上の機能的研究のための3Dヒト肺組織モデル<em&gt;結核菌</em&gt;感染

サマリー

ヒト結核感染は複雑なプロセスであり、in vitroでモデル化することは困難です。ここでは、免疫細胞の移動や生理学的環境での早期肉芽腫形成など、感染中に発生するダイナミクスを再現する新しい3Dヒト肺組織モデルについて説明します。

要約

結核（TB）は依然として世界の人々の健康に大きな脅威を保持し、私たちは病気のメカニズムを理解し、新たな治療選択肢の発見を進める手助けするためのコスト効率に優れたが、信頼性の高いモデルの必要性がある。単層のインビトロ細胞培養または共培養は、三次元（3D）環境および組織応答を欠いています。ここで、我々は結核菌 （ 結核菌 ）の感染の間に起こる複雑な事象を研究するための有効なツールであることが期待されているヒト肺組織のインビトロモデルで革新的なについて説明します。 3次元組織モデルは、多孔質膜の上に、コラーゲンマトリックス中で培養された組織特異的上皮細胞および線維芽細胞からなります。空気暴露されると、上皮細胞層別化し、頂端側の粘液を分泌します。 M.に感染したヒト初代マクロファージを導入することにより組織モードに結核lは、我々は、免疫細胞が感染組織中に移動し、TBの肉芽腫の初期段階を形成することが示されています。これらの構造は根本的に異なるか、一般的に広く使用されている実験動物モデルにおいて観察されていない人間の結核、肉芽腫の明確な特徴を再現。この器官培養法は、宿主細胞病原体相互作用の空間的および時間的機能に関する重要な情報を提供する3次元可視化と堅牢な定量分析を可能にします。まとめると、肺組織モデルは、結核の研究のための生理学的に関連する組織の微小環境を提供します。従って、肺組織モデルは、基本的な機構的および応用研究の両方のための潜在的な意味を持ちます。重要なことには、モデルは、それによって、肺に影響を与える感染症の様々なモデル化するためのその使用が広がり、個々の細胞型の添加または操作を可能にします。

概要

ヒトでは、感染症、組織炎症、細胞の動員、組織リモデリングおよび組織の恒常性の調節に応答が異なる細胞型が関与する複雑な事象です。したがって、これらの方法は、最高の局所組織環境において研究されています。以前は、これは、主に実験動物モデルを使用して可能でした。彼らはしばしば、人間とは異なる方法で病原体に対応し、また、疾患¹の別のコースを表示しかし、広く使用されている実験動物は、多くの制限を保持します。 インビトロの肺組織モデル中のヒトはヒト肺で特異的免疫応答を研究するための可能性を保持しています。

ヒト結核感染（TB）は、主に肺に影響を与える病気である。 結核菌 （ 結核菌 ）、結核の原因物質は、細菌が肺dendriに飲み込まれている肺胞腔に輸送されるエアロゾル液滴を経由して肺に達します感染^2,3に対する自然免疫応答の一部として、チック細胞や肺胞マクロファージ。病原体の食作用はファゴソーム内のバグの区画化につながる、理想的には食細胞による中和および病原体を死滅させることになります。 Mに曝露された個体の50％まで結核は、先天性免疫応答⁴を介して感染をクリアすることができると考えられています。感染の他の結果は後の段階で適応免疫系によるクリアランス、潜伏感染またはアクティブな疾患⁵慢性最悪のケースです。

以前は人間の結核の研究のために何のインビトロ組織モデルは存在していません。ヒトマクロファージまたは他の末梢血細胞の単一細胞培養物は、多くの場合^、6,7を使用されています。このアプローチの欠点は、Mに露出し、肺組織内で一緒に動作して、異なる細胞型の動態を反映することができないことです結核 。したがって、TB上の機能とメカニズムの研究を行うことができるようにするインビトロモデルが必要とされています。セル・ベースのここで説明する体外ヒト肺組織モデルでは、もともとの樹状細胞の機能⁸の研究のために私たちのグループによって設立されました。私たちは、結核の研究のために、この方法を適応しています。

ここに提示されたヒト肺組織モデルは、組織特異的な上皮細胞および線維芽細胞⁸から成ります。これらの細胞は、トランスウェルインサート中の多孔質膜の上に、コラーゲンマトリックス中で培養され、フォーム構造は、正常なヒトの肺組織（ 図1）に似ています。空気にさらされると細胞は頂端側⁸に粘液を分泌し始めます。 M.に感染したヒト初代マクロファージを注入することにより、モデルへの結核 、我々は、免疫細胞が組織に移行し、結核性肉芽腫⁹の初期段階を形成する方法を観察しています。これは最初のヒト組織モデルDESCRです結核ibed、それが結核と肺の他の疾患に対する自然免疫応答を研究するための有望なツールをもたらします。これまでに、我々は、モデルにおいて免疫細胞としてのみ単球およびマクロファージを使用しているが、複雑さのレベルは、追加の関連する細胞型を含めることによって増加させることができます。

肺組織モデルの概略1.概略図。 （A）モデルM.、ヒト肺特異的上皮細胞で構成されています結核は、初代マクロファージをに感染し、赤色の色素ラベルされた単球をトランスウェルフィルター上に作製したコラーゲン埋め込 ​​まれた線維芽細胞上に播種。空気への組織モデルの露出は、上皮によって細胞外マトリックスタンパク質の産生、粘液分泌と層化を開始します。こうして開発された3次元組織モデルは 、M を研究するための便利なツールですCLO環境における結核感染SELYヒトの肺。（B）組織モデルの製造における様々なステップの代表的な顕微鏡像。（C）肺モデル組織切片の完全な構造に似ています。スケール- 。100ミクロンこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

プロトコル

注：リンショーピン大学病院の血液銀行で購入健康匿名血液ドナーからのヒト末梢血、スウェーデンは、この研究のための免疫細胞の供給源として使用しました。このプロトコルは、24 mmの6ウェルプレートの挿入のために設計されています。組織モデルは、開発中に垂直方向と水平方向の両方に収縮するので、他のウェルフォーマットへの直接適応が推奨されていません。

細菌/細胞系の材料、メディアと文化の作製

1. 細菌の培養：
   1. マイコバクテリア菌株Mを成長0.05％を含むミドルブルック7H9培地中で構成的に緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現するpFPV2プラスミドを保有する結核菌H37Rv、トゥイーン80、0.5％グリセロール、カナマイシン（20μgの/ ml）を、そして（ミドルアルブミン、ブドウ糖及びカタラーゼ濃縮を補っミドルADC濃縮）、7〜10日間_、5％CO 2で37℃で。
      注：全ての実験手順ライブ病原性M.を含む S 結核菌株は、BSL-3施設で実施すべきです。
2. 1×ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）完全培地を調製し（1mMのピルビン酸ナトリウム、2mM L-グルタミン、100 U / mlのペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、10mMのHEPES、0.1mMの非必​​須アミノ酸及び10を補っ％のウシ胎児血清（FBS））を熱で不活性化。また、抗生物質を含まないDMEM完全培地を準備します。
3. 1×最小必須培地（MEM）、完全培地を調製し（1mMのピルビン酸ナトリウム、2mM L-グルタミン、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、10mMのHEPES、0.1mMの非必​​須アミノ酸及び10％熱不活性化ウシ胎児血清（FBS））。
4. フィブロネクチン/コラーゲンコートフラスコ（合計10ml）中の調製
   1. 清浄なチューブにピペットで8.8 mlの滅菌1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）。 1 mlのウシ血清アルブミン（1ミリグラム/ ml）を、100μlのI型コラーゲン（3 mg / mlの）ウシおよび100μlの組換えHUを追加人間のフィブロネクチン（1mg / mlの）。
   2. 逆さま5回チューブを回して溶液を混ぜます。フラスコ（T-25、T-75フラスコのために2 mlのために1 ml）を、フィブロネクチン/コラーゲン溶液でコーティングされます。 37℃でO / Nそれを残します。インキュベーション後、溶液を除去し、室温でコーティングしたフラスコを格納します。
      注：回収した溶液を4℃で保存し、3回再利用することができます。 2週間以上のストレージは、液体がそれを廃棄しなければならない時に、茶色（結晶の形成）を、有効にする原因となることがあります。
5. 線維芽細胞の培養：
   1. 37℃、5％CO ₂で、完全DMEM中で、成長し、MRC-5、（14週齢の雄の胎児の正常肺組織に由来するヒト肺線維芽細胞株）を維持します。通路24-26で線維芽細胞を使用し、70〜80％コンフルエントになるまで成長します。
      注：通路> 30でMRC-5細胞株は、形態を失う傾向があると組織モデルでの使用は推奨されません。
6. 上皮細胞の培養：
   1. 16HBE14o-（16HBE）、正常なヒト気道上皮の分化した形態と機能を保持する不死化ヒト気管支上皮細胞株を取得し、（これは博士ディーターGruenert、山シオンがんセンター、カリフォルニア大学、サンフランシスコからの贈り物でした、米国^10。）。フィブロネクチン/コラーゲンコートフラスコで培養16HBE細胞と37℃で5％CO ₂に完全MEMで細胞を維持します。
7. 5倍のDMEMの調製
   1. DMEM粉末13.4 gであり、滅菌蒸留水150ml中の炭酸水素ナトリウム3.7グラムを溶解することによって5倍DMEMを準備します。 、7.3に培地のpHを調整する200ミリリットルにボリュームを構成し、0.22μmのメンブレンフィルターを用いてろ過します。滅菌容器中で濾過培地を収集し、室温で使用するまで保存されました。

コラーゲン埋め込まれた線維芽細胞の調製

1. 37℃の水浴中にFBSおよびL-グルタミンの融解凍結アリコート。解凍後にサンプルを氷上で保冷。 4℃で炭酸水素ナトリウム（71.2 mg / mlの）とゲンタマイシン（50 mg / mlの）を配置します。前クール50mlの遠心分離チューブ、10 mlの滅菌ピペット4℃です。
   注：（5×DMEMを除く）で使用される全ての材料は、使用前に氷上で冷却され、すべてのステップは氷上で行っています。これはコラーゲンの凝固を防ぐように私ウシコラーゲン（1.1 mg / mlの）は、寒さに保持する必要があります入力してください。
2. 線維芽細胞を準備します。
   1. 温かい37℃の水浴中でトリプシンと37℃で5％CO ₂で10分間、肺線維芽細胞（MRC-5）細胞を十分な量をインキュベートします。 1×DMEMを完全に追加することにより、トリプシンを中和してください。 5分間300×gで細胞懸濁液と遠心分離機を吸引します。上清を吸引除去し、完全DMEM中2.3×10 ⁵細胞/ mlで細胞を再懸濁します。使用するまで氷上に細胞を配置します。
3. プレミックスを調製します：
   1. 「プレミックス」と表示されたチューブに以下を追加します。 3955倍のDMEMμlを、40μlのL-グルタミン、120μlの炭酸水素ナトリウム（71.2 mg / mlの）、440μlのFBS、5μlのゲンタマイシン（50 mg / mlの）、総容積千μL、その後、よく事前に混ぜて置く渦巻きます氷。
      注：指定されたボリュームは、1 24ミリメートル6ウェルカルチャーインサート用です。インサートの総数に必要な具体的な金額を計算しますが、必ず、十分なプレミックスを用意することは、余分なものを追加します。
4. 無細胞のコラーゲンの混合物を準備します。
   1. 各培養物に無細胞のコラーゲンの混合物の1ミリリットルを追加します。与えられた順に氷上で50 mlのコニカルチューブに以下を追加します。 1.1 mg / mlのコラーゲンの686μlを、250μlのプレミックス1,000μLの全体積64μlの1×完全DMEM。よく空気の泡を確保していない溶液を混合。高速動作及び気泡を回避するために、チューブの壁にコラーゲンを加えます。
   2. 6ウェルプレートに入れインサートに無細胞層混合物の1ミリリットルを追加します。インサート外ウェルに任意のメディアを追加しないでください。における37℃のインキュベーター中で30分間cubate。無細胞混合物は、気泡なしで、インサート全体をカバーしていることを確認します。
5. 携帯コラーゲン混合物を準備します。
   1. 次の順序で氷上に保持50mlコニカルチューブに細胞層の成分を混合。 2ミリリットルコラーゲン、615μlのプレミックス、1×完全DMEMの58μLと327μlの細胞懸濁液肺線維芽細胞（MRC-5）3000μlに全量をします。各培養物は、細胞のコラーゲン混合物の3ミリリットルを必要とします。
      重要なステップ：細胞懸濁液を添加する前に、慎重にコラーゲンとプレミックスを混合することを確認してください。これは、線維芽細胞に毒性作用を回避するために、コラーゲンのpHを中和します。
   2. 無細胞のコラーゲン層の上に細胞層（3 ml）を加え、37℃のインキュベーターで2時間インキュベートします。高速動作及び気泡を回避するために、チューブの壁にコラーゲンを加えます。
   3. 重合後、トンへの完全DMEM 2ミリリットルを追加します彼（挿入中）6ウェルプレートの底部と24時間インキュベートします。
      注：重合は発生しなかった場合は、線維芽細胞のコラーゲンマトリックスを含むプレートインサートを破棄し、起動オーバー再び。最も可能性の高い原因は、追加または上記試薬の1つの誤ったボリューム内のエラーです。

線維芽細胞のコラーゲンマトリックスの3連続培養

1. 慎重にきれいなピンセットを用いて、インサートを持ち上げて、ウェルの底から培地を吸引除去します。インサート内に2ミリリットル完全DMEMによりうまく​​続くの底に2ミリリットル完全DMEMを追加します。これは、外側と内側のチャンバ間の栄養素の拡散を防ぐことができますように、インサートの下に気泡を導入することは避けてください。マイクロピペットチップを用いて気泡を除去します。
2. 約5〜7日間培養培地（内側とインサート以下）一日おきと文化を変更します。インサートから培地を除去する際には注意してください。コンタを回避するために、線維芽細胞のコラーゲンマトリックスとCT、少しきれいなピンセットを用いて挿入を傾け、インサート壁からメディアを吸引除去します。
   重要なステップ：コラーゲンマトリックス内の線維芽細胞は細長い表現型を取得し、コラーゲン、その後契約を改造する必要があります。約5〜7日では、マトリックスは、インサートの中央にプラットホーム（直径10〜14 mm）を形成するために契約しました。契約した行列は、次のステップで使用するための準備ができています。マトリックスの均一な収縮を得るためには、線維芽細胞は前に（ステップ2.6.1）を播種するコラーゲンで十分に混合されていることが重要です。

免疫細胞（感染/非感染単球 - マクロファージ混合物）の4シード

注：以下の実験手順は、病原性マイコバクテリアを含んでいるため、BSL-3施設で実施されなければなりません。

1. 主要な単球及びマクロファージの調製
   1. establiを使用して、ドナーの血液から末梢血単核球を分離プロトコルを流しました。組織モデルと文化の設定と同じ日に、単球を分離し、Mと感染する前に、約7日間マクロファージにそれらを区別する結核 。
      注：これは、マクロファージと契約し、線維芽細胞のコラーゲンマトリックスの両方が7日後に使用可能であることを確認します。また、感染したマクロファージと一緒に追加されます新鮮な単球を分離します。
2. Mの準備結核に感染したマクロファージ
   1. 培養菌体を収穫、0.05％のTween-80を含む1×PBS、抗生物質を含まない完全DMEM中に再懸濁して洗浄し、細菌の塊を分散させ、光学密度を測定するために切り詰められた無菌の27 G針を通過します。
      注：事前決定M.結核のコロニーは、実験室での光学密度の単位同等物を形成します。これは、感染のために使用される細菌の数の推定値を与えます。
   2. 4時間マクロファージをインキュベートのM。感染多重度（MOI）10）で結核。感染後、細胞外細菌を除去するために、1×PBSで3回洗浄します。同じ方法ではなく、Mなしで培養された非感染マクロファージを使用してください結核 、コントロールとして。
   3. 37℃で10分間、2mMのEDTAで処理することにより培養プレートからマクロファージを取り外し、抗生物質を含まない完全DMEM中で細胞を再懸濁しました。
3. 単球の標識
   注：単球の単離及び標識はBSL-2ベンチで行われ、その後、さらなる処理のためにBSL-3施設に取り込むことができます。
   1. 製造業者の指示に従って、5分間、2μMPKH26赤色色素の最終濃度を有する新たに調製した単球（2×10 ⁷細胞）を染色します。洗浄3回、および1×10 ⁷細胞/ mlの密度で、抗生物質を含まない完全DMEMで細胞を再懸濁します。
4. 線維芽細胞のコラーゲンマトリックスへの免疫細胞の添加
   1. AFTER線維芽細胞のコラーゲンマトリックスの文化の5-7日は、外側と内側のチャンバーから培地を吸引し、外側チャンバへの完全な新鮮な抗生物質を含まないDMEMの1.5ミリリットルを追加します。
   2. MOの比で標識された単球 - マクロファージ（未感染/感染）の混合物を準備します。MQ（5：1）50μlのDMEM中で完了します。 50,000マクロファージのために25万の標識単球を取ります。
   3. 線維芽細胞のコラーゲンマトリックスへのMQ混合物を37℃で5％CO ₂で1時間インキュベート：50μlのMOを追加します。インキュベーション後、穏やかに挿入培地2 mlを加え、37℃で5％CO ₂でさらに24時間インキュベートします。
      注意：追加された細胞が緩く付着しているように、メディアの追加は優しくインサートの壁に追加することで、遅くする必要があります。

肺上皮細胞の5播種（16HBE）

注意：次の手順は、BSL-3施設で実施されなければなりません。

1. シード肺電子MQ-線維芽細胞のコラーゲン層：MOの上pithelial細胞（16HBE）。これを実行するには、まず（2.2.1のように）、トリプシンで処理することにより、フラスコから16HBE細胞を解離し、抗生物質を含まないDMEM中で4×10 ⁶細胞/ mlで再懸濁します。
2. 内側とインサートの外に培地を吸引除去します。 [挿入外に井戸の底で完全な1.5ミリリットルの抗生物質を含まないDMEMを追加します。
3. 免疫細胞、線維芽細胞のコラーゲンマトリックスの上に16HBE50μlのを追加します。フード内で2分間のままにして_、5％CO 2で37℃のインキュベーター中で1時間インキュベートします。インキュベーションの後、37℃で3日間インサートと文化の中で完全な抗生物質を含まないDMEMをゆっくりと2ミリリットルを追加します。培養工程は、組織モデルにおける上皮細胞の増殖を促進します。
   注意：追加された細胞が緩く付着しているように、メディアの追加はインサートの壁をスライドさせることによって遅く、穏やかでなければなりません。

6. 3D肺の空気暴露モデル

注意：感染したマクロファージの5日後に添加した後、組織モデルは、大気に露出しており、以下の手順では、BSL-3施設で実施されなければなりません。

1. 内側とインサートの外に培地を吸引除去します。
   注：このステップでは上清を分泌因子の検出のために回収することができます。 -70℃での遠心分離、滅菌フィルターとストア上清。
2. 外室に1.8ミリリットル抗生物質を含まないDMEM完全を追加し、2日間37℃インキュベーターで5％CO ₂でインキュベートします。インサート内の培地を追加しないでください。
   注：組織モデルのエアリフトは、ヒトの肺組織への組織と生理学的な類似する強度を提供重層上皮および粘液分泌の形成を促進します。

7.収穫と3D肺組織モデルのマウント

注意：次の手順は、BSL-3施設で実施されなければなりません。

1. 感染したマクロファージの7日後の移植では、組織モデルは、収穫の準備ができています。組織モデルから完全に培地を除去します。室温で暗所で30分間、4％パラホルムアルデヒドで組織モデルを修正。このステップでは、細菌を殺し、さらなる処理のための組織/細胞形態を修正します。
2. メスを用いて、ウェルインサートからの膜を分離します。よく含む1×PBSに組織を含む膜を転送します。
3. きれいなメスを用いて組織モデルの側面をカットし、削除します。そして、4ほぼ等しい正方形のピースに組織モデルをスライス。スーパーフロストスライドガラス上に組織片を転送します。 4℃で1×PBS中の組織片を保管してください。
4. 5分のための組織を乾燥させ、DAPIとカバーガラスで延長ゴールド褪色防止を使用してマウントします。乾燥するまで室温で暗所に妨げることなく、スライドのままにしておきます。
   注：組織の厚さがわずかtiltiを起こし、中心部と周辺部との間で異なる場合がありますカバーガラスのNG。これを回避するために、（例えばパラフィルムのための）スペーサは、カバースリップの角に配置されてもよいです。
5. カバーガラスの端にマニキュアを適用し、それを乾燥させます。 BSL-3施設の引き出すために、それらを安全にするために、70％エタノールでスライドを浸し。

8.可視化、買収および定量的3D解析

1. レーザーはそれぞれ、GFP（緑色チャンネル）、PKH26標識単球のためのDAPI（青）のための420 nmおよび555 nmの（赤）の励起のための488nmで発光すると共焦点顕微鏡システムを用いた組織スライドを可視化。
2. スタック間の1.5ミクロンの分離 - Z-スタックが20ミクロンの厚さの最小値でカバーし、1を有する512×512の解像度で3D画像を取得します。組織の作品全体をカバー5-10異なるフィールドを取得します。
   注：光学解像度（波長、レーザパワー/露出、ピクセルサイズとズーム）の最適な設定のためにこのようなNyqvistような構成を使用してください。国連を避けますDERまたはピクセルの彩度を超えます。
3. 三次元画像処理ソフトウェアを使用して共焦点画像を分析します。細胞クラスターの3次元定量のために、以下のステップは、最適な分析のために推奨されています。
4. 3D画像処理ソフトウェアを開いて、イメージをロードします。核の大きさ、個々の単球及び単細菌、例えば、画像中に分析される対象物の寸法を測定します。これらの観​​察は、オブジェクトを定義するか、フィルタリングするために有用です。
5. 表示調整ツールを使用して、画像のコントラスト、明るさ、不透明度をブレンドするための各チャネルを調整することにより、ボリュームレンダリングを最適化します。このステップは、ボリュームレンダリングのノイズの干渉を最小にすることです。
   注：ガンマ補正は、画像の操作につながる可能性があり、したがって、避けるべきです。
6. 赤チャンネル（単球）を選択してサーフェスを作成し、しきい値（自動または手動選択）を設定します。必要であれば、赤単球の選択を制限するフィルタを使用したり、Bを除外することackground。前述したように同様に、緑（ 結核菌 ）と青面（核）のチャネルを作成します。
7. MS-Excelファイルにデータをエクスポートします。これは、特定のパラメータまたはすべてのデータをエクスポートすることが可能です。セルのクラスタリングの分析に関連するパラメータは、ボリューム、強度、オブジェクトの数、ボクセルと真球の数です。
8. 適切な画像フォーマット、好ましくはTIFFで画像を保存してエクスポートします。
   注：アニメーションはまた、アニメーションメニューを使用して行われ、メディアファイルとして保存することができます。
9. 追加パラメータオプションを使用して、各チャネルの解析設定を保存し、再構築機能を使用して後で検索することができます。同時にバッチ処理ツールを使用して複数のファイルを分析します。
   注：比較されるすべての画像が同じように、取得された処理され、分析されなければなりません。例えば8ビットの画像（256の整数）は12ビット画像（4096整数）と比較すべきではありません。

結果

ヒトの結核のための3D肺組織モデルは、効果的にMの宿主-病原体相互作用を研究するために使用することができ結核感染 。この方法の基本的な手順は、異なるステップ及び組織切片の全体的な微細構造の代表的な顕微鏡写真を図1に概説されている。このモデルは肺線維芽細胞、気管支上皮細胞および初代単球/マクロファージを含むヒト肺組織のいくつかの構成要素を有しています3D組織環境内に埋め込まれました。ヒト肺組織の構成要素を組み込むだけでなく、モデルは、生理的条件に上皮および粘液分泌のすなわち成層に似ています。

TB感染の監視に肺組織モデルの使用の例は、図2に示されている。M.を視覚化するため結核 -immune細胞遊走との相互作用は、我々 は 、Mに感染したマクロファージを導入しましたGFPを発現する結核組織モデル（核について染色ブルー、DAPI）に合わせて新たに単離したPKH26標識単球（赤）と（緑）。 Mの 7日後の追加について組織モデルに結核に感染した細胞は、共焦点顕微鏡は、人間の結核⁹の特徴的な病変を模倣感染（緑）のサイト（ 図2）、で赤単球のクラスターを明らかにしています。

Mの 3次元可視化のための代表的な一連の画像結核は、細胞クラスターの組織モデルと定量化は、図3に示されているに感染し。3Dビジュアライゼーションは、3D画像にいくつかの機能を、対話調べ、定量化するため、ユーザーの柔軟性を提供します。 M.部位で単球のクラスターを明らかに図3Bに示すように、緑と赤の細菌単球クラスタの空間的配置は、頂端の回転及び側面図から分かるよう結核。クラスター OBませんでした感染していない組織 （ 図3A）で提供しています。個々の単球の数がMに（p <0.01）減少し、我々は、単球細胞集団のサイズと数を定量した （p <0.001）、細胞塊の大きさ（体積）が増強されることを見出しました結核は感染していない組織モデル（ 図3Cおよび3D）と比較して組織を感染させました。このデータは、Mの初期の肉芽腫形成の我々の以前の発見を検証します結核感染は、2D組織切片⁹で分析肺組織モデルで観察しました。

我々のデータは、組織モデルは、M細胞-複雑なホストを調査するために自然な立体生息地を提供していることを示唆しています結核の通信ネットワーク。また、3次元可視化と定量分析は、組織モデル（ 図3）の機能を研究するための優れたツールであることがわかりました。細胞塊の定量化（例えば、肉芽腫）、多くの場合、ストレッチいくつかの細胞層のHESとは完全に3次元定量分析によって捕捉することができます。また、モデル内の個々の細胞や細菌の正確な空間的および時間的特徴の可視化は、指定された実験室でのライブイメージング、移動および追跡調査を可能にします。

病原性M.周囲の組織モデルクラスター図2.単球結核。感染していないと、Mの代表的な共焦点画像結核に感染した組織モデルが提示されています。感染していない組織と比較して、パネルの緑色から（M. tuberculosis- GFP）、赤（PKH26標識単球）、青（DAPI染色核）と合併チャネルが感染組織における単球の動員を示します。スケール - 100μmです。large.jpg "スタイル="フォントサイズ：14px;行の高さ：28px; "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3. 3次元可視化と組織モデルの定量分析は、有用な情報を提供しています。全体の組織モデル（A）非感染組織の3次元可視化の代表的な画像、（B）に感染したM.結核、IMARIS画像処理ソフトウェア（バージョン7.6.8）によりツァイスLSM700共焦点顕微鏡および定量分析を用いた光学セクショニングを介し。これらの画像は20X倍率で取得された、頂端、回転水平、回転、垂直および側面図（AとB）からの可視化を可能にする、1.5μmの間隔で19.5ミクロンの組織の厚さをカバーする14のzスタック。（C）QUA単球細胞クラスターのntitative分析はM.後早期肉芽腫クラスタの増強した（p <0.0001）のサイズを明らかに感染組織で複数のクラスタを繰り返し強調、感染していない組織と比較して、感染の不在に比べ結核感染 。（D）単球数の定量は、感染組織の減少した（p <0.01）を示しました。グリーン- M.結核 -GFP、レッド- PKH26標識単球、ブルー-細胞核、スケール- 。100ミクロンこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

ディスカッション

感染部位で組織化された細胞クラスターを動員して形成する能力は、ヒト結核の特徴です ¹¹。結核肉芽腫として知られるこれらの動的構造は、主に免疫細胞(マクロファージ、単球、T細胞、B細胞)と結 核菌を取り巻く多核巨細胞で構成されています。肉芽腫の役割は、感染を遮断し、細菌の局所的な拡散を防ぐことが長い間考えられてきました。しかし、より最近の研究では、肉芽腫の形成が細菌の早期生存、増殖、播種に重要であることが示されています ¹²。新しい研究の戦略は、肉芽腫形成および/または結核播種における細胞遊走を阻害するために効率的に標的にすることができる分子または経路を特定することです。

結核に関する新しい研究の注意点は、ヒトの結核を再現するモデルが不足していることです。最も広く使用されている実験動物は、 結核菌 感染時に真の肉芽腫を形成しないため、結核 ^13-16 の研究には適切な選択肢ではありません。ヒト以外の霊長類はヒトの結核に最も近い ¹⁷ ですが、高い運用コストと倫理的問題のため、好ましい選択ではありません。ヒト結核は複雑な免疫学的プロセスであり、 in vitroでモデル化することは困難です。単層または共培養の細胞培養には、3D環境と組織応答が欠けています。したがって、ヒト初代免疫細胞およびヒト肺特異的細胞株に基づく革新的な肺組織モデルを開発しました ^8,9。このモデルは、マクロファージが均一に組み込まれた上皮、細胞外マトリックスの形成、層状上皮、粘液分泌など、ヒト肺組織の特徴的な特徴を示します ⁹。

3Dヒト肺組織モデルには、組織培養プレートまたはトランスウェルインサートに播種された in vitro 単一培養または共培養に比べていくつかの利点があります。第一に、ヒト肺特異的細胞(線維芽細胞および上皮細胞)は、 一般的にin vitro 単一培養または共培養には含まれません。第二に、免疫細胞と肺特異的細胞は、3D生理学的文脈(コラーゲンが豊富な細胞外マトリックス製品)に埋め込まれています。刺激/感染に対する細胞の反応と、肉芽腫の形成などの細胞の移動行動は、2D 環境と 3D 環境で大きく異なります。さらに、説明されている方法により、空間分布と複雑な細胞相互作用に関する極めて重要な情報を提供する 3D 視覚化と堅牢な 3D 定量分析が可能になります。

結核菌によるモデル組織における実験的感染は、初期の結核肉芽腫を彷彿とさせる、感染部位でのマクロファージのクラスター化をもたらしました(図2および3)。我々は最近、病原性因子ESAT-6を分泌する能力に欠陥のある変異株 ESAT-6またはESAT-6を欠くウシ菌BCGは、病原性の結核菌とは対照的に、単球のクラスター化を誘導しなかった(早期肉芽腫^なし)。これらのデータは、Mycobacterium marinumに感染したゼブラフィッシュ胚から行われた観察と一致しており、その透明性により肉芽腫形成のエレガントなライブイメージングが可能になります¹²。結核のゴールドスタンダードモデルがないため、結核患者から外科的に切除された組織生検を利用して、方法⁹を検証しました。私たちの in vitro 組織モデルは、肉芽腫におけるマクロファージの凝集、細胞内および細胞外細菌の両方の存在 ¹⁸、壊死の誘導など、結核患者の肺およびリンパ節生検といくつかの特徴を共有しています ¹¹。

記載されているモデルはヒト結核と生理学的関連性があり、他の in vitro モデルに比べていくつかの利点がありますが、いくつかの制限があります。たとえば、ヒトで同定された20以上のコラーゲンタンパク質のうち、細胞外マトリックスを模倣するためにモデルに含まれているのはタイプIのみです。しかし、I型コラーゲンは細胞外マトリックス産物の複雑な混合物であり、人体に最も豊富なコラーゲンです。さらに、組織モデルの上皮細胞や線維芽細胞によって産生されるコラーゲンIVとトロポエラスチン、ビメンチン、ラミニンなどのいくつかの細胞外マトリックスタンパク質の存在を実証し、新しいコラーゲン ⁸の合成を示しています。現在、肺組織モデルには、肺特異的細胞の他に単球とマクロファージしかありません。肉芽腫にも存在することが知られている好中球とリンパ球が欠けています。驚くべきことに、このモデルは追加の免疫細胞の導入に限定されず、それらがヒト結核の複雑な細胞相互作用にどのように寄与するかを調査するのに興味深いものです。初代肺胞マクロファージ、皮膚特異的細胞、および肺癌細胞の移植は、モデルですでにテストされています。私たちの目的は、ヒト結核によく似たモデルを使用することであったため、マウス細胞の導入は試みられていません。

要約すると、肺組織モデルは、基本的な機構研究と応用研究の両方に影響を及ぼします。肺モデルの潜在的な用途には、自然免疫の研究、食体成熟、オートファジー、サイトカイン、ケモカイン、抗菌ペプチドの産生などの宿主防御のメカニズム的側面の調査、および個々の細胞型の機能特性評価が含まれます。驚くべきことに、 in vitro 組織モデルは、1つまたは複数の細胞型の操作を可能にし、結核の研究だけでなく、肺に影響を与えるさまざまな感染症および非感染性疾患に関連する組織微小環境を提供します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
細胞培養インサート	BD Falcon	353092
6ウェル培養プレート	BD Falcon	353046
MRC-5細胞、肺線維芽細胞			ATCC#CCL-171
16HBE細胞、肺上皮細胞			Dieter Gruenert博士からの贈り物、カリフォルニア大学サンフランシスコ校、米国、マウント・ザイオンがんセンター
5 x ダルベッコ修正されたイーグル」s medium (5 x DMEM)	Gibco	12800-082	粉末から作られていますが、水の添加量が 5 倍少なくなっています。pHを7.3に調整し、0.2µを使用してろ過します。mフィルター。
ダルベッコ修正されたイーグル」s Medium with Glucose (DMEM) 1x	Gibco	41965-039
Minimum Essential Medium (MEM) 1x with Earle's 塩	Sigma	M4655
非必須アミノ酸溶液、100x	Life Technologies	11140-035
L-グルタミン 200 mM (100x)	Gibco	25030-024
ビン酸ナトリウム	Life Technologies	11360-039
NaHCO3 (71.2 mg/ml)			社内で調製
熱不活化ウシ胎児血清 (FBS)	Gibco	10270-106	熱を 30 分間、56 °C;C
ゲンタマイシン (50 mg/ml)	Gibco	15750-060
Hepes 緩衝液 1M	Gibco	15630-056
ペニシリン ストレプトマイシン(連鎖球菌ペン)	Gibco	15140-122
Lymphoprep	Axis-Shield	7801
超高純度 0.5 M EDTA	Gibco	15575
ウシコラーゲン PA 処理済み (500 ml)	器官形成	200-055
ピュアコール精製ウシコラーゲン溶液 (100 ml)	アドバンスドバイオマトリックス	5005-B
細胞外マトリックスタンパク質、フィブロネクチン (1 mg)	BD	354008
初代ヒト単球/マクロファージ			ヒト全血またはバフィーコートから単離。
PKH26赤色蛍光細胞リンカーSigma		MINI26
結核菌H37Rvを発現する緑色蛍光タンパク質			M.結核菌H37Rv野生型を、GFPを構成的に発現するpFPV2プラスミドで形質転換した。
ミドルブルック 7H9 ミディアム	Difco	271310
BBL ミドルブルック ADC エンリッチメント	BBL	211887
Tween-80
グリセロール
カナマイシン B 硫酸塩 (20 & micro;g/ml)	Sigma	B5264
Prolong Gold anti=-fade 試薬と DAPI	Invitrogen	P36935
トリプシン -EDTA
ウシ血清アルブミン
パラホルムアルデヒド
DAPI
LSM700 共焦点顕微鏡	Zeiss
iMaris Scientific 3D/4D画像処理ソフトウェア、バージョン7.6.8	Bitplane AG