濁：TST緩衝液中で150。 「第2のAbのみ」対照試料のためのTSTの200μLを使用してください。
  7. 45°の角度で回転シェーカー上の位置チューブ - 60°、室温で300×gで1.5時間振盪します。
  8. TSTバッファー中で200倍希釈チューブをインキュベートしている間、1にアレクサ488結合ヤギ抗マウス二次抗体の十分な容量（200μL/サンプル）を準備します。
    注：アレクサ488を含むすべての仕事コンジュゲート抗体は、（以下5.16に5.10ステップ）薄暗い光の条件下で行われるべきであるとラベルされたサンプルは、アルミホイルで管を包むことにより、光から保護されるべきです。
  9. 1.5時間のインキュベーションが完了した後、4℃で5分間、300×gで遠心分離し、各チューブに2％FBSを含有する氷冷TBSを1ml加えます。 2％のFBSを含むTBS 1ml中にペレットを再懸濁優しく上清を除去し。
  10. 4℃で5分間、300×gで遠心分離します。上清を除去し、穏やかにステップ5.8からの二次抗体溶液の200μl中に再サスペンドペレット。
  11. ステップ5.7のように1時間振とうプラットフォーム上でサンプルをインキュベートします。
  12. 1％FBSを含む氷冷TBSの1ミリリットルを追加します。
  13. 4℃で5分間、300×gで遠心分離します。上清を除去し、静かに氷冷TBS 1ml中にペレットを再懸濁します。
  14. 4℃で5分間、300×gで遠心分離します。上清を除去し、穏やかに、50μg/ mlのを含むTBS 0.5 ml中にペレットを再懸濁ヨウ化プロピジウム。
  15. 光から保護し、室温で5分間インキュベートします。
  16. 楽器固有のプロトコル16を使用して、フローサイトメーターでサンプルを分析します。サンプルあたり少なくとも10,000個の細胞を読みます。

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結果

図2は、脾臓細胞に期待されるフローサイトメトリーのグラフの例がここに記載された方法を用いて調製を示しています。細胞を、最初に<電子ボリューム·側方散乱>散布図に基づいてゲートされる（ 図2Aおよび2D、電子ボリュームは、前方散乱に相当します）。 FL3 /プロピジウムヨウ素ヒストグラム（ 図2Bおよび2E）は、通常の細胞周期分布を確認します。 FL1チャネルを使用して計算γH2AX信号を意味することは、未処理の対照（ 図2C）と比較して、細胞（ 図2F）を照射し、2 Gyの中のDNA DSBで> 2倍の増加を確認します。次に、我々は、免疫蛍光マウスの脾臓細胞におけるフローサイトメトリーによってγH2AXを標識した測定の記載された方法の感度を調べた。 図3Aは、マウスの脾臓細胞でγH2AXレベル、DNA DSBの指標を示しているにex vivo...

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ディスカッション

本稿で提示プロトコルは、電離放射線を含む様々な化学的および物理的因子、低レベルの遺伝毒性を調べるin vivo試験で大規模なマウスを実施するのに有用です。私たちのGammaBeam 150照射を装備ユニークな特定病原体を含まない動物施設と30メートル長い照射ホールマウスの数百または数千もの低いまたは非常に低い線量率照射を伴う生涯研究を行うことができます。慢性的な低線量照射のための小さい照射施設は、放射線生物学の研究が日常的に行われており、放射線防護指針/規則が実装されている大学や病院の環境で設定することができます。しかし、規制強化は、通常、トリチウムなどの放射性核種の取扱いが行われ、内部動物照射のために設計の施設に適用されます。まれているが、そのような内部被ばく研究のために、認定試験所は、様々な再内に存在します検索機関ワールドワイド及びそれらの独自の機能は、このプロトコルに記載される研究のために使用することができます。

プロトコルの中で、私たちは正確に実験的な曝露によって生成されるDNA DSB率を評価するために、γH2AXの免疫蛍光標識を使用しています。さらに重...

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開示事項

著者らは、競合する既知の金銭的利益は存在しないと宣言する。

謝辞

著者は、私たちの同僚である放射線防護・原子力安全研究所(フランス、パリ)のサンドリーヌ・ロッシュ・ルフェーヴルとエリック・グレゴワールの貢献に感謝したいと思います。この研究は、カナダ原子力研究所(カナダ、オンタリオ州チョークリバー)のカナダ政府科学技術プログラム、CANDUオーナーズグループ(カナダ、オンタリオ州トロント)、カナダ原子力安全委員会、および放射線防護・原子力安全研究所(フランス、パリ)の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
HTO:トリチウム水、[3H]原子炉から局所的に取得 ストック活性 3.7 GBq/mL;  Perkin Elmer
OBT: アラニン, L-[3-3H]: 有機結合トリチウム (OBT)Perkin ElmerNET348005MC1 mCi/ml (185 MBq)
OBT: グリシン、[2-3H]: 有機結合トリチウムPerkin ElmerNET004005MC1 mCi/ml (185 MBq)
OBT: プロリン, L-[2,3-3H]: 有機結合トリチウム (OBT)Perkin ElmerNET323005MC1 mCi/ml (185 MBq)
トリチウム水、[3H] (HTO)Perkin ElmerNET001B005MCHTOの代替品 
GammaBeam 150照射器Atomic Energy of Canada Limitedは、現地で製造された別のg放射源で置き換えることができます。
Tween-20Sigma AldrichP1379-500ML
RPMIFisher ScientificSH3025501Hyclone RPMI 1640 with L-Glutamine and HEPES 500mL
ウシ胎児血清Sigma AldrichF1051-100ML
抗gH2AX抗体、クローン JBW301Millipore05-636
Alexa Fluor-488 ヤギ抗マウス抗体Life Technologies (旧Invitrogen)A21121
ヨウ素プロピジウムSigma AldrichP4864-10ML1 mg/ml
エタノール市販アルコールP006-EAAN500 ml ボトル 無水エタノール
1.5 ml チューブFisher Scientific2682550微量遠心チューブ
15 ml チューブFisher Scientific05-539-5滅菌ポリプロピレン遠心チューブ
液体窒素リンデP110403
12 x 75 mmキャップなしガラス管フィッシャーサイエンティフィックK60B1496126エンド
T25フラスコVWRCA15708-120nunc tisue文化25mlフラスコ(サプライヤー番号156340)
はさみファインサイエンスツール14068-12グナーはさみ12センチシャープ/シャープ
鉗子、ストレートファインサイエンスツール11008-13セムケン鉗子 13 cm、ストレート
鉗子、湾曲ファインサイエンスツール11003-12ナローパターン鉗子 12 cm、湾曲
60 mm シャーレVWRCA25382-100BD ファルコン組織培養ディッシュ 60 x 15 mm
セルストレーナー、70 mmフィッシャーサイエンティフィック08-771-2ファルコンセルストレーナー 50/ケース
PBSレシピ:1錠を200mlの脱イオン水に溶かし、必要に応じてpHを7.4に調整します。Sigma AldrichP4417-100TABリン酸緩衝生理食塩水錠剤
TBS レシピ: 10x ストック
30 g TRIS HClSigma AldrichT3253-1KGTrizma 塩酸塩
88 gNaCl Fisher ScientificS271-500塩化ナトリウム
2 g KClFisher ScientificP217-500塩化カリウム
1 Lの脱イオン水に溶解し、pHを7.4
プレーンワーを作るにはに調整します

参考文献

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