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方法論記事

新たに単離したPKD上皮の機能的特性を監視するためにパッチクランプし、ライブ蛍光顕微鏡を実装

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DOI：

10.3791/53035

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2015年9月1日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Medical College of Wisconsin, 2Department of Integrative Biology & Pharmacology, University of Texas Health Science Center at Houston

この記事について

サマリー

尿細管上皮細胞で発現するイオンチャネルは、多発性嚢胞腎疾患の病理において重要な役割を果たす。ここでは、新たにげっ歯類の腎臓から単離された胆嚢上皮におけるパッチクランプ分析を行うために使用される実験プロトコルおよび細胞内カルシウムレベルの測定を説明します。

要約

多発性嚢胞腎嚢胞中の開始と拡大は尿細管細胞増殖の異常、管腔流体の蓄積および細胞外マトリックス形成を特徴とする複雑なプロセスです。イオンチャネルおよび細胞内カルシウムシグナル伝達の活性は、尿細管上皮の機能を決定する重要な生理学的パラメータです。我々は、新たに腎嚢胞から単離された上皮単層における細胞内Ca 2+レベルのパッチクランプ法と登録のイオンチャネル活性のリアルタイム観察に適した方法を開発しました。 PCKラット、常染色体劣性多発性嚢胞腎（ARPKD）の遺伝的モデルは、イオンチャネルおよびカルシウムフラックスの ex vivo分析のためにここで使用しました。ここで説明するには、PCKまたは通常のスプラーグドーリー（SD）ラットから嚢胞性単層と非拡張型細管を分離し、単一チャネル活性および細胞内Ca 2+動態を監視するために設計された、詳細なステップバイステップの手順です。この方法は、酵素処理を必要とし、新たに単離した上皮単層の本来の設定で分析を可能にしません。また、この技術は、細胞内カルシウムの変化に非常に敏感であり、正確な測定のために、高解像度の画像を生成します。最後に、単離された嚢胞上皮はさらに、抗体または染料を用いて、様々な生化学的アッセイのための一次培養および精製の調製物を染色するために使用することができます。

概要

イオンチャネルは、細胞の増殖および分化を含む多くの生理学的機能に重要な役割を果たしています。常染色体優性と劣性嚢胞腎疾患（ADPKDおよびARPKD、それぞれ）尿細管上皮細胞由来の腎臓の液体で満たされた嚢胞の開発によって特徴付けられる遺伝性疾患です。 ADPKDはpolycystins 1及び細胞増殖および分化の調節に関与する2は、膜タンパク質をコードするPKD1またはPKD2遺伝子の突然変異によって引き起こされます。それ自体で、またはPKD1との複合体としてPKD2もの Ca 2+ -permeable陽イオンチャネル1として機能します。 PKHD1をコードする遺伝子fibrocystin（細管形成および/ ​​または上皮の極性の維持に関与する繊毛関連受容体様タンパク質）の変異は、ARPKD 2の遺伝子原動力です。嚢胞の成長が乱れた増殖3,4、血管新生5、脱分化および極性の喪失を伴う複雑な現象であります尿細管細胞6-8の性。

嚢胞上皮の欠陥再吸収と増強分泌は、内腔と嚢胞拡大9,10内の流体の蓄積に貢献しています。障害フロー依存の[Ca 2+] iのシグナリングがまた、PKD 11-15の間に嚢胞形成にリンクされています。

ここでは、単一チャネル活性とPCKラットから分離された嚢胞性上皮単層における細胞内Ca 2+レベルのパッチクランプ測定のための適切な方法を説明します。このメソッドは、正常上皮 Na +チャネル（ENaC）10の活性を特徴づけるために私達によって適用し、[Ca 2+] iのの Ca 2+ -permeable TRPV4とプリンシグナリングカスケード13によって誘導されたプロセスを依存しました。

これらの研究では、PCKラット、PKHD1遺伝子における自然突然変異によって引き起こさARPKDのモデルを使用しました。 PCK株はoriginallましたスプラーグ-ドーリー（SD）ラットに由来するY 16それによってSDラットをPCK株と比較するための適切なコントロールとして使用されています。その結果、同じPCKラットから単離されたSDラットのネフロンセグメントと非拡張集合管の両方が、嚢胞上皮での実験のための2つの異なる比較群として機能することができます。

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プロトコル

以下に記載の実験手順は、ウィスコンシン医科大学で機関動物実験委員会によって承認され、ヒューストンでのテキサス大学健康科学センター、実験動物の管理と使用に関する健康ガイドの国立研究所に従ってありました。 図1は、組織の単離および処理手順の主要ステップを示しています。簡単に言うと、PCKまたはSDラットからの腎臓は健康な非ダイヤルした細管または嚢胞のいずれかから集合管の上皮単層の手動単離のために使用されています。ここでは、4-16週齢PCKラット10,13から腎臓を検討しました。

腎嚢胞との接続細管の1の単離（CNT）/ダクト（CD）セグメントの収集

  1. イソフルラン（5％誘導、1.5〜2.5％のメンテナンス）/医療グレードのO 2または他の承認された方法で実験動物を麻酔。動物は、継続的に適切なルを確保するために監視されなければなりません麻酔のVEL。安定した呼吸数及びつま先ピンチ反応は、適切な麻酔を確認するために使用されます。
  2. 開腹術を行い、腹部大動脈17を介してリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で腎臓をフラッシュします。
    1. ポリエチレン管カテーテル（PE50）を準備し、PBSで充填されたシリンジポンプに接続します。側、腸間膜や腹腔動脈分岐で下行大動脈へのアクセスを取得するために綿棒で腹部臓器をシフトする側から腹部全体の横腹部切開を行い、その後、白線に沿って皮膚や腹壁をカットします。彼らの乾燥を防ぐために、さらに手順の間に温かい生理食塩水で内臓を湿ら。
    2. 腸間膜や腹腔動脈とダイアフラム下大動脈の周りに他の合字（＃2）（ネクタイしない）の周りに1合字（＃1）を配置します。静かに分離します。細い鉗子でその周りの結合組織を解剖し、2合字を配置することによって鈍ら腹 〜3左腎動脈（＃3）と腸骨動脈の分岐部（＃4）上記下記ミリメートル。
    3. リガチャー＃4を接続し、左腎動脈結紮＃3との間の大動脈の周りの血管クランプを取り付けます。大動脈のカテーテルを挿入するクランプとリガチャー＃4との間の切開を行い、しっかりとカテーテルを固定するための合字＃3を使用しています。
    4. クランプを解除し、血液パルスが適切な設置を確実にするためにカテーテルに表示されていることを確認してください。 6ミリリットル/分の速度で灌流を開始し、タイは＃1と＃2を合字、左腎静脈を切りました。臓器が完全にブランチングされるまで1〜2分間フラッシュし続けます。
    5. 腎臓の血管を切り取り、尿道及び腎臓を収集するためにハサミで結合し、脂肪組織を囲みます。その後、腎臓カプセルに短い涙を作り、それらをカプセル化解除するために腎臓の皮をむきます。氷冷PBSに腎臓を置きます。安楽死は、開胸術によって確認されました。
  3. ポリ-L-リジンで被覆した5×5 mmのカバーガラスチップを準備します。カバーGLAをカットダイヤモンド鉛筆と場所、各ガラスチップ上に0.01％滅菌濾過したポリ-L-リジン溶液約20μlのssです。解剖のために生理食塩水や時計職人鉗子の二組を準備します。
  4. 〜1〜2ミリメートルの厚さのスライスに前頭面に沿ってカミソリの刃で腎臓をカットします。実体顕微鏡下でのスライスの1つを配置します。組織の単離を、氷冷生理食塩水で行う必要があります。
  5. ラウンド形状の空洞（ 図2A）のように実体顕微鏡下嚢胞を見つけ;その壁は、多くの場合、増殖し、血管の顕著なネットワークが含まれています。先の細いピンセットを使用して、単層の面積を得るためにできるだけ薄い嚢胞の内部上皮層を分析。ポリ-L-リジンで被覆されたガラスチップに接続します。スティッキーポリ-L-リジンの表面は、研究者がしっかりとガラスの内部嚢胞層を配置することができます。ピペット（ 図2B）へのアクセスを提供するために、頂端側を上にして嚢胞を公開します。
  6. PCKまたはSDラットの子供を使用してください非拡張型CNT / CCDsegments 18-21の単離のための乳頭を含むネイ中央スライス。
    注：乳頭状の組織は、皮質よりも耐久性があり、鉗子で乳頭管状バンドを保持し、スライス軸、半径に沿って引き裂くことによって薄いセクターに切断することができます。個々の細管が表示され、カバーガラスチップ上に配置されるように引き出すことができます。
  7. 、分岐によって近位尿細管と大きな目立つ可視セル（ 図2C）より高い透明性のCNT / CCDセグメントを特定します。マイクロピペットを駆動するのに適したマイクロマニピュレータを備えた顕微鏡下で添付細管とカバーガラスチップを置きます。ガラスにそれらのエッジをシャープにマイクロピペットを分割オープン細管を使用し、添付すること（ 図2D）先端面にアクセスできるようにします。

2.シングルチャネルパッチクランプ電気生理学

  1. 浴溶液でパッチクランプ室を充填し、カバーガラスチップを転送します室に分離された組織と。パッチクランプマイクロピペットが信頼のセル（セル付）測定のための7-10MΩの抵抗を持っていることを確認してください。
  2. セル付測定では、20倍に増幅利得比を設定し、8極ベッセルフィルタにより300 Hzの電流を低域通過。 ENaCチャネルの監視については、mMの中で、浴溶液を使用する：150のNaCl、1のCaCl 2、2のMgCl 2、10 HEPES（pH7.4）で、ピペット：140のLiCl、2のMgCl 2および10 HEPES（pHは7.4）。
  3. セル接続モード10で、従来のパッチクランプ実験を行います。上皮単層のセルを選択し、頂端膜にピペットに近づきます。穏やかな吸引を適用することにより、ピペットと細胞膜との間に高抵抗シールを形成します。高抵抗ギガオームのシールが形成されると、保持電位でのギャップのないプロトコルは、関心のあるチャネルの監視活動のために起動する必要があります。
  4. ギガから店舗ギャップのない単一チャネル電流のデータΩは、その後の分析のために密封します。一般的にパッチクランプのセットアップ18に付属のソフトウェアパッケージを使用してチャネルのイベントを分析します。 Nはパッチ内のアクティブなチャネルの数を参照し、P oはチャネルの平均開口確率であるNPO法人としてのチャンネル活性を計算します。
    注：30分以上のパッチクランプ実験で分離された嚢胞または細管を使用してください。

上皮細胞の細胞内カルシウム濃度の3レシオメトリック落射蛍光測定

  1. DMSOに溶解した5 mMのフラ - 2AMを使用してください。個々の500μlのコニカルチューブに小分け原液（約10μL）。最大6ヶ月間-20℃の冷凍庫で軽く、ストアから保護します。
  2. 5μMのFura-2 AM色素および0.0を含む：（145のNaCl、4.5のKCl、pHは7.35で2のMgCl 2、2のCaCl 2および10 HEPES mMの中で）、PSSで30〜40分間分離された嚢胞とスプリットオープン細管をインキュベート5％プルロニック酸アセトキシメチルエステルを分散するのに役立ちます。そのため、ローディングカクテルを含む3.5センチメートル皿に入れ組織は、光から保護し、室温でゆっくりと振とう機上でインキュベートします。
  3. インキュベーション後にPSSをきれいにし、さらに落射蛍光イメージングを実行するために顕微鏡下で組織を配置するために、メディアを含む変更のFura-2 AM。
  4. フィルターホイールを装備したCCDカメラと安定した光源（モノクロメータシステム）をオンにします（各フィルタの位置はフィルタが呼び出されるたびに、選択し、独自の減衰レベルに関連付けることができます）。
  5. 明視野で組織を検索します。蛍光シグナルの検出に切り替えて、信号の飽和を回避するために、中性濃度フィルタ及びランプ電力を使用して光源の強度を調整します。
  6. 0.125ヘルツ以上の周波数で340/380 nmで励起レシオメトリックと組織試料中のFura-2 AMの蛍光を監視します。適切resolu 40×/ NA 1.3または類似の対物レンズを使用してくださいションイメージ。
  7. 画像処理や計算のためのイメージシーケンスをインポートします。チャンネルを分割し、hyperstackのグレースケールモードを使用するようにしてください。興味のあるいくつかの領域を選択します（シングルシスト細胞または嚢胞性組織の選択された領域）であり、好ましいデータ解析ソフトウェアに、各チャネル（340および380 nm）のための強度値を計算します。各データポイントからバックグランド強度値を減算します。
  8. 各時点についてのFura-2 AM 340〜380チャンネルの強度の比を計算します。プロットスキャッタ/各地域のの Ca 2+トランジェントのラインポイント時間の変更と計算平均/ SE値。

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結果

嚢胞形成の潜在的な関与のENaCは、PKDの進行22-25とARPKDマウスモデルおよび組織培養26-28における異常なナトリウム再吸収シグナリング破壊上皮成長因子（EGF）を観察し、いくつかの研究によって実証されています。例えば、Veizis らアミロライド感受性のNa +吸収をARPKD 29の非オルソロガスBPKマウスモデルからCD細胞において減少することを示しました。我々は最近、嚢胞における減損ナトリウムと水の再吸収が嚢胞形成10を悪化させる上で重要な要因であることを実証しました。具体的には、電気生理学的および免疫組織化学的分析を採用し、嚢胞が鈍化ナトリウムの再吸収を発揮することがわかりました。薬理学的ア ​​プローチは、選択したENaC遮断が顕著に嚢胞の進行10を悪化させることを実証しました。

我々はさらに、Oベンザミルは、ENaC遮断薬の投与の効果を実証しました嚢胞壁内のチャネルのn個の活動。 4週齢PCKラットをビヒクル...

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ディスカッション

私たちは、ARPKDのマウス遺伝モデル由来嚢胞上皮単層に、ここで、従来のパッチクランプ法と落射蛍光カルシウムイメージングのアプリケーションを記述しました。プロトコルは、最も注意が嚢胞（プロトコルセクションのステップ1.5）の単離および電気生理学的研究に支払われるべき3つのステップで構成されています。これらのキーの手順では、広範囲の訓練と忍耐を必要とし、読者は一度挫折してはなりません。

まず、最も注意が嚢胞化単分子膜分離の過程に支払われるべきです。試料の厚さとガラスチップへの付着があっても、細胞の可視性のために重要であるとして、準備のこの部分は、さらなる作業を手動スキルと大きく影響する必要があります。孤立した嚢胞壁の厚さは、試料の異なる部分で変化し、それがWORに便利な大きな単層領域で大きな嚢胞に注力することをお勧めしますK。試料をきれいにし、単層にアクセスしやすくするために、周囲の組織は、実体顕微鏡下でピンセットで剥離する必要があります。それは技術が重要な被写界深度と解剖時にオブジェクトの様々なサイズに対応するために、広い範囲で倍率を変更する機能によって特徴づけられる高品質の実体顕...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

著者は、顕微鏡実験で優れた技術支援のためにグレン・スローカム（ウィスコンシン医科大学）とコリーンA.ラビン（ニコンインスツルメンツ社）を感謝したいと思います。この研究は、（OPO）はアメリカ心臓協会13GRNT16220002、（TSP）に国立衛生研究所（TSPに）R01 HL108880（AS）は、（OPO）にR01 DK095029とK99 HL116603を付与し、国立腎臓財団IG1724によってサポートされていましたし、 （DVI）に米国腎臓学会からベン・J・リップス研究フェローシップ。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ふら-2 AMライフテクノロジーF-14185
Fluo-8AAT Bioquest21091
ポリ-L-リジンSigma-AldrichP4707
プルロン酸Sigma-AldrichF-68 解決
シェーカーBoekelScientific260350
光源Sutter Instrument CoLambda XLwith integrated shutter/filter wheel driver
Neutral density filtersNikonND4, ND8
ObjectiveNikonSFluo 40/1.3 DIC WD 0.22  オイル
カメラAndor TechnologiesZyla sCMOS
ニコン  顕微鏡(倒立型)ニコンニコン エクリプス TE2000-S
カバーガラスサーモサイエンティフィック6661B52
ダイヤモンドペンシルフィッシャーサイエンティフィック22268912
画像取得ソフトウェアニコンNIS-Elements 
画像解析ソフトウェアImageJhttp://imagej.nih.gov/ ND ユーティリティプラグインは、ネイティブのニコンインスツルメンツ.nd2形式での画像をインポートすることができます
録音/灌流チャンバーワーナーインスツルメンツRC-26
パッチクランプアンプモレキュラーデバイスマルチクランプ700B
データ収集システム分子デバイスDigidata 1440A軸索 Digidata®システム
ローパスフィルターワーナーインスツルメンツLPF-88極 ベッセル
ホウケイ酸ガラスキャピラリーワールド精密機器1B150F-4
マイクロピペットプーラーサッターインスツルメンツ CoP-97フレーミング/ブラウンタイプ マイクロピペットプーラー
マイクロフォージ成重MF-830日本
電動マイクロマニピュレーターSutter Instrument CoMP-225
倒立顕微鏡NikonEclipse Ti
マイクロバイブレーションアイソレーションテーブルTMCファラデーケージ搭載
マルチチャンネルバルブ灌流システムAutoMake ScientificValve Bank II
記録・灌流チャンバーワーナーインスツルメンツRC-26
ソフトウェアMolecular DevicespClamp 10 . 2
温度制御手術台 げっ歯類用MCWコア
双眼実体顕微鏡ニコンSMZ745
シリンジポンプベースの灌流システムハーバード装置
ポリエチレンチューブシグマ・アルドリッチPE50
イソフルオラン麻酔<a href="http://www.vetequip.com/">http://www.vetequip.com/911103
その他の基礎試薬Sigma-Aldrich
ズ 、

参考文献

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