セルMechanosensingとDurotaxisを評価するための簡略化したシステムインビトロ

サマリー

多くの哺乳類細胞は、デュロタキシスを通じてより硬いマトリックスまたは基質に向かって優先的に移動します。このプロトコルの目標は、ガラスカバースリップとインターフェースし、定義された剛性のポリジメチルシロキサン(PDMS)基質を組み込むことにより、細胞デュロタキシス挙動を研究し、操作するために使用できるシンプルなin vitroシステムを提供することです。

要約

細胞外マトリックスの組成及び機械的特性は、組織型間で高度に可変です。この結合組織の間質の多様性に大きく影響を与える細胞の挙動細胞増殖、分化、接着シグナリングおよび方向性のある移動を含む正常および病理学的過程を調節するために。この点において、特定の細胞型の生来の能力がdurotaxisと呼ばれる堅い、以下に準拠マトリクス基板に向かって移動します。この現象は、胚発生、創傷修復及び癌細胞浸潤の間に重要な役割を果たしています。ここでは、ポリジメチルシロキサン（PDMS）基板を用いて、in vitroで 、durotaxisを研究するための簡単なアッセイを説明します。室durotaxis記載の製造は比較的柔らかいPDMSゲルと硬質カバーガラスとの間に剛性のインターフェースを作成します。提供された例では、CDC42 / Rac1のGTPアーゼ活性化proteの役割を実証するために、これらのdurotaxis室を使用していましたcdGAP、で、mechanosensingと人間のU2OS骨肉腫細胞におけるdurotaxis規制インチこのアッセイは、他の細胞型および/またはmechanosignalingとdurotaxisにおけるそれぞれの役割を探求するための利益の他のタンパク質のノックダウンに容易に適合可能です。

概要

細胞外マトリックス（ECM）は、コラーゲン、フィブロネクチンおよびラミニンを含む構造と架橋タンパク質の複雑な配列で構成されています。それは十分にECMは細胞組織のための重要な構造的支持を提供することが確立されているが、細胞が活発に細胞生存、分化および細胞遊走を含む多様な細胞プロセスを調節するために、それらのECM環境の物理的変化に応答することを示す証拠が増えてきています。硬い（〜25キロパスカル）の基板は骨形成分化^1を促進しながら、例えば、ECMの剛性の違いは、ソフト基板（〜1キロパスカル）神経性系統を促進して、異なる系統に向けて、間葉系幹細胞を駆動することができます。同様に、間質マトリックスの剛性の増加は、周囲の組織^2,3に乳腺上皮細胞の腫瘍形成および浸潤を促進することが示されています。

このmechanosignの特に興味深い点細胞がよりリジッド基板^4,5の方に優先的に移行するdurotaxis、として知られているプロセスでの活動結果をaling。細胞は常に、ECMに結合するインテグリン受容体を介して、それらの細胞外環境の物理的特性を感知します。これは、順番に、接着斑または焦点コンタクト^6,7として公知の接着剤構造の形成を駆動するために、それらの細胞質ドメインに、多数の構造的およびシグナル伝達タンパク質の蓄積を促進します。 インテグリンは全く固有の酵....

プロトコル

Durotaxisチェンバースの調製

1. 1つの6ウェル組織培養プレートを調製するために、50 mlのコニカルチューブとのバランスを風袋引き。 50 mlチューブ中のPDMSベース溶液約10グラムを秤量（溶液は非常に粘性があります）。
2. 90：1の基板（〜1キロパスカルのコンプライアンス）、必要に応じて架橋剤溶液の正確な量を決定するために90によってチューブ内のPDMS塩基溶液の測定された重量を分割。同じチューブにPDMSの架橋剤溶液の計算された量を追加します。
   例：10グラム/ 90 = 0.11グラム。 PDMSベースのソリューションへのPDMS架橋剤溶液の0.11グラムを追加します。
   注：ベースと架橋剤溶液は、両方のPDMSキットで提供されています。
3. 精力的に小さなへらを使用して室温で5分間、PDMSベース/架橋剤混合物を混ぜます。この段階で、混合物を多数の気泡を含むであろう。
4. BUBを除去するために、室温で50×gで5分間、卓上遠心機でPDMS基板を遠心BLES。残っている場合は、再び5分、遠心分離後に泡。
5. 90 mlのピ​​ペット1：組織培養の各ウェルに1 PDMS基板を6ウェルプレートを処理しました。 PDMS中に存在する任意の残存する気泡が21 G針を使用してそれらをポップすることにより、この段階で除去することができます。 PDMSは、ウェル中の30分間の広がりを許可します。
6. ボイル....

結果

durotaxisチャンバの概略図は 、図1Aに示されています。ソフトPDMS基板を、（90：ソリューションを架橋するために、PDMSベースの1混合物）を6ウェル皿に広げ、カバーガラスがそれによってインターフェースを作成し、部分的にカバーガラスの上面を覆うPDMSの上に配置されます異なるコンプライアンスの2枚の基板の間。ソフトPDMS基板の剛性は、ガラスの剛性は約¹ GPaで1~2であるが、脳組織の典型的な適合性に匹敵する約1キロパスカルです。 PDMSとガラスとの界面の位相コントラスト画像は、図1Bの白い矢印で示されています。アスタリスクは難しく基板に向かって移行する二つの制御のRNAi細胞を意味します。見ることができるギザギザのエッジ（黒矢印）はカバーガラスのエッジに対応。

データを定量化するために、Microsoft Excelのスプレッドシートは 、表1のように生成する必要があります<

ディスカッション

ここで我々は、細胞の移行にdurotaxisを研究するための単純なアッセイを説明します。このアッセイの主な強みは、PDMSを用いdurotaxisチャンバを調製する容易さです。基板の剛性を容易にアッセイにおける様々な剛性の研究を可能にするために、架橋剤にPDMSベース溶液の比率を変えることによって操作することができます。しかし、システムの潜在的な制限は、より洗練されたシステム⁴によって提供される剛性勾配を経験とは対照的に、細胞が唯一の基質剛性の単一の変化にさらされていることです。重要なのは、ポリアクリルアミド基質とは異なり、ECM成分は、化学的に架橋されたPDMSにする必要はありません。フィブロネクチン¹¹に特異的な抗体で染色することによって決定されるように実際に、フィブロネクチンコーティングは、PDMSおよびガラス表面の両方にほぼ等しいです。以前の研究では、細胞は、PDMSまたはポリアクリルアミド基質のいずれかで同じように動作することを使用のOを示しているので、F PDMS基板^10,12細胞でメカノを研究するとはるかに簡単にモデルを提供します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ポリジメチルシロキサン (PDMS)	ダウ コーニング	3097358-1004	シルガード 184 シリコーン エラストマー キット
#1 カバーガラス 12 mm	フィッシャー サイエンティフィック	12-545-82
6 ウェル プレート	セルトリート	229106
DMEM	セルグロ	15-017-CM
L-グルタミン	セルグロ	25-005-CI
ナトリウムピルビン酸	フィッシャーサイエンティフィック	BP356-100
ニシリン/ストレプトマイシン	セルグロ	30-002-CI
フィブロネクチン	BDバイオサイエンス	610077
PBS	インビトロジェン	21600-044
ルコンチューブセル	トリー	ト229456
ウシ胎児血清	アトランタバイオロジカルズ	S11150
ウシ血清アルブミンΣ		A7906
U2OS細胞	ATCC	HTB-96