フィーダーフリー条件にセンダイウイルスを用いてヒト末梢T細胞から人工多能性幹細胞の生成

サマリー

このプロトコルは、リプログラミング因子を含むマトリゲルとセンダイウイルスベクターの組み合わせを使用して、フィーダーフリーの状態でヒト末梢T細胞から人工多能性幹細胞(iPSC)を生成する方法を説明しています。

要約

最近では、性IPSCは、再生医療のための細胞の新しいソースとして注目を集めています。 iPS細胞を生成するための初期の方法は侵襲的生検および導入遺伝子のレトロウイルスゲノムに挿入して得られた皮膚線維芽細胞に依存していましたが、これらの欠点を回避するために多くの努力がなされてきました。ヒト末梢T細胞がiPS細胞を生成するためのユニークな細胞源です。 T細胞由来のiPS細胞は、T細胞受容体（TCR）遺伝子の再配列を含み、抗原特異的T細胞の供給源です。さらに、ゲノム中のT細胞受容体の再配置は、個々の細胞株を標識し、移植したドナー細胞とを区別する可能性を有します。性IPSCの安全な臨床応用のためには、有害な薬剤に新たに生成されたiPS細胞を曝露する危険性を最小限にすることが重要です。ウシ胎児血清およびフィーダー細胞は、多能性幹細胞培養のために必須であったが、リスクを軽減するために、培養システムから削除することが好ましいです。予測不可能な病原性の。これに対処するために、我々は、未定義の病原体へのiPS細胞を曝露する危険性を低減するためにセンダイウイルスを用いて、ヒト末梢T細胞からiPS細胞を生成するためのプロトコルを確立しました。センダイウイルスを処理することは、適切なバイオセーフティーレベルと機器が必要ですが、センダイウイルスに感染はゲノム挿入せずに、まだ高効率でT細胞を活性化しました。このプロトコルでは、我々は、活性化T細胞培養およびセンダイウイルスの組み合わせを使用して無フィーダー条件でヒト末梢T細胞からのiPS細胞の生成を実証します。

概要

性IPSCは、再生医療^1-3のための細胞の画期的な供給源として大きな注目を集めています。現在までに、iPS細胞を生成するための多様な方法が^4,5報告されています。これらの中でも、ヒトT細胞から生成されたiPS細胞のための細胞採取^6~8の低侵襲法の特に注目されています。さらに、T細胞由来のiPS細胞は、T細胞受容体（TCR）遺伝子の再配列を含み、したがって抗原特異的T細胞^9,10の源です。そのため、安全性T細胞由来のiPS細胞を生成する再生医療の進展のために有用です。

この方法は、予測不可能な病原性の危険性を減少させるという概念に基づいています。性IPSCの安全な臨床応用のためには、病原体¹¹への暴露の危険性を低減することが重要です。以前に多能性幹細胞の多くの培養系において、ウシ胎児血清およびフィーダー細胞を、必須の試薬として使用されています^12秒 。 iPS細胞の生成は、予測不可能な病原性の危険性を低減するが、培養系からのこれらの試薬の両方を除去することが好ましいです。

さらに、この方法は、患者からの浸潤性細胞のサンプリングおよびフィーダー細胞の面倒な準備を回避するという利点を有します。 T細胞由来のiPS細胞は、既に疾患研究^13,14に首尾よく使用されているため、この方法も適用可能であり、患者の疾患特異的iPS細胞を生成するために有用です。

遺伝子車両としてセンダイウイルス（SeVの）ベクターを用いて、T細胞の再プログラミング方法の中でも、高効率^7,16でiPS細胞を生成することができる方法です。センダイウイルスは、一本鎖RNAウイルスであり、複製のためのDNAの相を必要としないため、また、iPS細胞の生成におけるその使用は、宿主ゲノム^{17-19を破壊}が回避されます。したがって、我々は血清FRにおけるヒト末梢T細胞からiPS細胞を生成するためのプロトコルを確立していますEEおよびマトリゲル、mTeSR媒体の組み合わせを使用して無フィーダー条件、およびセンダイウイルスベクターです。

プロトコル

1.活性化されたヒトT細胞を準備します

1. 10ミリリットルを静脈穿刺によってドナーからのヘパリン化全血を採取します。
   1. 静脈穿刺の前にドナーのインフォームドコンセントを取得します。静脈穿刺は、資格や訓練を受けた者が行う必要があります。
   2. 滅菌装置と、次の適切なバイオセーフティ指針に得られた血液サンプルを処理します。
2. 10 mlのD-PBSを用いて全血10 mlのヘパリンを希釈（ - ）。
3. 新しい50mlのコニカルチューブに15ミリリットルフィコール溶液（フィコール・パックプレミアム）を置きます。
4. ステップ1.3でフィコール液にステップ1.2で作製した20 mlの血液溶液をレイヤ。電動ピペットを用いて、血液溶液は、管の内壁に沿ってゆっくりとステップ1.2の実行を準備しましょう​​。血液溶液とフィコール溶液を混合しないように注意してください。
5. 室温で30分間、400×gで遠心分離します。 「遅い」遠心減速度を設定します。
   注：遠心分離した後、白い薄いです層は、上部乳白色の血漿層と下部透明なフィコール層との間に現れます。このホワイト薄い層は、単核細胞が含まれています。
6. 1 mlのピ​​ペットを用いて新しい50mlのコニカルチューブに、単核細胞層を転送します。フィコール液を含まないように注意してください。
7. 10ミリリットルの合計体積に単核細胞に、そして室温で5分間、200×gで遠心分離（ - ）D-PBSを追加します。
8. 上清を捨てます。単核細胞に、そして室温で5分間、200×gで遠心分離（ - ）のD-PBS 10ミリリットルを追加します。
9. 、上清を捨て、収集した単核細胞にKBM502培地1mlを追加し、血球計数器を用いて細胞数を計測します。 ^6×10 5以上の単核細胞を、フィコールを用いて適切な分離と全血をヘパリンmlの10から得ることができます。
10. D-PBS中10μg/ mlの濃度の抗ヒトCD3抗体溶液を調製します（ - ）。サーフソーク、6ウェルプレートに、抗ヒトCD3抗体溶液を加えます各ウェルのエース、少なくとも30分間、5％CO _{2インキュベーター}中、37℃で皿をインキュベートします。
11. 各ウェルからの抗ヒトCD3抗体溶液を除去し、D-PBSで1回洗浄（ - ）細胞を播種する直前に。
12. KBM502培地中の抗ヒトCD3抗体でコーティングした6ウェルプレートに2.5×10 ⁵細胞/ cm ²の密度で、ステップ1.9で調製した種単核細胞。 T細胞がコンフルエントに達するまで、培地交換せずに3-7日、5％-CO ₂インキュベーター内で37℃でインキュベートします。この期間中のT細胞が両方懸濁し、接着細胞です。

センダイウイルスベクターを用い2.感染ヒトT細胞

1. 3-7日の培養後、ピペッティングすることによって、既存の媒体と活性化T細胞を収集します。室温で5分間、200×gで15 mlのコニカルチューブと遠心分離機にそれらを転送します。
2. 上清を除去し、1mlの新鮮なKBM502媒体を追加します。細胞とプレート1をカウントします。5×10 ⁶細胞を、抗CD3抗体でコーティングした6ウェルプレートの各ウェルに（2 mlの新鮮な培地でKBM502）。
3. 氷の上に、OCT3 / 4-たSeV /TSΔF、SOX2-たSeV /TSΔF、KLF4-たSeV /TSΔF、およびc-MYC（HNL）-sev /TS15ΔFのセンダイウイルスソリューションを解凍します。
4. -sev /TS15ΔFは、感染の多重度（MOI）の各ウェルに個別にSOX2-たSeV /TSΔF、KLF4-たSeV /TSΔF、およびc-MYC（HNL）、OCT3 / 4のSeV /TSΔFを含むセンダイウイルスソリューションを追加します。さらに24時間、5％-CO ₂インキュベーター内で37℃で10インキュベートの。

3.ヒトT細胞からのSeVベクターを削除します

1. 24時間感染後、ピペットを用いて感染した細胞を収集します。接着細胞が存在する場合、それらは容易に繰り返して上下にピペッティングして取り外すことができます。 15mlのコニカルチューブにそれらを移し、室温で5分間、200×gで遠心します。
2. センダイウイルスベクターを含む上清を除去し、2ミリリットル新鮮なKBM502媒体を追加します。 EACで細胞をReplate井戸の時間。さらに24時間、5％-CO ₂インキュベーター中、37℃でインキュベートします。

4.マトリゲル層上の細胞を再播種

1. 4℃で（この研究で使用される特定のブランドのための材料のリストを参照）マトリックスゲルを解凍し、DMEM / F12培地10mlの0.2 mlで溶解することにより基底膜マトリックス溶液を調製します。
   注：マトリックスゲルは、（本研究で用いた特定のブランドのための材料リストを参照してください）​​完全に解凍されるように、4℃でO / Nを解凍する必要があります。使用直前まで氷上で保管してください。
2. 100-mmディッシュにディッシュ当たりプレート5 mlの基底膜マトリックス溶液と、細胞を播種する前に、少なくとも30分間室温で残します。少なくとも二つの100mm皿を一つの実験に必要とされます。
3. ピペッティングによりセンダイウイルス感染細胞を回収し、15mlのコニカルチューブに転送し、室温で5分間、200×gで遠心します。
4. 上清を除去し、1mlの新鮮なKBM502媒体を追加します。 CEの数を数えます血球計数器を使用してLLSは、100 mmの基底膜マトリックス被覆に100 mmのステップ4.2で作製した料理やプレート1×10 ^{5〜1×10 6}細胞（10ml中の新鮮なmTeSR媒体）から基底膜マトリックス溶液を除去料理。最後に、コロニーは簡単にピックアップされたプレートを使用しています。
5. 5％-CO ₂インキュベーターO / Nで37℃で皿をインキュベートします。
6. 一日おきにmTeSR媒体を肉mlの10に培地を変更します。
   注：約20〜30日、感染後、密接に胚性幹細胞（ESC）の似ているコロニーが表示されます。

5. T細胞由来のiPS細胞を展開

1. 4℃で（この研究で使用される特定のブランドのための材料のリストを参照）マトリックスゲルを解凍し、DMEM / F12培地10mlの0.2 mlで溶解することにより基底膜マトリックス溶液を調製します。
2. プレート1 6ウェルプレート中でウェルあたり基底膜マトリックス溶液のミリリットルとで室温で残しますコロニーを選ぶ前に少なくとも30分。
3. ウェルあたりmTeSR培地20μlを96ウェルプレートを埋めます。
4. 20μlのピペットを用いて実体顕微鏡下のESCに似たコロニーを選択します。
   注： 図1（b）に示すように、ESCのと性IPSCのコロニーをラウンドとフラットです。
5. 転送は、ステップ5.3でmTeSR媒体で満たされた96ウェルプレートにコロニーを選択しました。
6. 200μlのピペットを用いて実体顕微鏡下で小さな塊にコロニーを破壊するために上下にピペッティングし、慎重に各ウェルにmTeSRの培地200μlを加え、。 5.2によく準備から基底膜マトリックス溶液を除去し、ウェルあたりmTeSR培地2mlで基底膜マトリックスでコーティングした6ウェルプレートの1ウェルに各コロニーを置きます。
7. 一日おきにmTeSR媒体を肉mlの2にメディアを変更します。

6. T細胞由来のiPS細胞を維持

T細胞由来のiPS細胞を維持することができます人間性IPSCとヒトESCと同様の技術を使用して格納されています。 iPS細胞コロニーが成長したら、同じ手順を繰り返すことによって、より大きな皿にそれらを展開します。

1. 1〜2日ごとにmTeSR媒体を変更します。
2. コロニーは、細胞は、製造業者の説明書に従って、ヒトiPS細胞およびヒトESCの解離溶液を使用して、毎5~7日経過コンフルエントになったとき。

結果

このプロトコルを使用して、ユーザは安定したヒト末梢T細胞からiPS細胞を生成することができます。センダイウイルスおよびマトリゲルを有するT細胞からのiPS細胞の生成は、約0.002％を示した-いくつかのドナー例とのSeVの間での細胞のリプログラミングの効率の0.005％は、いくつかの通路¹⁶の後には検出されなかった。図1（a）は、T細胞由来を生成するためのプロトコルの概略図を示します。マトリゲルとmTeSR媒体を用いた無フィーダー条件で性IPSC。センダイウイルス感染後20〜30日の周りに、iPS細胞のコロニーをそれらのESCコロニー様形態（ 図1B）によって認識されます。免疫蛍光染色は、無フィーダー条件（ 図1C）の下で生成されたT細胞由来のiPS細胞に典型的な多能性細胞マーカー（NANOG、OCT3 / 4、SSEA4、TRA-1-60、およびTRA-1-81）の発現を明らかにしました。

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図1（A）：この研究では、フィーダーフリー条件下での再プログラミングT細胞のためのプロトコルの概略図。 （B）：典型的なESCのようなiPS細胞コロニーフィーダーフリーの条件下で採血後27日目に。 （C）：T細胞由来のiPS細胞でALP染色および多能性および表面マーカーの免疫蛍光染色（NANOG、OCT3 / 4、SSEA4、TRA-1-60、およびTRA-1-81）は、フィーダーを含まない条件下で生成してくださいこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

ディスカッション

マトリゲル、mTeSR培地、およびSeVベクターの組み合わせを使用して、無血清および無フィーダーの条件下でヒト末梢T細胞からiPS細胞を生成するためのプロトコルについて説明します。iPS細胞の臨床応用には、iPS細胞を安定的に生成するためのプロトコルと、低侵襲な細胞サンプリング方法が重要です。マトリゲルとmTeSR培地の組み合わせによるiPS細胞の生成は、ノックアウト血清置換(KSR)培地とフィーダー細胞を使用したものよりも低いリプログラミング効率を示しましたが、この組み合わせはドナーからのiPS細胞の安定した生成を達成します¹⁶。安定したiPS細胞生成と低侵襲細胞サンプリングには、iPS細胞生成のためのドナー数を増やすことができるという利点があります。

マイナス鎖RNAウイルスであるSeVベクターは、宿主ゲノムに組み込まれていません。したがって、腫瘍形成のリスクは、因子誘導^20〜24の再プログラミングの段階で回避することができる。さらに、フィーダー層の代わりに定義された培地とマトリゲルの組み合わせを使用するフィーダーフリー条件により、未知の外因性因子への曝露の潜在的なリスクを最小限に抑えることができます。これらの技術の融合により、再生医療に侵襲性が低く、より安全なiPS細胞技術が提供されます¹⁶。

このプロトコルの重要なステップは、ヒトT細胞を活性化するステップ(ステップ1)とSeVベクターで感染させるステップ(ステップ2)です。SeV感染後、最適な時期に培養皿中にESC様コロニーが得られない場合は、以下の点を考慮する必要があります。第一に、T細胞の最適な活性化がSeV感染に重要であるため、T細胞活性化前の単核細胞のコンフルエンスは適切ではない可能性があります^25,26。単核細胞の密度が高すぎると細胞死につながり、T細胞の適切な活性化が妨げられます。単核細胞の密度が低すぎると、T細胞の適切な活性化と増殖も妨げられます。したがって、単核細胞のコンフルエントをチェックし、それに応じて調整する必要があります。第二に、SeVベクターの投与量が十分ではない可能性があります。iPS細胞コロニーの誘導効率は、ウイルスの投与量に依存し^ます6。SeV感染後にESC様コロニーが観察されない場合は、ウイルス投与量を15〜20のMOIまで増やすオプションを検討する必要があります。iPS細胞コロニー分化の兆候が観察された場合、培地を交換する頻度は、1日おきに、またはコロニーが大きい場合は毎日に増やすことができます。

このプロトコルの制限は、この方法がウイルスフリーではないことです。細胞リプログラミング用のSeVは簡単に市販されていますが、ユーザーは適切なバイオセーフティレベルに従って機器を準備する必要があります。統合のないiPS細胞を生成する別の方法として、エピソームベクターはこれまで^27〜29まで使用されてきました。 エピソームベクターは、バイオセーフティのレベルが低い機器で使用できますが、エピソームベクターは極めて低い速度で宿主ゲノムに挿入される可能性があります。したがって、SeVを使用する場合と同様に、導入遺伝子の消失を確認するために追加のチェックが必要です。

この技術には動物由来の製品がまったく含まれていないという別の制限があります。マトリゲル、抗CD3 mAb、解離溶液、SeV溶液などの一部の基質は動物性食品に由来するため、異種病原体を移すリスクと関連しています。しかし、培養システム中の動物由来の基質の削減は、リスクが低いため、iPS細胞技術の臨床応用にとって意味があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Ficoll-Paque PREMIUM	GE Healthcare	17-5442-02
精製NA/LEマウス抗ヒトCD3	BD Pharmingen	555336
ウシアルブミン画分V溶液	Gibco	15260-037
mTeSR1 medium kit	STEM CELL	5850	使用前に室温で温めてください
解離溶液	ReproCELL	RCHETP002
D-PBS(–)	和光	045-29795
SeV ベクターキット CytoTune-iPS ver.1.0	DNAVEC	DV-0303c	氷上で解凍してから使用
100mm組織培養皿	ファルコン	353003
96ウェル組織培養プレート	ファルコン	353078
6ウェル組織培養プレート	ファルコン	353046
15 ml遠心分離機チューブ	Greiner Bio-One	188271
50 ml遠心分離チューブ	Greiner Bio-One	227261