栄養細胞の標的溶解によって環境サンプルからの内生胞子の物理的な分離

サマリー

このグループの細菌の培養または分子研究を行うために、複雑な微生物群集から細菌の内胞子を選別する方法が開発されました。

要約

内胞子形成は、フィルミキューテス門の一部の細菌に見られる生存戦略です。内胞子の形成中、これらの細菌は形態生理学的休止状態に入り、悪環境条件下での生存を促進します。内胞子形成細菌群は、培養研究において最も頻繁に濃縮され単離される細菌群の1つですが、分子的手法に基づく多様性研究には含まれていないことがよくあります。胞子コアの抵抗性は、内乳子からのDNAの回収を制限する要因の1つと考えられています。私たちは、物理的、酵素的、化学的溶解法を使用して、内乳子の高抵抗性を利用して、複雑な微生物群集内の他の細胞から内乳子を分離する方法を開発しました。このようにして得られたエンドスポアのみの調製物は、再培養に使用したり、エンドスポアに最適化されたテーラードDNA抽出やその後のDNAシーケンシングなどの下流分析を行うために使用することができる。この方法を堆積物サンプルに適用することで、内胞子の濃縮が可能になり、シーケンシング後、淡水湖の堆積物中に多種多様な内胞子形成物質が明らかになりました。この方法を他のサンプルに適用しても、同様の結果が得られると期待しています。

概要

この研究の目的は、環境試料中の栄養細菌細胞からの細菌の内生胞子を分離するためのプロトコルを提供することにあります。細菌内生胞子の形成は、門ファーミキューテス^{1に属する}細菌群の数で見つかった生き残り戦略、通常は飢餓によって誘発されます。内生胞子形成細菌はよく株の数は、病原体であり、したがって、医療の重要性（例えば、 炭疽菌またはクロストリジウム・ディフィシル ）主な理由は、研究されています。内生胞子形成細菌の環境株は、ほぼすべての環境（土壌、水、底質、大気、氷、人間の腸、動物の腸、およびそれ以上^）1-3から単離されています。したがって、ファーミキューテスは、培養コレクション⁴における第二の最も豊富な門です。

そのため、それらの丈夫な外皮質および保護コアタンパク質の、内生胞子は、FRの範囲の極端な環境条件に耐えることができます高い放射線、極端な温度や有害な化学物質^から5 OM乾燥。この驚くべき抵抗は内生胞子^6-8からDNAを抽出することが課題になります。彼らは環境配列決定研究^9,10に見過ごされてきた理由はここにありそう説明しています。例えば、蛍光抗体¹¹により環境試料中の内生胞子のターゲティングのような他の方法、土壌¹²と底質¹³でジピコリン酸の定量（DPA）は^、14フローサイトメトリーまたは低温殺菌し、その後の栽培^15,16で内生胞子を取得または定量化するために使用されています環境サンプル。近年では、最適化されたDNA抽出法と同様に、特定の分子的プライマー内生胞子特異的遺伝子配列を標的にする^10,17-20を開発されています。これは、細菌²¹のこのグループの中でより多くの生物多様性を明らかにすることができましたし、また内生胞子の検出のための産業や医療への応用につながっています、粉乳¹⁹で例えば。

ここで紹介するプロトコルは、栄養細胞からの相対細菌内生胞子の（例えば、熱や洗剤など）の有害な物理化学的条件に対する抵抗の差に基づいています。サンプル中の栄養細胞を破壊するために、我々は連続的に熱、リゾチーム及び界面活性剤の低濃度を適用します。これらの治療の時間と強度は胞子を破壊するが、すべての栄養細胞を溶解しないように最適化されています。環境セル・プール内のいくつかの細胞は他のものより耐性があるので、すべての栄養細胞を破壊する可能性を高めるために、我々は、3つの異なる治療法を適用します。この方法の利点および新規性は、処置後の内生胞子はまだ無傷であり、さらなる下流の分析のために使用することができることです。これらは、DNA抽出、定量PCR（定量PCR）、およびアンプリコンまたはメタゲノムシーケンシング（具体的には内生胞子のグループをターゲットとするため、Dを減らすことが含まれますiversity、）カバレッジ向上させながら。内生胞子はまた、蛍光顕微鏡、フローサイトメトリー、またはDPAの検出によって下流培養または定量化のために使用することができます。この方法の重要な特徴は、処理された試料と未処理試料と比較することにより、一つの細胞を栄養に対応する構成要素に加えて、環境試料中の内生胞子の数と多様性を推定することができることです。

プロトコル

化学物質や機器の作製

1. 1％のヘキサメタリン酸ナトリウム（SHMP）（のNaPO _3）nは溶液500mlを加えて、オートクレーブで滅菌します。
2. 密閉ガラスペトリ皿で​​オートクレーブ処理により滅菌ニトロセルロース（NC）フィルター（孔径0.22ミクロン、直径47ミリメートル）。
3. 密閉ガラスシャーレでオートクレーブによりNCフィルター（孔径0.22ミクロン、直径25ミリメートル）を滅菌します。
4. 滅菌50mlチューブ（キャップ​​付き）（サンプルあたり1チューブ）の空の重量を計量し、注意してください。
5. トリスEDTA緩衝液（TE緩衝液）1Xを準備：10 mMトリス（ トリス （ヒドロキシメチル）アミノメタン）および1mM EDTA緩衝液の溶液を作ります。 pHを8に調整し、オートクレーブで滅菌します。
6. 1ミリリットルのTE緩衝液中のリゾチーム0.02グラムを溶解することによりリゾチーム溶液（20 mg / mlの）を準備します。理想的には、毎回新鮮にします。わずか1週間4℃で保存してください。
7. 8グラム/ Lの塩化ナトリウムを溶解して生理学的溶液を調製します蒸留水に塩化ナトリウム（NaCl）。オートクレーブで滅菌します。

土砂からのバイオマスの2分離

1. 予め計量する堆積物試料3gのエタノール燃え上がっ金属スクープを使用して滅菌した50ミリリットルチューブを追加します。汚染を避けるためにきれいな、紫外線滅菌生物学的安全キャビネットの中でこれを実行します。
2. ビュレットを卒業し、滅菌を使用したサンプルの1％（オートクレーブ処理）滅菌SHMP溶液15mlを追加します。 SHMP溶液は、汚染を避けるために濾過することができます。
3. 液体分散機/ホモジナイザー（例えば、ウルトラタラックスホモジナイザー）と堆積物とSHMP液を均質化します。 70％エタノール、滅菌または使用前に分散ローターオートクレーブ。 17,500 rpmで1分間均質化を実行します。 2分間のサンプル残りをしようと、同じローター速度で1分間均質化を繰り返します。
4. サンプルは10分間放置してみましょう。このステップでは、最も重い粒子（ミネラル）が沈降します。細胞サンプルの任意の有機成分がW病気の溶液中に残ります。堆積物ペレットを乱さないように注意しながらその後、清潔な50mlのチューブに（細胞バイオマスを含む）上澄み液を移します。
5. 堆積物ペレットに滅菌を使用して再度1％（オートクレーブ処理）滅菌SHMP溶液15mlを加えビュレットを卒業。そして、ステップ2.3と2.4を繰り返します。この繰り返しは、堆積物の鉱物成分から細胞や有機粒子の最大量の分離を保証します。この第二の分離の上清を第一の分離からの上清とマージすることができます。
   注意：次の手順は、すべての（細胞バイオマスを含む）上清に行われます。ミネラル成分（堆積物のペレット）を廃棄することができます。
6. 1分間20×gでサンプルを遠心。生物細胞材料がまだ溶液中に残っている間このステップでは、小さな鉱物粒子を解決するのに十分な遠心力が増加します。遠心分離した後、へ（細胞バイオマスを含む）上澄み液を移します清潔な50mlのチューブ。ミネラルペレットを捨てます。
7. サンプルを計量することにより、バイオマスを含有する溶液の最終容量を決定します。重量決意をメスシリンダーに試料を移送する必要が回避され、汚染の危険性を減少させます。

フィルター膜上のバイオマスの3コレクション

1. 濾過ユニット（直径47mm膜用）と真空ポンプを準備します。 70％エタノールでそれを噴霧し、ブンゼンバーナーでそれを炎によって、オートクレーブまたは（パイレックスガラス場合）のいずれか濾過ユニットを滅菌します。それはプロトコルを続行する前に、冷ましてみましょう。
2. エタノール燃え上がっ滅菌ピンセットを用いて濾過ユニットに無菌NC膜を追加します。
3. 膜濾過ユニットに（ステップ2.6）からの上清サンプルの半分を加え、真空ポンプを用いて膜上の細胞を収集します。
4. 液体が完全にフィルタを通過したときに、真空ポンプを停止し、慎重にエタンを用いて膜を除去しますOL-炎が鉗子を滅菌しました。滅菌ペトリ皿に膜を置きます。
   1. エタノール燃え上がっ滅菌はさみを使用して半分に膜をカットします。独立した2ミリリットルチューブに膜の各半分を追加します。膜の半分は、全細菌群集のDNA抽出および分析のために使用されます。フィルタの他の半分は、-80℃で保存し、バックアップとして機能します。
5. 濾過ユニットに新しいNC膜を配置し、真空ポンプを用いて（ステップ2.6から）のサンプル容量の後半からのバイオマスを収集します。
6. 液体が完全にフィルターを通過した場合には、真空ポンプを停止し、慎重にエタノール燃え上がっ滅菌ピンセットを用いて膜を除去します。独立した2ミリリットルチューブに膜全体を置きます。このサンプルは、栄養細胞からの内生胞子を分離するために治療のために使用されます。サンプルは使用するまで-20℃で保存することができます。

栄養細胞の溶解4.

1. 実行治療は、以前にNC膜（ステップ3.6）に収集されたバイオマスに栄養細胞から内生胞子を分離します。
   1. 膜が凍結した場合は、解凍し、室温で10分間そのままにしておきます。その後、滅菌ペトリ皿に膜を配置し、エタノール - 燃え上がっ滅菌はさみを使用して小片に（約4倍）、それをカット。その後、無菌の2mlチューブにすべてのメンブレンフィルター片を配置します。
2. サンプル膜を含むチューブに1×TE（トリスEDTA）バッファー（1.5参照）900μlを添加して、ボルテックスでよく混ぜます。このステップでは、バイオマスは、TEバッファー溶液中に膜から除去されます。
3. 10分、80 rpmで65℃のインキュベーター内でチューブを置きます。その後インキュベーターからチューブを取り外し、それを15分間クールダウンしましょう​​。
4. 2 mg / mlの最終濃度に到達するために新たに調製されたリゾチーム（1.5を参照）の100μLを加えます。サンプルは37℃に冷却する前に、これはDEG可能性として、リゾチームを追加しないでください酵素をRADE。
5. リゾチームの最適条件は、栄養細胞を溶解し、60分、80 rpmで37℃でサンプルをインキュベートします。
6. 溶解が完了した後、3 N水酸化ナトリウム（NaOH）及び6％のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）試料溶液の250μLを250μLを加えます。これを追加することにより、サンプル容量を1.5mlに到達し、0.5 N NaOHを最終濃度1％SDSの最終濃度があります。
7. 60分、80 rpmで室温で、このミックスをインキュベートします。ベースと洗剤を追加すると、最終的な細胞溶解に役立ちます。内生胞子に害を与えないよう栄養細胞を溶解しながら、これらの界面活性剤の濃度は、最適化されています。
8. （パイレックスガラスがあれば）70％エタノールでそれを噴霧し、ブンゼンバーナーでそれを炎オートクレーブ処理により直径25mmの膜を保持している、または滅菌濾過ユニットを準備します。それがクールダウンしましょう​​。
9. エタノール炎滅菌ピンセットを用いて濾過ユニットに0.2μmのNC膜（直径25mm）を配置します。
10. 膜上にステップ4.7からのサンプルを追加し、真空ポンプを用いて液体をフィルタリングします。液体が通過した場合には、真空ポンプをオフにします。それは、膜上に保持されないように、この段階で、溶解した栄養細胞物質が除去されます。唯一の内生胞子は、メンブレン上に残ります。
11. 残留洗剤を洗い流し、真空ポンプを用いて液体をフィルタリングするために滅菌生理溶液2mlを追加します。
12. 液体が完全にフィルタ処理した場合には、真空ポンプをオフにします。濾過ユニットの膜を残します。

5. DNアーゼ処理

注：フィルター膜に直接DNase処理を実行します。これは、濾過ユニットが漏れず、真空ポンプがオフにされることが重要です。

1. フィルター膜上に直接滅菌水450μlを、DNアーゼ反応緩衝液（1×）、50μlの0.5μlのDNアーゼ酵素を追加し、15分間放置しました。可能な場合は、少し戦争である部屋で、この消化を行います平均室温よりもマー、酵素は、上記の25°Cの温度でうまく動作するので。
   注：ブンゼンバーナーを維持することはさておき、濾過ユニットは、温度を上昇させると、無菌環境を維持するという利点を有し、したがって、サンプルの汚染の危険性を減少させました。
2. DNase消化が完了したら、サンプルから酵素を除去するために真空ポンプをオンにします。
3. 追加および生理溶液1mlをフィルタリングすることにより、残留酵素を洗い流します。
4. 液体が完全に通過した場合には、真空ポンプの電源をオフにし、滅菌ピンセットを用いて内生胞子を含むフィルター膜を除去し、滅菌ペトリ皿にそれを置きます。
   注：分離内生胞子のサンプルは現在、下流の分析のための準備ができています。発芽および栽培に使用した場合、-20℃で保存は、DNA抽出のためにまたは代替的に、4℃で使用した場合。

結果

ここに示された結果は、以前の^10,21公開されています。データの環境解釈と議論のためにそれらの記事を参照してください。

全体的な手順を図1にまとめ、三つの主要なステップに対応されます。最初、堆積物からのバイオマスの分離または他の環境マトリックス;第二に、栄養細胞の破壊;そして第三に、分離内生胞子の下流分析。下流の分析は、例えば、DNA抽出及び多様性を決定するために、アンプリコンの配列決定により、構成することができ。 DNA抽出は、内生胞子の溶解を保証するように最適化する必要があります。堆積物の試料では、強力なシーケンシャルDNA抽出法^{10を用いて}これを達成しています。堆積物中の方法の適用は、分離後の内生胞子形成ファーミキューテスの割合の有意な増加を示しています。 16S rRNAのアンプリコン配列決定における遺伝子、未処理試料中のファーミキューテス（コミュニティ全体が）のみに8.0とシーケンスの19.0パーセント（ 表1）を対応しました。...

ディスカッション

外部積極的な物理化学的要因（例えば、温度や洗剤）の内生胞子の抵抗は環境試料中の栄養細胞から細菌内生胞子を分離する方法を考案するために使用されました。これは、非破壊的な方法で環境サンプルから内生胞子を単離するための最初の包括的方法です。サンプル中の内生胞子を、定量検出または分析する従来の方法は、ジピコリン酸または特定のマーカー遺伝子として内生胞子のための特定のプロキシの測定に基づいていました。これとは対照的に、ここで紹介するプロトコルで、内生胞子以外の試料成分が除去され、そのように内生胞子は、最終的には、サンプルの唯一かつ精製された名残として残っています。例えば、低温殺菌または密度勾配遠心分離などの他の方法は、内生胞子²²を濃縮するために提案されているが、我々のテストでは、密度勾配遠心分離は、環境試料のための一般的な方法としては適切ではないことを示しました生理的差異及び内生胞子形成剤（データは示していない）の様々な種の異なる密度に起因します。対照的に、我々のプロトコルは、容易に環境試料の全てのタイプに適用され、分子的方法または培養などの下流の用途に適していることができます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Whatmanニトロセルロースメンブレンフィルター、0.2 μm孔径、直径47 mm	Sigma-Aldrich	WHA7182004 Aldrich
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン	Sigma-Aldrich	252859 Sigma-Aldrich	CAS 77-86-1
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884 Sigma-Aldrich	CAS  60-00-4
鶏卵白のリゾチーム	Sigma-Aldrich	62971フルーカ	粉末、CAS  12650-88-3
Ultra-Turrax ホモジナイザー T18 ベーシック	IKA	3720000
ガラスフィルターホルダー 47 mmメンブレン、パイレックスガラス	EMDミリポア	XX10 047 00
化学デューティ真空ポンプ	ミリポア	WP6122050	220 V / 50Hz
マニホールドサンプリングろ過25 mm膜ミリ	ポア	1225サンプリングマニホールド	ポリプロピレン
Dnaseニュー	イングランドバイオラボ	M0303S	Rnase
フリーNaOH	シグマアルドリッチ	S5881シグマアルドリッチ	CAS  1310-73-2
ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)	Sigma-Aldrich	L3771 Sigma
Whatmanニトロセルロースメンブレンフィルター、0.2 μm孔径、直径25mm	Sigma-Aldrich	WHA7182002 Aldrich