マイクロポストアレイ上の簡単かつ正確なメカノプロファイリング

サマリー

は、接着細胞と微細構造基質との間の機械的相互作用を定量化するためのプロトコルです。これらの相互作用は、遊走、増殖、分化、アポトーシスなどの重要な細胞挙動と密接に関連しています。このプロトコルには、MechProfilerと呼ばれるオープンソースの画像解析ソフトウェアが用意されており、各マイクロポストの関与する力を決定できます。

要約

細胞培養基質は、統合された柔軟なマイクロポストにより、ユーザーは細胞とその周辺との間の機械的相互作用を研究することができます。特に、細胞と基質の相互作用が主な関心事です。今日、マイクロポストアレイは、過去10年間に発表された幅広いアプリケーションを備えた、十分に特性評価され確立された方法です。しかし、マイクロポストの製造には長く困難なプロセスがあり、マイクロポストと相互作用する細胞の画像を解析するための簡単にアクセスできるソフトウェアがないため、生物学者の間ではこの技術を適応させることに躊躇しているようです。

マイクロポストからの力の読み出しは驚くほど簡単です。マイクロポストは、セルがその先端に理想的に取り付けられたバネのように機能します。細胞は、サイズに応じて、その細胞骨格から1つまたは複数の焦点接着点を介してマイクロポストに力を加え、マイクロポストを偏向させます。たわみの量は、方向と大きさに加えられる力に直接相関します。細胞が覆うマイクロポストの数とポストの偏向パターンは特徴的であり、ポストあたりの力などの値や、細胞表現型の「メカノプロファイリング」を可能にする多くの生物学的に関連するパラメータの決定を可能にします。

ここでは、すぐに使用できる市販のマイクロポストの第一世代と、現在すべての研究者がアクセスできる社内開発のソフトウェアパッケージを組み合わせた、メカノプロファイリングの便利な方法について説明しています。典型的なアプリケーションのデモンストレーションとして、骨がん細胞の単一画像を明視野顕微鏡で撮影し、転移の細胞株モデルのメカノプロファイリングを行いました。この商用牽引力センサーと解析用のオープンソースソフトウェアの組み合わせにより、専門家でないユーザーが行う日常的なラボ作業にマイクロポストアレイ技術を迅速に実装することが初めて可能になりました。さらに、堅牢で合理化された解析プロセスにより、ユーザーは大量のマイクロポスト画像を非常に時間効率の良い方法で解析することができます。

概要

メカノ敏感な細胞ベースのアッセイは、メカニックが細胞生物学でプレーすることができます中心的な役割を反映して、幅広いアプリケーションで、接着細胞を調査することを可能にします。これらのアプリケーションは、多くの場合、細胞内プロセスまたは全細胞の挙動を駆動機序に焦点を当てています。一方、このような細胞外マトリックス組成物またはマトリックスの剛性などの外部環境要因が劇的に細胞の機械的および生物学的応答に影響を与えることができる^。1同様の薬学的に活性な化合物の多くのクラスの使用後に観察することが可能である効果がそれらの多くの場合、細胞培養モデルを用いて特徴づけ、そのような自発的または実験的に誘導され、遺伝子の突然変異によって引き起こされるもののような一方の遺伝子型の性質上^2を 、細胞骨格の構造および機能の変化と関連している細胞の表現型の著しい変化を誘導することができる^。3これらの実施例は、あります多くの可能なのほんの一部トピックれる細胞の機械的な表現型が関連しており、これらの全てが有用マイクロポストのアレイで検討されています。

この記事の執筆時点では、約200の記事は、細胞マイクロポストの相互作用を記述する公開されています。これらの作品は、マイクロポスト偏向原則の理論的側面だけでなく、その製造上の実際的な手順について説明します。細胞や柔軟なマイクロポストアレイの相互作用を記述した最初の記事は、連続する軟質基板はnanon....

プロトコル

マイクロポストアレイ上の1細胞を培養します

注：すべての手順は、無菌性を確保するために、バイオセーフティキャビネット内で実行する必要があります。ここで指定したボリュームは、T25細胞培養フラスコのためのものです。細胞培養培地レシピ及び細胞播種密度は、骨癌細胞株HuO9およびM132のために最適化されます。

1. マイクロポストアレイ上に播種するための細胞培養を準備します。
   1. 標準光顕微鏡で培養フラスコを配置することによって、細胞培養の品質を検査します。細胞がカバーされているどのくらいの培養フラスコの底部の推定し、典型的な成長と形態を示していることを確認してください。 70％-80％のカバレッジが健全な成長率を反映しています。彼らは死んだ細胞および/または過成長文化を表すとして、浮遊細胞の量に注意してください。
   2. 4ミリリットル1×リン酸を含む培地と洗浄を除去することにより、トリプシン処理細胞を、生理食塩水（PBS）のバッファをバッファリング。 0.8ミリリットル1×トリプシン/エチレンジアミン四酢酸（EDTA）を追加し、セルまで室温でインキュベートSは約2〜4分をとる、取り除きます。顕微鏡でプロセスを確認し、時折脱落をサポートするために、静かにフラスコをタップします。
   3. 5 mlの細胞培養培地（ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、10％ウシ胎児血清（FBSと/ F12）、1％ペニシリン/ストレプトアビジン（ペニ....

結果

記載された技術の主な利点は、通常の実験室の作業に迅速かつ効果的な統合のためのシンプルさと可能性にあります。オープンソースソフトウェアと対になって高品質の商用センサアレイの組み合わせは、そうでなければ、クリーンルーム施設や画像解析やソフトウェア開発についての深い知識へのアクセスを必要とするであろう。 図1は、提示された方法のワークフローを示してメカノ感度に関する情報を提供します。これは、マイクロポストアレイ上に細胞を調製し、播種から始まります。細胞を固定し、染色した後、マイクロポストアレイは、イメージングのための準備ができています。技術の中心部はMechProfilerソフトウェアを用いた画像解析です。ユーザーがすぐにGUIの「設定」に関連するすべてのパラメータを入力した後に画像をanalyszng開始することができます。対応する画素のサイズは単一のピクセルによって表される、ユーザの設定に依存されている長さです。それは必要既知のサイズの対象物の画像を撮影して、各使用拡大のために別々に確立することができます。例は補足図9に示されています。

ディスカッション

この作品は、実質的にエントリへの技術的、実用的な障壁を下げることによって牽引力顕微鏡の分野を進めることを目指しています。これらの障壁は、二つの側面から来ます。まず第一に再現可能に製造し、実験的にマイクロポストの配列を委託するために克服しなければならない多数の非自明な技術的課題があります。典型的な実験は、細胞の数百または数千もの分析を必要とするかもしれないことを念頭において - 第二に、単一細胞の力の信頼性の半自動分析のため、同様に非自明な必要性です。上記の技術は、常駐エンジニアリングの専門知識を持っていない細胞生物学研究所内のマイクロポストベースの牽引力顕微鏡にアクセスできるように開発されました。この記事で紹介したセンサーや分析技術は、非専門家が容易にかつ正確に、単一細胞によって及ぼされる力を分析できるようにする必要があります。

別に細胞生物学のLへのアクセスから少なくとも半ばグレード明視野顕微鏡でABは、記載の方法は、いくつかの追加の技術要素を必要とします。ここでは、ほとんどのユーザーは、技術のパワーと汎用性にもかかわらず、あっても限られた経験を持つ有効な牽引力顕微.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
T25細胞培養フラスコ	Nunc	156367
1x PBSバッファー		Sigma D8537
0.5% トリプシン-EDTA	Life Technologies	15400054
中型 DMEM/F12	Sigma	D8437
FBS South America	Life Technologies	10270106
ペニシリン-ストレプトマイシン 100x	Sigma	P4333
15 ml遠心分離機バイアル	Sarstedt	62.554.502
コラーゲンI/フィブロネクチン	MicroDuits	MPA-col1/FN	ポストアレイ マイクロポスト寸法: Ø=6.4 &マイクロ;m、l = 18.2 µm;グリッド=13 µm, kcorr=2.87 nN/µm
エタノールABS p.A.	メルク	100.983
12 ウェル プレート	Nunc	150628
ホルマリン溶液、中性緩衝 10%	シグマ	HT5011
ブリリアント ブルー G-250	シグマ	27815	クーマシー
ブルー メタノール ACS p.A.	メルク	1.06009
酢酸	シグマ	695092
ガラス底皿	WillCoウェルズBV	GWSb-3522	35 mm直径、開口部22 mm
T-100 エクリプス	ニコン	n/a	倒立顕微鏡
D3-L3	ニコン	n/a	カメラコントローラー
DS Fi2	ニコン		カメラ

でプレコートされたマイクロ