細胞標識および超常磁性酸化鉄ナノ粒子とターゲティング

サマリー

標的細胞送達は、さまざまな生物医学的応用に有用です。 このプロトコルの目標は、超常磁性酸化鉄ナノ粒子(SPION)を使用して細胞を標識し、それにより、細胞送達と局在化を高度に制御するための磁気細胞ターゲティングアプローチを可能にすることです。

要約

細胞および治療剤の標的化送達は、オフターゲット部位への悪影響を最小限に抑えながら、標的部位で治療効果を集中することにより、生物医学的用途の広い範囲に利益をもたらします。磁気細胞標的化は、効率的で、安全で、簡単な配信技術です。超常磁性酸化鉄ナノ粒子（SPION）は、生体適合性、生分解性であり、および磁界に応答してレンダリングするために細胞内に取り込ませることができます。合成プロセスは、マグネタイト鉄（Fe ₃ O _{4）を作成する}ことを含む、ポリ（乳酸-コ-グリコール酸）（PLGA）コーティングを形成するために、高速乳化続いナノ粒子。 PLGA-マグネタイトSPIONsは約10 nmの直径のマグネタイトコアを含む直径約120nmです。培養培地中に置かれたとき、SPIONsは、天然細胞によってエンドサイトーシスおよび細胞質エンドソーム内の小さなクラスターとして記憶されます。これらの粒子は、細胞に十分な磁気質量を与え磁場内にターゲットを可能にします。多数の細胞選別とターゲットアプリケーションは、磁場に反応する様々な細胞型をレンダリングすることで有効になっています。 SPIONsは、同様に、腫瘍の治療または組織はんだ付けのための医療用イメージング造影剤として使用する、標的薬物や遺伝子デリバリー、診断アッセイ、およびローカル温熱療法の生成を含む他の生物医学的用途の多様性を持っています。

概要

体内の特定の部位への細胞の標的送達と捕捉は、さまざまな生物医学的応用にとって望ましいことです。 MRIガイド下集束超音波による脳への神経幹細胞の送達は、神経変性疾患、外傷性脳損傷、および脳卒中¹の可能な治療選択肢として提案されています。 間葉系幹細胞は、その自然な腫瘍向性により、抗がん剤を腫瘍に送達する能力について研究されています^2,3。 心筋幹細胞は、心筋梗塞の可能な治療法として心臓に送達されています^4,5。 血管ステントは、循環する前駆細胞を捕捉するためにCD34抗体を用いて開発されています⁶。 これらの細胞ターゲティングアプローチは有望ですが、細胞特異性の欠如、一貫性のない細胞保持、オフターゲット細胞送達などの欠点があります。

現在の方法の全体的な目標は、さまざまな細胞送達および選別アプリケーションのために、細胞の磁気指向ターゲティングを可能にすることです。 磁気ターゲティングにより、特定の細胞を特定の標的部位に制御して送達することができ、オフターゲット効果は最小限に抑えられます⁷。 磁場は^、体内の磁気標識細胞の動きを安全に方向付けるために、埋め込まれたデバイスまたは外部デバイスによって生成することができる8。 数多くの研究努力は、再生結果を改善するために、心臓^9-14、網膜¹⁵、肺¹⁶、皮膚¹⁷、脊髄^18,19、骨²⁰、肝臓²¹、および筋肉^22,23などの損傷組織に対する幹細胞の磁気指向ターゲティングに焦点を当ててきました。

細胞の磁気ターゲティングも、埋め込み型心血管デバイスを内皮化する手段として広く研究されています。 均一で完全な内皮は、デバイスと循環血液要素との間にバリアを提供し、血栓症と炎症を軽減します。 内皮細胞は、移植前に、または移植後に血管系を介してデバイスに送達することができます。 いずれの場合も、磁場を使用して細胞を装置の表面に捕捉し、血液の循環によって生じるせん断応力にさらされたときに細胞を保持します。 磁気血管ステント^24〜27および血管移植片²⁸は、両方ともこの目的のために製造され、試験されている。

磁気セルターゲティングには、磁気キャリア粒子で細胞を標識するための戦略が必要です。 これらの粒子は、抗体またはリガンド/受容体ペアを介して細胞の表面に結合するか、細胞内にエンドサイトーシスすることができます。 超常磁性酸化鉄ナノ粒子(SPION)は、生分解性、生体適合性、および様々な細胞タイプによって容易にエンドサイトーシスされる²⁹。 これらの粒子は、磁場に応答する細胞を効果的にレンダリングし、時間の経過とともに自然に分解されます。 SPIONは、さまざまな磁気ターゲティングおよびソーティングアプリケーション向けに、培養中の細胞を磁気的に標識する簡単で安全な手段を提供します。 マグネタイト(_Fe3O4)コアとポリ(lactic-co-glycolic acid)(PLGA)シェルを持つSPIONを合成する方法が提供されています。 さらに、培養中の細胞をSPIONで標識する方法が提供されています。

プロトコル

マグネタイトゲルの合成1。

1. エチルアルコールが続く脱イオン水、続いて濃塩酸を使用して、すべてのガラス器具を洗ってください。好ましくは乾燥炉中で、O / Nを乾燥することができます。
   注意！塩酸は危険です - ドラフト内で個人用保護具や作業を着用。エチルアルコールは有害である - 個人用保護具を着用します。
2. 脱ガス、脱イオンH _{2 Oを} 500ミリリットルを静かに30分間N ₂ガ ​​スをバブリングすることによりDreschelボトルを使用してください。
3. セットアップマグネタイト合成装置を化学ヒュームフード内。
   1. isomantleヒーター内500mlの三口丸底フラスコを置き、クランプを使用して、中央の口を確保し、スタンド。
   2. 丸底フラスコの側面口の1つ、残りの側の首にゴム隔壁を還流冷却器にゴム隔膜を取り付けます。連続還流冷却器を通して冷たい水を実行します。
   3. パンク番目_N 2ガ ​​スラインに接続された針を用いて電子丸底フラスコのゴム隔壁とガス流出を可視化するためにバブラー（水とのすなわち、フラスコ）に実行されているガスラインに接続された針で還流冷却器のゴム隔膜を穿刺。
   4. パドルアダプタを介して丸底フラスコの中央の口にブレードパドルを取り付けます。スタンドに取り付けられたオーバーヘッドスターラーをブレードパドルのシャフトを取り付けます。
4. N ₂ガ ​​スを用いた丸底フラスコをパージし、低いが検出速度で流れるN ₂ガ ​​スを残します。
5. 丸底フラスコから還流冷却器を取り外し、塩化鉄（III）、鉄の0.6125グラム（II）塩化物水和物の1.000グラムを追加し、脱気_H 2 Oの50ミリリットル
   注意！塩化鉄（III）および塩化鉄（II）四水和物は、有害である - 個人用保護具を着用します。
6. 50に加熱しながら還流冷却器を取り付け、1000rpmで攪拌°C。これらの条件下で攪拌すると、10 nmの直径のマグネタイトナノ粒子を生成します。
7. 一旦、50℃で、さらに攪拌しながら丸底フラスコにゴム隔膜を介して注入することにより、28％水酸化アンモニウム溶液10mlを加えます。
   注意！水酸化アンモニウムは有害である - 個人用保護具を着用します。
   注：水酸化アンモニウム溶液は、マグネタイトを沈殿させるために使用され、溶液が黒くなるべきです。
8. まだ攪拌しながらアンモニアガスを沸騰する90℃に丸底フラスコと熱からゴム隔壁_および N 2ガ ​​スラインを外します。
   注：これは、還流冷却器のゴム隔壁を穿刺することにより、丸底フラスコに、N ₂の流れを維持するために、任意である、しかし、マグヘマイトへの磁鉄鉱 ​​の酸化は、このステップの間に無視できるものです。
9. いったん90℃でまだ攪拌しながら、丸底フラスコにオレイン酸の1ミリリットルを追加します。オレイン酸は、マグネタイトNA被覆するために使用されていますマグネタイトのゲルを形成するnoparticles。
   注意！オレイン酸は有害である - 個人用保護具を着用します。
10. 丸底フラスコにゴム隔壁_および N 2ガ ​​スラインを交換し、還流冷却器を取り外します。
11. 熱をオフにして、2時間、500rpmで攪拌​​します。
12. isomantleヒーターからの丸底フラスコを取り外し、マグネタイトゲルを保持するために、フラスコの底に対して保持強力な磁石を使用している間、残りの液体をデカント。
    注意！損傷または傷害を避けるために、細心の注意を持つ強力な磁石を処理します。
13. 空気乾燥O / N（オプション）にマグネタイトゲルを許可します。

マグネタイトゲルの2精製

1. マグネタイトゲルを溶解させた丸底フラスコに、ヘキサン40 mlを加え
   注意！ヘキサンは有害である - ドラフト内で個人用保護具と仕事を着用してください。
2. 残留H ₂ Oあちこち除去するために、脱気_の H 2 O 40mLで分液漏斗を使用してくださいマグネタイト溶液メートル。
   1. ゆっくりと分液漏斗内のH ₂ Oにマグネタイト液を注ぎ、軽く5分間二相液体を旋回。
   2. 外排出し、下部の水部分を破棄します。
   3. ゆっくりマグネタイトソリューションの下に、それが落ち着くように、分液漏斗に脱気したH _{2 O}の40ミリリットルを加え、穏やかに旋回し、以前のようにドレイン。
   4. 三度目の洗浄するために繰り返します。
3. 、三角フラスコにマグネタイト液を移し、無水硫酸ナトリウムの価値はいくつかへらを追加し、マグネタイト溶液から、残りの残留H _{2 O}を除去するための渦。
4. 硫酸ナトリウム及び残留_H 2 Oを除去するための濾過漏斗で1ミクロンの濾紙マグネタイト溶液を濾過
   注：真空支援が推奨されます。
5. 50ミリリットル蒸発フラスコにマグネタイト液を移し、ヘキサンを蒸発させるために、ロータリーエバポレーターを使用以下の条件で2時間：中程度の回転速度、真空度は50℃の水浴でフラスコを蒸発させ、塗布し、24℃の水が凝縮器を循環します。
   注：必要に応じて、PLGAでコーティングする前にマグネタイトゲルを保存します。

PLGAシェルを使用したマグネタイトナノ粒子の3コーティング

1. 1.5％（M / V）のソリューションを作成するために、酢酸エチル240mlの中のPLGAの3.60グラム（75/25ブレンド）を溶解します。注意：酢酸エチルは有害である - ドラフト内で個人用保護具と仕事を着用してください。
2. 5.0％（M / V）溶液を作成するために、磁気スターラーを用いて脱気H _{2 O} 500ml中のPluronic F-127の25.00グラムを溶解します。
   注：プルロニックF-127は、生体適合性界面活性剤として作用する非イオン性両親媒性ブロック共重合体です。なお、ステップ3.3.2で水中油型エマルジョンを安定化するのに役立ちます。
3. ミクロを使用して、重み付けされたガラスバイアル内で6 0.040グラムのアリコートにマグネタイトゲルを収集します。 PERF各アリコートについては、以下のコーティング及び洗浄工程をORM。
   注：一定分量は、ステップ4で劣化する前に凍結乾燥を最小限に抑えながら、純度と収率を最大れる、効率的な処理および磁気デカンテーションを確保するために必要です。
   1. 10分間超音波洗浄器で0.040グラムのマグネタイトゲルのアリコートおよびプラスチックビーカー超音波処理にPLGA溶液の40ミリリットルを追加します。
   2. プラスチックビーカーのプルロニック溶液80 mlを加え、すぐに水中油型エマルジョンとしてマグネタイトナノ粒子上のPLGAコーティングを形成するために7分間最高設定で実験室用ミキサーで乳化します。
   3. すぐに酢酸エチルを蒸発させ、化学換気フード中で1時間脱イオンH _{2 O}及び超音波処理を1 LにSPION溶液を希釈します。
   4. SPION溶液に次の強力な磁石を置き、静かに磁石で茶色がかっSPIONsを収集するためにかき混ぜます。
      注：これは、断続的に、数時間攪拌する必要があるかもしれません溶液前SはSPIONsのほとんどが収集されたことを示す白っぽくなります。
   5. 磁石をビーカーにSPIONsを維持しながら水溶液をデカント。
   6. 次のようにSPIONsを3回洗浄します。
      1. 脱イオン_H 2 O 1LにSPIONsサスペンド
      2. 20分間SPION液を超音波処理。
      3. SPION溶液に次の強力な磁石を置き、静かに磁石で茶色がかっSPIONsを収集するためにかき混ぜます。これは、溶液がSPIONsの大部分が回収されたことを示す明確なターン前に断続的に数時間撹拌することが必要であり得ます。
      4. 磁石をビーカーにSPIONsを維持しながら水溶液をデカント。
4. 水性懸濁液のような単一の加重ガラス瓶に6マグネタイトゲルアリコートのそれぞれから合成SPIONsを収集します。必要に応じて、必要に応じて磁気的に余分な水分をデカント。

4.フリーズSPIONsの-drying

1. SPIONソリューションをフリーズします。
2. 凍結乾燥した凍結乾燥機でSPION液O / Nに。
3. 凍結乾燥SPIONsを計量。細胞標識に使用するまで凍結乾燥SPIONsを-20℃で保存することができます。
   注：-20°C劇的での保存は、分解速度を減少させ、貯蔵寿命を向上させます。

SPIONsによる細胞の5ラベリング

1. 40 mg / mlの濃度でリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中SPIONsのアリコートを一時停止し、30分間超音波処理します。
2. 細胞培養培地を5μl/ mlの濃度で細胞のほぼコンフルエントなフラスコにSPION溶液を加えます。静かにフラスコを揺動することにより均一な分布を確認してください。
3. 37℃で16時間細胞をインキュベートします。
4. 穏やかに培地を吸引し、PBSで細胞を2回洗浄します。
5. 磁気標識細胞を収集し、実験に使用します。
6. 未使用SPION溶液は​​4℃で保存することができ、米国でなければなりません数ヶ月以内にエド。各使用前に30分間超音波処理。

結果

マグネタイトナノ粒子は、50℃、1000回転（図1）での鉄（III）、塩化鉄（II）塩化物水和物の水溶液を攪拌した結果、直径が約10nmです。これらの結果は、マグネタイトナノ粒子の合成に成功を実証します。これは、最初に合成しようとすると、バッチの少量の試料から採取したマグネタイトナノ粒子のサイズおよび形状を確認することが重要です。透過型電子顕微鏡（TEM）は、これらの粒子を可視化するための好ましい方法です。バッチは破棄されるべきであり、 図1に示すように、マグネタイトナノ粒子は直径および球形で10nm程度でない場合、合成が再試行する必要があります。

120nmで（図2）の直径を有するPLGA-マグネタイトSPIONsの高速乳化剤結果を用いて、PLGAとマグネタイトナノ粒子をコーティングします。これらの結果は、成功した実証しますPLGA-マグネタイトSPIONsの合成。これは、初めて合成をしようとしたときにバッチの小さなサンプルから採取したPLGA-マグネタイトSPIONsの大きさ...

ディスカッション

任意のナノ粒子合成プロトコルと同様に、反応物質の化学物質の純度は、最小限の細胞毒性効果を持つことになり、高品質のSPIONsを達成するために重要です。これは、オレイン酸（≥99％）、塩化鉄（II）四水和物（≥99.99％）、塩化鉄（III）（≥99.99％）、酢酸エチルなどの非常に純粋な試薬を購入することが重要である（HPLCグレード、≥99.9％ ）、ヘキサン（HPLCグレード、≥97.0％）、水酸化アンモニウム（≥99.99％）、及び硫酸ナトリウム（≥99.0％）。これは、比較的高価であり、非常に純粋な、高品質のPLGAを、購入するために特に重要です。また、すべてのガラス製品は、完全に塩酸、脱イオン水、エチルアルコールで洗浄し、使用前に乾燥させなければなりません。

同様に、プロトコル内の精製工程および洗浄工程は、最終的なSPIONsが高品質であること、最小限の細胞毒性作用を持つことになります確保するために重要です。マグネタイトゲルはあってはなりませんPLGAで被覆する前に可能な限り多くの水酸化アンモニウム、水、及びヘキサン等。したがって、プロトコルの多くはマグネタイトゲルの純度...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
水酸化アンモニウム溶液、28% NH3、H2O、≥99.99%微量金属ベース	Sigma-Aldrich	338818-100ML	有害な試薬 - 個人用保護具を着用してください
ドレッシェルボトル、500 ml	Ace Glass	5516-16
Ethyl Acetate、CHROMASOLVR Plus、HPLC用、99.9%	Sigma-Aldrich	650528-1L	有害な試薬 - 個人用保護具を着用し、ヒュームフードで作業
エチルアルコール	Sigma-Aldrich	E7023	有害な試薬 - 個人用保護具を着用
蒸発フラスコ、50 ml、24/40ジョイント	Sigma-Aldrich	Z515558	ロトエバポレーターで使用するため
フィルターペーパー、直径3cm、グレード1	フィッシャー	09-805P	ガラスフィルター漏斗で使用するため
ガラスビーカー、1 L	フィッシャー	FB-101-1000	SPIONの洗浄用
ガラスフィルター漏斗、バキュームホースアダプター、24/40、30 mLに適合	フィッシャー	K954100-0344
ガラスバイアルキャップ	フィッシャー	03-391-46	ガラスバイアル用
ガラスバイアル、2 ml	フィッシャー	03-391-44	マグネタイトゲルの収集用 &SPIONs
Hexane, CHROMASOLVR, HPLC用, ≥97.0% (GC)	シグマ・アルドリッチ	34859-1L	有害な試薬 - 個人用保護具を着用し、ドラフトで作業してください
塩酸	Sigma-Aldrich	H1758	有害な試薬 - 個人用保護具を着用し、ヒュームフードで作業
鉄(II)四水和物、≥99.99%微量金属基準	Sigma-Aldrich	380024-5G	有害な試薬 - 個人用保護具を着用してください
塩化鉄(III)無水、粉末、≥99.99%微量金属ベース	Sigma-Aldrich	451649-1G	有害な試薬 - 個人用保護具を着用
アイソマントルヒーター、500mL	Voight Global	EM0500/CEX1
ラボミキサー	シルバーソン	L5M-A
凍結乾燥機	Labconco	7670520
マイクロスパチュラス	フィッシャー	21-401-25A	マグネタイトの移送用ゲル
NdFeB磁石、1インチx 1インチx 1インチ	メージングマグネット	C1000H-M	非常に強力な磁石、オレイン酸のハンドル、
≥99% (GC)	シグマ・アルドリッチ	O1008-5G	冷凍庫に保管します。有害な試薬 - 個人用保護具を着用
してください オーバーヘッドスターラー	IKA	2572201
オーバーヘッドスターラークランプ	IKA	2664000	オーバーヘッドスターラー用
オーバーヘッドスターラー用 Hスタンド	IKA	1412000	オーバーヘッドスターラー用
リン酸緩衝生理食塩水	ライフテクノロジー	10010-023
プラスチックビーカー、250 ml	フィ	ッシャー02-591-28
PLGA PURASORB PDLG(75/25ブレンド)	Purac	PDLG 7502	PDLG 7502Aも使用できます。冷凍庫で保存
プルロニックF-127粉末、BioReagent、細胞培養に適した	Sigma-Aldrich	P2443-250G
PTFE拡張可能ブレードパドル、直径8 mm	SciQuip	SP4018
PTFE容器アダプター、24/40、直径8 mmパドルに適合	Monmouth Scientific	PTFE容器アダプターA480	PTFE拡張ブレードパドルと併用
再循環チラー	クラークソン	696613	回転蒸発器
逆流コンデンサーと併用、24/40、250 mmに適合	Ace Glass	5997-133
ロトエバポレーター	クラークソン	216949
ラバーセプタム、ストッパー付き24/40	スガラス	9096-56
セパレーター漏斗、250ミリリットル	フィ	ッシャー10-438E
硫酸ナトリウムACS試薬に適合、≥99.0%、無水粒粒	Sigma-Aldrich	239313-500G
3ネック丸底フラスコ、角度付き、24/40ジョイント、500ml	エースガラス	6948-16
超音波洗浄機 穴あきパン	フィッシャー	15-335-20A	超音波洗浄機用
超音波洗浄機、2.8 L	フィッシャー	15-335-20
真空コントローラー	クラークソン	216639	回転蒸発器用 (オプション)
真空ポンプ	Clarkson	219959	ロトエバポレーター用