胚性メッケル軟骨でZebrabowクローン細胞分析によって軟骨細胞のインターカレーションと方向性増殖の可視化

サマリー

頭蓋顔面骨の細胞組織が長いと仮定されず、直接可視化はありませんでした。マルチスペクトル細胞標識および in vivoライブで イメージングは​​、ゼブラフィッシュ下顎における動的な細胞の挙動の可視化を可能にします。ここでは、詳細プロトコルはZebrabowトランスジェニック魚を操作し、直接細胞のインターカレーションとメッケル軟骨における軟骨細胞の形態学的変化を観察します。

要約

脊椎動物頭蓋顔面構造の開発は、細胞遊走、増殖、接着および分化の正確な調整が必要です。メッケル軟骨のパターニングは、まず咽頭弓誘導体は、頭蓋神経堤（CNC）細胞およびプログレッシブパーティショニング、増殖および分化した軟骨細胞の組織の移行を伴います。いくつかの研究は、下顎の形態形成時にCNCの移行を説明しているが、軟骨細胞はメッケル軟骨の成長と拡張に組織を達成する方法の詳細は不明なままです。 SOX10制限され、化学的にCreリコンビナーゼ媒介組換えを誘発され、それによって別個のクローン集団を反映して、前駆細胞およびその子孫のマルチスペクトルラベルを作成し、個別の蛍光タンパク質（RFP、YFPとCFP）の順列を生成します。共焦点タイムラプス撮影を使用して、軟骨細胞を観察することが可能であるbehaviまたはゼブラフィッシュメッケル軟骨の開発中。

マルチスペクトル細胞標識は、メッケル軟骨細胞の拡張を実証するために、科学者を可能にします。下顎をprefiguresメッケル軟骨の延長フェーズでは、軟骨細胞は、彼らが組織的単細胞層状の列にスタックとして延長をもたらすためにインターカレートします。細胞伸長を媒介するこの組織的インターカレーションプロセスの失敗は、私たちは下顎の奇形で観察形成不全下顎のための細胞機構的説明を提供します。

概要

頭蓋顔面の開発は、細胞増殖、遊走および分化^{1,2、3を駆動するための}複雑な分子、細胞および組織の相互作用を必要とします。この厳密に調節し、複雑なプロセスは、頭蓋顔面奇形は、最も一般的な先天性奇形^1-9中にあるように、遺伝的および環境的摂動の対象となります。外科的介入は、開発の基礎を理解し、頭蓋顔面異常を治療の中心残っているが、将来の治療法を革新することが不可欠です。したがって、収束と拡張および細胞統合における形態形成および機構を研究することは、頭蓋顔面の骨格¹の形成に新たな洞察を提供しています。

頭蓋神経堤は、下顎をprefiguresメッケル軟骨を形成するために、拡張ペアの下顎のプロセスを形成した後、最初の咽頭弓を移行し、移入します。形態形成Oメッケル軟骨F方向性増殖、細胞分極と分化^1,10を経由して軟骨細胞組織を必要とします。しかし、メッケル軟骨の成長と拡張に軟骨細胞組織の複雑さは不明なままです。動的な細胞の挙動を理解することは、このような形成不全下顎の表現型^11と下顎の大きさに影響する先天性奇形を、理解するために重要です。

ゼブラフィッシュの胚はメッケル軟骨の形態形成の詳細な研究のための多くの発達と遺伝的利点を提供します。彼らの遺伝的扱いやすさ、透明性、ex vivoでかつ急速な発展は、ライブイメージング^6による細胞運動と組織の観察のためによく、それを貸し強力な利点です。そのようなSOX10などの系譜トレースツール、 使用 ：楓トランスジェニック系統を、私たちと他の人は、胚の頭蓋顔面の骨格^1,5の神経堤起源を描写しています。 USIUBIでERT2-Creを：SOX10 ngを Zebrabow-Mトランスジェニック系統は、頭蓋顔面の開発中の細胞の動きを詳細に探索することが可能になりました。 Zebrabow-Mは、異なる蛍光体の発現を駆動するユビキチンプロモーター、lox部位⁸が隣接し、それぞれに操作されたトランスジェニックラインです。 Zebrabow-Mのデフォルトのフルオロフォアは、RFPを発現し、レッドです。 Cre発現の誘導後、Zebrabow-Mは、再結合を構築し、細胞が胚におけるマルチスペクトル式を作成する異なる蛍光体（RFP、CFPとYFP）の組み合わせを発現します。別の並置された前駆細胞に由来する細胞集団がクローンラベル付けされるように、再結合イベントの後に標識された細胞から分裂し、すべての娘細胞は、その後、クローン、標識されています。このクローン細胞標識によって、クローンの解像度を有する細胞の増殖及び遊走（図1 及び2）に従うことができます。

プロトコル

マサチューセッツ総合病院施設内動物管理使用委員会（IACUC）は、プロトコル番号＃2010N000106下にあるすべての手順を承認しました。これは、評価のための協会と認定研究所の動物ケア・インターナショナル（AAALAC）のガイドラインに準拠しています。

1.試薬及び材料の準備

1. 50X E3胚培地の1リットルを準備した （表2 を参照してください）（ 表1を参照 ）と1XのE3胚培地の1リットルを準備します。
2. 1X E3 1LにPTU 30mgを追加することにより、N-フェニルチオ尿素（PTU）とのE3胚培地を準備します。 PTUが完全に溶解していることを確実にするために、O / Nをかき混ぜます。室温で保管してください。
3. プロナーゼ溶液を調製するには、1X E3 15mlでプロナーゼ150μlの（0.5 mg / mlの）を希釈します。この量は、1ペトリ皿に十分です。すぐに使用してください。
4. メチルセルロース溶液を調製します。
   1. 25 mlの0.2％トリカイン75mlのを混合することによりE3-トリカイン溶液を調製します1X E3の。 E3-トリカイン液75mlの中にメチルセルロースの3グラムを煮。
   2. E3-トリカイン溶液で100ミリリットルの最終容量をアップしてください。最終メチルセルロース溶液は粘性と黄色がかった色合いで不透明です。ストレージ：RTは、光から保護。
5. タモキシフェンストックと誘導ソリューション
   1. 4-ヒドロキシ100％エタノールに溶解することにより5mMのにタモキシフェンのストック溶液を調製します。 -80℃での店舗在庫。
   2. 誘導溶液を得1X E3で欲求濃度でタモキシフェンの新鮮な希釈を準備します。注意！使用前にMSDSを参照してください。
6. 表3の通り0.2％トリカインの1リットルを準備します。
7. 共焦点スライドを入手します。ブロックを形成するために一緒に4カバーガラス（18×18）を接着した後、中盤の胚の取​​付けできるように2センチメートル離れて24×60カバーガラスの上に2ブロックを配置します。

2.胚の準備

1. トランスジェニック系統。
   注：Zebrabow-MはアレックスSchierの研究室からの寛大な贈り物でした。
2. SOX10：ERT2-Creを
   注：標準的な分子クローニング法を用いて、ERT2-Creをし、商業的にクローン技術を組換えを得た：ターゲティングベクターpDestTol2- SOX10を生成します 。
   1. レンズ先とのLR反応にエントリークローン（pENTR3'-ポリA）を組み合わせ、5 'SOX10プロモーターの 7.2Kb、ゲートウェイミドルクローン（PME-ERT2-CRE）、および3を含むエントリークローン（pENTR5'- sox10p）」ベクトルpDestTol2-αクリスタリン ：YFP。
   2. 構造物を精製pDestTol2- SOX10：ERT2-Creを。 1細胞期のWT胚（F0）にTol2のトランスポザーゼのmRNA（50 ngの/μL）で精製した構築物（100 ngの/μl）を共同注入。
   3. F1胚において、強い黄色の蛍光に基づいて、生殖系列伝達のための画面F0大人の創設者。
3. SOX10：ERT2-のCre; Zebrabow-M
   1. Zebrabow-Mを異系交配ERT2-Creをトランスジェニックライン：SOX10と行（2.1.1）。
   2. 強いユビキタスRFPの発現とYFPレンズマーカを示す胚を選択して、大人になるまで、それらを育てます。

3.胚コレクション

1. SOX10のいくつかのペアに設定しますERT2-Creをし、1日目の午後5時までと午後6時間のZebrabow-Mトランスジェニックゼブラフィッシュ。
2. 次の日は、午前中に仕切りを引き出し、正午頃卵を集めます。
3. ペトリ皿や胚をdechorionateするプロナーゼ溶液15mlを追加し、それらを転送します。
4. 胚の約60％がdechorionatedされるまで、1〜5分間胚を培養します。プロナーゼ液をデカントすることによって反応を停止し、新鮮なE3培地で胚を3〜4回​​洗浄します。
5. RT O / NでE3でdechorionated胚をインキュベートし、それらを10体節段階に到達するために開発してみましょう。異なる発達成長を回避するために、クラッチごとに50〜60の胚をインキュベートします。

4.治療

1. 彼らは10体節段階であることを確認するために、光照射野顕微鏡下で胚「発達段階を確認してください。
2. 赤色蛍光タンパク質（RFP）フィルター付き蛍光顕微鏡を使用して、明るい赤の胚を分離します。
3. ペトリ皿にヒドロキシタモキシフェン溶液10μMを添加し、3時間28.5℃で分離された胚を培養することによってのCre組み換えの誘導に進みます。
4. タモキシフェンソリューションをデカントし、E3で胚を数回洗浄します。
   注意！特別な生物学的廃棄物容器内のタモキシフェンのソリューションを捨てます。
5. 28.5°のCO / Nで胚を培養します。
6. 胚が約28〜29体節期（24時間の周り受精後）である場合には、E3-PTUソリューション以下で28.5℃で胚を培養します。
   注：PTUは、ここで発生中の胚に黒色素胞の形成を阻害するために使用されます。この処理はする必要があります自動蛍光色素胞によって蛍光の信号の歪みを避けます。
7. 28.5℃で胚をインキュベート

5.胚の選択

1. 完全に開発された頭蓋顔面構造を可視化するために、レッド信号とのCre発現マーカー陽性（網膜の黄）の強度を4日後に受精で胚を選択します。
2. E3 / 0.015％のトリカイン溶液で胚を麻酔。麻酔を穏やかに胚をつついたときにアクティブな動きやフィン活動が観察されないときに確認されました。

6.メチルセルロースで胚をマウントします

1. メチルセルロースの低下を含むペトリ皿にイメージングのために選択された胚を移し、優しくメチルセルロースで胚を防腐処置を施します。
2. きれいな共焦点のスライドでは、新鮮なメチルセルロースの低下を置き、microloaderチップを使用して、ドロップ以内に胚をマウントします。触れないように注意を取って位置胚背側直接胚。
3. 25×25カバーガラスを搭載した胚をカバーし、必要に応じてカバースリップを操作することにより、胚の位置を調整します。
4. 胚は今画像に準備ができています。

蛍光顕微鏡による7.分析

1. 胚を集束させるため、20倍のドライレンズ対物レンズ（ピンホールサイズ2.0μmの開口数0.75）を使用します。
2. 顕微鏡のL100ボタンを押して、ソフトウェアでチャンネルを選択します。
3. 共焦点セットアップボタンを選択し、「自動」をクリックしてウィンドウを閉じる前に、次のチャンネルを選択：Ch1の：CFP、CH2：GFP、CH3：RFPまたはmCherryを
4. 「インターロックを削除」ボタンをクリックする前に、CH2およびCH3をオンにします。スキャンを開始するには「プレイ」をクリックしてください。
5. 所望の画質がACになるまで最高の½フレーム/秒、高電圧（HV）150から開始し、それに応じて設定を調整することによって行われ、関心の構造に焦点を当てますhieved。 RFPは、したがって、HVを調整し、他の色よりも明るくなります。 YFPおよびRFP陽性細胞の両方を見つけるZ位置を変更します。
6. 設定で設定したら、あなたの胚の画像をキャプチャします。各分割チャネルにおける画像処理のための共焦点イメージングソフトウェアの形式やTIFF形式で画像を保存します。
7. 次に、CFPイメージングのため、CH2およびCH3をオフにして、Ch1をオンにしてください。フォーカスエリアを変更することなく、ステップ5のように設定を再調整します。
   注：CFPは、ピンホールのサイズを調整することで回避することができる青チャネルでバックグラウンド信号による検出するのは本当に難しいことができます。大きなピンホールの大きさは、シグナル/バックグラウンドノイズ比を低減することにより、蛍光のより良い検出を可能にします。しかし、大きなピンホールは、画質を犠牲にすること、共焦点効果を減少させます。そのため、設定の慎重な調整が所望の画質と強度を達成するために必要とされます。
8. 画像をキャプチャし、フォーマット（共焦点ソフトウェアとTの両方に保存します画像処理用のIFF）。画像はその後、層を結合し、パンと⁸らによって記載されているように、カラーの設定を改善するために、一般的な画像処理ソフトウェアを用いて処理することができます。

結果

ホールマウントアルシアンブルー汚れによる伝統的軟骨の可視化は、開発メッケル軟骨を観察し、一般的に、最終的な細胞の組織^12（ 図1A）を視覚化するために使用非常に貴重となっています。さらに系統は、SOX10を使用してトレース、残業開発軟骨細胞を分析するには：楓トランスジェニック系統は、ライブ胚^2,12（ 図1B）で細胞遊走、収束と拡張子を勉強することができました。しかし、頭蓋顔面骨格構造における軟骨細胞の組織が十分に理解されたままになります。ライブイメージングにより、Zebrabow-Mトランスジェニック系統は、メッケル軟骨（ 図1C-G）の拡張と成長を仲介する軟骨細胞のインターカレーションおよび伸長の過程を明らかにすることができます。

このプロトコルでは、UBI：Zebrabow-M; SOX10：ERT2-Creを胚を10体節及び軟骨にタモキシフェンで処理しました下顎で球は、開発中の...

ディスカッション

アルシアンブルーとphotoconvertibleトランスジェニック系統前述したように、軟骨と骨の発達の複雑なプロセスを定義するためにお互いを補完します。しかし、器官形成時のライブ細胞移動および組織が長く仮定し、間接的に実証されたが可視化されませんされています。軟骨特定のCreと相まってZebrabow-Mトランスジェニックラインは、骨および軟骨形成に関与するすべてのこれらの個別のイベントの同時ライブ観察が可能。この技術は、小顎症を説明顕著な特徴の一つであるロビン・シーケンスなどの条件で、細胞および器官レベルでの下顎の成長欠陥の研究を可能にします。増殖、拡張またはインターカレーションの障害を効果的に時間をかけて成長している軟骨細胞で可視化することができます。

カラー多様性の最適化

extenを制御することができ4-ヒドロキシの濃度を滴定することによってのCreレベルの最適化胚致死性を生じることなく再結合し、色の多様性のトン。エストロゲンは正常な網膜の開発のために重要であり、したがって、タモキシフェン（>25μM）の高用量...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Pronase	Roche Life Sciences	10165921001	500 μl 50 mg/mL のアリコート
メチルセルロー	Sigma-Aldrich	M0262
PTU (N-Phenylthiourea)	Sigma-Aldrich	P7619
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521
4-HydoxyTamoxifen	Sigma-Aldrich	T176
24 x 60 coverslips	Fisher Scientific	12-548-5P
18 x 18カバースリップ	フィッシャー・サイエンティフィック	12-540A
25 x 25 カバースリップ	フィッシャー・サイエンティフィック	12-540C
pENTR5'-TOPO TA クローニングキット	ライフテクノロジー	K591-20
pENTR/D-TOPO クローニングキット	Life Technologies	K2400-20
pENTR3'-pA	Tol2Kit	302
pDEST			Geoffrey Burns labsからのギフト
明視野顕微鏡
蛍光顕微鏡
共焦点顕微鏡
画像処理ソフトウェア