線維芽細胞の振る舞いは、さまざまな臨床実体の根底にありますが、それらは主にその固有の不均一性のために、特徴付けられていないままです。従来の線維芽細胞研究は、in vivoでの線維芽細胞の挙動をマスキングするin vitro操作に依存しています。ここでは、細胞培養を必要としないマウス皮膚線維芽細胞の単離のためのFACSベースのプロトコルについて説明します。
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この記事について
サマリー
要約
線維芽細胞は、細胞外マトリックスを分泌する責任原則細胞型であり、多くの臓器や組織の重要なコンポーネントです。線維芽細胞の生理学および病理学は、複数の器官における線維症、肥厚性瘢痕以下の火傷、虚血後の心機能の喪失、および癌間質の形成を含む臨床実体、のスペクトルを基礎となっています。しかし、線維芽細胞は、主として、その固有の不均一性、細胞の特徴付けが乏しいタイプ残ります。線維芽細胞の単離のための既存の方法は、深く細胞表現型と動作に影響を与える細胞培養の時間を要します。その結果、線維芽細胞の生物学を研究する多くの研究は 、in vitroでの操作に依存していると正確に生体内で線維芽細胞の挙動を捕捉しません。この問題を克服するために、我々はpreserviそれによって、細胞培養を必要とせず、成体マウスの背部皮膚からの線維芽細胞を単離するためのFACSベースのプロトコルを開発しました生理的な転写および各セルのプロテオミクスプロファイルをngの。特定の表面マーカーを発現する線維芽細胞の亜集団の事前選択または濃縮を回避し、この異機種全体で可能な限り包括的であることをむしろポジティブ選択戦略よりも-私たちの戦略は、系統陰性ゲート（林）を介して非間葉系統の排除を可能にしますセルタイプ。
概要
線維芽細胞は、しばしば、プラスチック基板に接着する紡錘状細胞と形態学的に定義されています。線維芽細胞は、胚および成体の臓器1における細胞外マトリックスの合成と改造を担当する原則細胞型です。線維芽細胞は、哺乳類の発生することが重要であり、各組織や臓器に存在する隣接セルの種類の動作に影響を与える細胞外環境に大きく貢献しています。
線維芽細胞はまた、膨大な臨床負担を引き起こす医学的条件の多様なセットの背後の主要な細胞型です。病理学的線維芽細胞の活性は、正常組織の機能を損ない、皮膚の創傷治癒、アテローム性動脈硬化症、全身性硬化症、および血管損傷2-5後のアテローム斑の形成後の組織及び（例えば肺や肝臓など）臓器線維症、瘢痕化が含まれます。特に、創傷治癒は、両方のは、急性および慢性的に、Dを含み、そのことを周囲の正常組織のようなどちらも似ているにも機能し、多様な病理学的状態全体でかなりの罹患率につながる瘢痕組織のeposition。損傷後、次に、構造ECM成分を分泌する細胞型に隣接パラクリン効果を発揮し、瘢痕組織6を堆積させることによって機械的安定性を復元する筋線維芽細胞への線維芽細胞の移行があります。
皮膚組織の発達時間全体の傷の修復の質と解剖学的部位との間に有意な変動が存在します。人生の最初の2つの学期では胎児が瘢痕化せずに治癒します。しかし、上と成人期を通じて第....
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プロトコル
このプロトコルは、実験動物管理のスタンフォード大学紛争処理パネルにより承認された方法に従います。
マウス真皮の1消化
- ケタミンを100mg / kgのキシラジン+ 20ミリグラム/ kgのアセプロマジン+ 3 10mg / kgの腹腔内注射による麻酔後に頸椎脱臼によりマウスを安楽死させます。
注意：様々な年齢や背景を使用することができます。 - 背部皮膚を剃ると毛を抜きます。約100,000個の細胞は、背側の皮膚の一片×100mmの60ミリメートルから単離することができます。
- 70％エタノールでマウスを水没し、乾燥さ清潔、無菌面に置きます。
- すぐに無菌解剖ハサミを使用して、背側マウスの皮膚を収穫。雌マウスでは、乳房組織を含めないようにしてください。
- 尾の付け根から開始して、10トンまでの皮膚のに鉗子を使用し、超筋膜面に沿って切開する前に、横方向のカットを行います。
- 収穫しながら、任意の皮下脂肪を含め慎重に避けます肌。任意の皮下脂肪のために採取した皮膚を調べ、慎重にメスの鈍いエッジを使用してそれを削り取ります。
- 氷上でPBS洗浄を5倍に続いてベタジンで収穫皮膚を洗い流します。
注：これは、汚染を回避することができる無菌の近くの皮膚を維持することが重要です。 - かみそりの刃を使用して、サンプル2-3ミリの作品との均一な....
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結果
このアプローチ（ 図1）の有効性は、我々の最近の刊行物27に詳細に検討することができる多くの方法で確認されました。これらは、ソートされた細胞と細胞塊の免疫細胞化学と新鮮にソートされた細胞の単一細胞の転写の分析が含まれます。線維芽細胞のソートではなく、直接、より正確文化に頼ることは、それらのインビボ表現型をキャプチャします。系統陰性枯渇のアプローチ（ 図2A）よりもむしろポジティブ選択法を使用すると、特定の部分母集団の事前選択を避けることができます。このアプローチの価値は、最近Rinkevich らによって実証された。27、以前に記載されていない真皮のレベルでCD26陽性の線維芽細胞の存在を同定します。
培養線維芽細胞の処理は、遺伝子発現の有意な変化をもたらすことを確認するために、我々は、未培養線維芽細胞を培養した線維芽細胞を比較するためにマイクロアレイを使用します。我々は培養線維芽細胞それは、二つの技術、本稿でよく知られた組織外植片のプロトコル28で詳述ライブ収穫プロトコルにより.......
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ディスカッション
この原稿に記載されているプロトコルは、亜集団のために選択するか、その後の分析の前に、細胞培養時間を必要とするいずれかの既存の方法に比較して、FACSベースの選別により、線維芽細胞を単離するための手段を提供しています。線維芽細胞のソートに皮膚の収穫からの所要時間は約6時間です。しかし、収穫に使用したマウスの数は、この推定値に影響を与えます。
プロトコルのいくつかの点は特に注意が必要です。最初は、分離プロセス中に消化し、遠心分離後に消化し、上清の上部の脂質層の除去の前に皮膚から脂肪を除去することによって脂肪細胞の汚染を制限しています。また、いくつかの脂質成分は、チューブのプラスチック壁に付着し、その後のペレット洗浄液を汚染する可能性があるように、細胞をペレット化した後、新鮮なチューブに変更することが有用であろう。第二の点は、表皮から真皮別々に細心の注意を必要とします表皮真皮境界部に沿って。表皮細胞を夾雑FACS枯渇戦略によって除去されるが、ここでは汚染を制限するための努力がまだなされるべきです。
このアプローチの限界は、現在の系統.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
この作品は（HPL）は、NIH助成金R01 GM087609、（MTL）は（HPL）にアンソニー・シュウ、NIHのグラントU01のHL099776に敬意を表しイングリッド・ライ、ビルシュウからの贈り物、Hagey研究所のための助成金によって部分的にサポートされていました小児再生医療とオーク財団（MTLに、GCGおよびHPL）。 GGWは医学のスタンフォードスクール、スタンフォード医学者研修プログラム、およびNIGMS訓練助成金GM07365によってサポートされていました。 ZNMは整形外科財団研究員助成とHageyファミリー基金によってサポートされていました。 MSHは再生医療のためのカリフォルニア工科大学（CIRM）臨床フェロー研修助成金TG2-01159、顎顔面外科学会（ASMS）/顎顔面外科財団（MSF）研究助成賞、および移植とティッシュ・エンジニアリングフェローシップ賞によってサポートされていました。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 外科用鉗子、 | ケントサイエンティフィック | INS650916 | |
| マイクロハサミ、 | ケントサイエンティフィ | ックINS600127 | |
| ポビドン、ヨウ素調製液 | 、ダイナレックス | 1415 | |
| ナイール(脱毛クリーム) | チャーチアンドドワイト社 | ||
| コラゲナーゼ IV | Gibco | 17104-019 | |
| エラスターゼ | Abcam | ab95133 | |
| DMEM | Life Technologies | A14430-01 | |
| ウシ胎児血清 | Gibco | 16000-044 | |
| 塩化アンモニウム - 塩化カリウム (ACK) 溶解バッファー | Gibco | A10492-01 | |
| 40 μm フィルター | フィッシャー サイエンティフィック | 08-771-1 | |
| 70 μm フィルター | フィッシャー サイエンティフィック | 08-771-2 | |
| 100 μm filters | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| CD31 | BioLegend | 102421 | |
| CD45 | BioLegend | 103125 | |
| Tie2 | BioLegend | 124005 | |
| Ter-119 | BioLegend | 116233 | |
| EpCAM (CD326) | eBioscience | 48-5791 | |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | |
| ヨウ化プロピジウム(PI生存率染色剤) | BioLegend | 421301 |
参考文献
- Sorrell, J. M., Caplan, A. I. Fibroblasts-a diverse population at the center of it all. International review of cell and molecular biology. 276, 161-214 (2009).
- Wynn, T. A. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis. The Journal of pathology.
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再版と許可
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