心臓細胞療法のメカニズムを研究するために定義されたヒューマン・エンジニア心臓組織の構築

Summary

この原稿は、表面マーカー発現と細胞選別を使用して、定義された人工心臓組織の作成について説明しています。次に、定義された組織をマルチティッシュバイオリアクターで使用して、心臓細胞療法のメカニズムを調査し、機能的でありながら制御されたヒト心臓のモデルシステムを提供できます。

Abstract

ヒト心臓組織工学は、3次元の天然ヒト心筋のバイオフィデリティを再現する新種特異的スクリーニングシステムの開発を通じて、治療発見に根本的な影響を与えることができます。また、生物学的な複雑さを制御し、組織の収縮機能の非破壊的な縦断的モニタリングを可能にします。当初、ヒト多能性幹細胞の指向性分化から得られた全細胞集団を用いてヒト人工心臓組織(hECT)が作製されましたが、これは通常、心筋細胞の収量が50%未満でした。しかし、ヒト心筋の信頼性の高い予測モデルを作成し、異細胞相互作用のメカニズムを解明するためには、人工組織の生物学的組成を正確に制御することが不可欠です。 >jove_content<この制限に対処するために、心臓表面マーカーSIRPαと線維芽細胞マーカーCD90の生細胞選別を利用して、これらの細胞タイプの比率がそれぞれ3:1の組織を作成し、それらを混合してコラーゲンベースのマトリックス溶液に添加します。したがって、結果として得られるhECTは、その細胞内マトリックス組成と細胞外マトリックス組成の両方で完全に定義されます。

ここでは、現在ヒトの臨床試験で使用されているヒト骨髄由来間葉系幹細胞(hMSC)の例を用いて、細胞治療における細胞間相互作用のメカニズムを理解するためのモデルシステムとして、定義されたhECTの構築について説明します。定義された組織組成は、hMSCが内因性心臓細胞タイプとどのように相互作用して組織機能を強化しているかを理解するために不可欠です。また、6つのhECTを同時に並行して培養し、選別後の細胞をより効率的に使用するバイオリアクターシステムについても記載されています。

Introduction

心臓組織工学は、より最近になって、両方のマウス心筋^1-6と、から作られた完全に機能する、鼓動組織、ヒト幹細胞由来の心筋細胞^7-12の結果を公表する複数のグループで、10年間で大きく前進しました。心臓組織工学の分野は、二つの主要な本質的に独立した目標によって駆動される：1）機能^4-6を改善することができない心臓に移植することができる外因性の移植片を開発します。及び2）生理学および疾患を研究するためのin vitroモデルの開発、または治療開発の^2,7のためのスクリーニングツールとしてします。

三次元（3-D）細胞培養物を、3-Dマトリックスは、従来の2次元単層細胞培養物よりも自然な心臓の微小環境を反映するように、次世代のスクリーニングツールを開発するために必須であると考えられます。実際に細胞生物学のいくつかの側面は、2次元対3次元培養^13,14根本的に異なっています。細胞外マトリックス、および細胞集団：さらに、操作心臓組織は完全に定義された成分から構成されています。細胞外マトリックス組成物（通常のフィブリン⁹またはコラーゲン^7,8,10）を厳密に制御しつつ、従来の操作されたヒト心臓組織のために、入力細胞組成物は、あまりの指向心臓分化の細胞の混合物全体で、定義されますか胚性幹細胞（ESC ^7,9）や人工多能性幹細胞（IPSC ^10,12）を組織に添加されます。特定の細胞株および使用する分化プロトコルの効率に応じて、心筋の得率（ すなわち 、ventricular-、atrial-、またはペースメーカーのような）、25％未満から90％以上に、特定の心筋細胞表現型の範囲とすることができますまたしても、非心筋細胞画分は^15,16非常に不均一であることで差別心臓メートルの成熟度を変更することができ、変化させることができます^17を yocytes。

最近の心臓組織工学作業は心臓レポーターヒト胚性幹細胞株⁸または細胞表面マーカー^18は、分化の心筋細胞成分を単離するために使用されるのいずれかで、細胞のインプット集団を制御しようとしています。唯一の心筋細胞で構成最初に組織が理想的であるように思われるが、これは実際にはそうではありません。心筋細胞の1：1の比率：線維芽細胞が最も高い単収縮力^8を生成^するのみ心筋細胞で構成hECTsは、いくつかのグループは、3を見つけることで、機能的な組織へと圧縮することができません。生細胞の選別のための表面マーカーを含む、様々な細胞の選択方法を用いることにより、定義された細胞集団でhECTsを作成することが可能です。非心臓マーカー間質細胞は、推定上の線維芽細胞マーカーCD90 ^19,20のように、しばらくの間利用可能であったが、心筋細胞の表面マーカーは、より困難でした特定する。 SIRPαは、人間の心筋細胞¹⁸のために同定された最初の心臓表面マーカー間にあったと心臓系統に高度に選択的であることが示されています。最近、我々は^、SIRPα+およびCD90のための二重ソートことを発見した^-細胞、線維芽細胞様の表現型（Josowitz、未発表の観察）を示すCD90 ⁺集団と、ほぼ純粋な心筋細胞が得られます。心筋細胞およびCD90 ⁺線維芽細胞^{- SIRPα+} / CD90の1組み合わせ：これらの収集した知見に基づき、本明細書中で我々は3を使用してhECTsを作成する方法を説明します。

完全に定義された人間の心臓組織を設計する能力は、堅牢なスクリーニングツールを作成するためだけでなく、新興の細胞および遺伝子に基づく心臓治療を研究するためのモデルシステムを開発するだけでなく、必要不可欠です。間葉系幹細胞（MSC）を含む細胞タイプを利用心不全、特に、多数の細胞療法^、21 、心臓幹細胞²²及び骨髄単核細胞を^23~25は 、臨床試験で試験されています。最初の結果の多くは^21,23,25を約 ​​束してきたが、最初の利点は、多くの場合、時間^26-29とともに減少します。同様の傾向が原因MSC補充に重要な機能的利益を表示するマウス操作心臓組織において報告されているが、利点は、長期培養¹中持続しません。サブ最適な性能を根底にある細胞治療を支配するメカニズムの限られた知識です。どのように治療用細胞それらの有益な影響だけでなく、筋細胞nonmyocyte相互作用の潜在的な負の影響を及ぼし、心不全の患者のために、最小限の副作用で、臨床的に有意かつ持続的な利益をもたらす改善された治療法の開発を可能にする。より深く理解

ここでは、interrogに定義されたhECTsの使用を記載しています細胞ベースの治療のメカニズムを食べました。制御された組織組成物は、心筋細胞の性能に影響を与える特定の因子を同定することが不可欠です。我々はラットECTS ¹で実証したように、直接目的の治療用細胞型（ 例えば 、MSCS）でhECTsを補完する、心筋細胞のパフォーマンスへの影響を明らかにすることができます。

次の多段階プロトコルは、マルチ組織バイオリアクターの製造に続いて、組織構造および機能分析の説明を結論、指向心臓幹細胞の分化から始まります。我々の実験は、NIH-承認H7ヒト胚性幹細胞（hESCの）ラインを使用して実行されます。しかし、次のプロトコルは、追加のhESCラインと同様の結果で三誘導多能性幹細胞（hiPSC）株を用いて試験されました。我々は、HECT製造における心筋細胞分化および成功効率は、特にfoは、細胞株に依存することができることを見出しました個々の患者由来のR hiPSCライン。このプロトコルに従うことにより、2個の6ウェルディッシュは、20日間分化さと十分な6定義された組織を作るために、ソートした後、約250万筋細胞を生み出す168万のhESC（ウェル当たり14万細胞）、の合計でメッキされています。

Protocol

注：HEPAろ過クラスII生物学的安全キャビネットを使用して、無菌状態のすべてのセルの操作を実行し、0.2μmのフィルターを介してそれらをフィルタリングすることにより、すべてのソリューションを殺菌。同じ無菌状態または層流フードのいずれかで組織の構築と機能のテストを実行します。

心臓分化のための準備でH7のhESCの1播種

1. （1日目）基底膜マトリックスの準備
   1. 4℃で一晩氷上でのhESC資格の基底膜マトリックスの150μlのアリコートを解凍します。
2. コー​​ティングしたプレート上のhESCの（日0-4）めっき
   1. 氷冷DMEM / F12の12ミリリットルに解凍したマトリックスを希釈し、よく混ぜます。
   2. 転送6ウェルの組織培養処理皿の各ウェルにDMEM / F12マトリックス溶液1ml。マトリックス缶コート2つの6ウェルプレートの各アリコート。
   3. 少なくとも1時間室温でコーティングしたプレートをインキュベートします。
      注：で我々の経験では、パラフィンで密封被覆された皿は、使用前に最大10日間、4℃でマトリックス溶液中に保存することができます。
   4. 約75％のコンフルエンスで、非酵素的解離試薬の6ミリリットルを使用して、10cmディッシュからH7ヒトES細胞を解離します。 5分後、穏やかに使い捨てセルスクレイパーを用いて培養表面から細胞を掻き取り、滅菌15mL遠心管に細胞懸濁液を移します。
   5. 幹細胞株の増殖のために（さらにヒトES細胞を解離する解離試薬の5.5ミリリットルを残して）15mlチューブから細胞を用いた解離溶液の0.5ミリリットルを取り外し、新しい滅菌15mlチューブに移します。
   6. 20℃で5分間、300×gで細胞を0.5mlのペレット。上清を除去し、穏やかに、新しい、コーティングされた、10cmの組織培養皿に移し、幹細胞株を維持するために37℃、5％CO _2を維持_する 1％ペニシリン-ストレプトマイシンを含有する多能性幹細胞培地8mlに再懸濁。
      注意：メディアの変更中に氷の上で多能性幹細胞のメディアを保管してください。
   7. 一方、解離溶液の残りの5.5ミリリットルに10mMのROCK阻害剤Y-27632の5.5μlを添加し、別の5〜10分間室温でインキュベートし続けています。静かに5ミリリットルの血清学的ピペットを用いて細胞を混ぜます。その後、室温で5分間、300×gで細胞をペレット化し、単一細胞懸濁液が得られるまでインキュベートし続けます。
   8. 多能性幹細胞培地5mlに細胞を再懸濁し、血球計数器を用いて細胞計数を行います。
   9. ウェルあたり14万細胞の密度で6ウェルディッシュの各ウェルをシード。 6定義された組織の合計を作成するために、2つの6ウェルプレートに播種します。めっき後、残りの細胞を処分。
   10. 多能性幹細胞培地でよく、1ミリリットル充填し、37℃、5％CO ₂でインキュベートします。 24時間後、培地を除去し、各ウェルに新鮮な多能性幹細胞培地の2ミリリットルを追加します（ 図1A ）。
   11. 毎日のプレートの合流点をチェックして、細胞が約75％コンフルエンス（ 図1B - D）に達すると分化を始めます。

2.（日4-24）心筋細胞^30,31へのヒト胚性幹細胞の分化

1. （日4-7、分化日0-3）中胚葉誘導
   1. 10ミリリットルのB27の（インスリンなし）サプリメントおよびペニシリン-ストレプトマイシン原液（;万/ mlのストレプトマイシン万IU / mlペニシリン）の5ミリリットルと500ミリリットルをRPMI 1640を組み合わせることにより、RPMIの分化培地I（ 表1）を準備します。小分けし、氷上で、50ミリリットルチューブと4℃でストアに。
   2. （4日目、分化0日）を各ウェルから多能性幹細胞のメディアを取り出してRPMI分化培地Iの12ミリリットルに小分子GSK3阻害剤CHIR99021（10 mMストック、6μM最終濃度）の2.4μLを添加することにより、中胚葉誘導培地を準備しますANDウェル当たり中胚葉誘導培地2mlで交換してください。インキュベーターにプレートを返します。
      注意：重要な細胞死は、典型的には、CHIR99021（ 図1E）の添加で発生します。単層は回復しますが、DMEM / F12リンスと死細胞を洗い流すことが重要です。
   3. 前述したように（5日目、分化1日目）、新鮮な中胚葉誘導培地を準備します。各ウェルから古いメディアを削除し、ウェルあたりDMEM / F12の1ミリリットルで一回すすいでください。各ウェルに新鮮な中胚葉誘導メディアの2ミリリットルを追加します。
      注：デイ0-10から毎日リンスすると、大幅に心筋細胞の収率および純度を向上させます。
   4. （6日目、分化2日目）は、心臓の誘導培地を取り出して、ウェルあたり1ミリリットルDMEM / F12で一回すすいでください。 2ミリリットルのRPMI分化培地でリンスを交換I（ない小分子が、それでもB27（インスリンなし）サプリメントで追加されません）、インキュベーターに戻します。
2. （日7-13、分化ダY 3-10）心臓中胚葉誘導
   1. （7日目、分化3日目）RPMI分化培地Iの12ミリリットルに小分子Wntシグナル阻害剤のIWR-1（最終10mMストック、5μM）の6μLを追加することによって、心臓中胚葉誘導培地を準備
   2. 各ウェルから培地を除去、ウェル当たり1ミリリットルDMEM / F12で一回洗浄し、ウェル当たりの心臓中胚葉誘導培地2mlで交換してください。
   3. 上記のように（8日、分化4日目）の心臓中胚葉誘導培地の追加の12ミリリットルを準備します。メディアを取り出し、ウェル当たり1ミリリットルDMEM / F12で一回洗浄し、ウェル当たり新鮮な心臓中胚葉分化培地2mlで交換し、インキュベーターに戻り、前日追加。
   4. （日9-10、分化日5-6）の両方の日には、心臓中胚葉誘導培地を除去し、DMEM / F12の各ウェルを1ミリリットルをすすぎます。
   5. 新鮮なRPMI分化メディアの2ミリリットルを追加I（ない小分子が、それでも、インスリンなしB27（）サプリメントで追加されません）各ウェルにプレートをインキュベーターに戻します。
3. （日11月24日、分化日7月20日）hES由来心筋細胞組織/成熟
   1. 10mLのB27の（インスリンで）補足およびペニシリン-ストレプトマイシンストック溶液5ml 500mlでをRPMI 1640組み合わせることによってRPMI分化培地II（ 表1）を準備します。小分けし、氷上で、50ミリリットルチューブと4℃でストアに。
   2. （11日目、分化7日目）を各ウェルから（インスリンなし）RPMI分化培地を除去し、1mlのDMEM / F12で洗い流してください。各ウェルに（インスリンとの）新しいRPMI分化メディアIIの2ミリリットルと交換し、インキュベーターに戻します。
      注：自発拍動は、第7日目と10との間に観察されるべきである叩解この時間の間に観察されていない場合、それは一般的に乏しい分化効率を示しています。プロトコルは鼓動を観察するための努力で15日目まで継続することができますが、何の鼓動は1日15で観察されない場合には、STに最高です芸術の新しい分化。
   3. （日12月24日、分化日8月20日）毎日、古い分化培地を除去し、鼓動している単層（ 図1F、 ビデオ図1の細胞成熟と組織を可能にするために、ウェルあたりの新鮮なRPMIの分化培地IIの2ミリリットルと交換）。
      注：残留細胞死によっては、分化10日目を通してDMEM / F12の1mlでリンスすることが必要であり得ます。

3.（24日目、分化20日目）心筋細胞と線維芽細胞様細胞の単離

1. 単層からの細胞を解離
   1. 分化培地を取り出して、1mlのPBSで一回すすいでください。
   2. 各ウェルに酵素的解離溶液（0.04％トリプシン/ 0.03％EDTA）の1ミリリットルで単層を解離させます。
   3. 10分間インキュベーターにプレートを移動します。一方、トリプシン中和液の6ミリリットルにROCK阻害剤の12μlを添加します。
   4. GentlYは、トリプシン溶液を中和するために、プレートの各ウェルにROCK阻害剤を含有するトリプシン中和溶液1mlを加えます。
   5. 無菌トランスファーピペットを用いて、穏やかに細胞クラスターを分割するために、各ウェルを混ぜます。
   6. 15mlの遠心管に6ウェルプレートからのすべての12ミリリットルを転送します。
      注：2つの6ウェルプレートは、このプロトコルで使用されているので二つの15 mlチューブが必要となります。
   7. プレートの1つのウェルに移し、PBSの3ミリリットルをし、その後は順次ディッシュ上の任意の残留細胞を収集するために、後続の各ウェルに同じ3ミリリットルを転送します。よく細胞を含む同じ15ミリリットルの遠心分離管に最終から残りの3ミリリットルを転送します。
   8. 4℃で5分間、300×gでペレット。
2. FACSによりライブセルソーティングのための細胞を調製
   1. ROCK阻害剤50μlの氷上でPBSの45ミリリットルにウシ胎児血清の5ミリリットルを追加することにより、染色バッファーを準備します。
   2. セルペルから上清を除去（3.1.8で）聞かせ染色緩衝液の1.2ミリリットルで再懸濁。
   3. 氷の上に新しい、予冷し、50ml遠心チューブに200μlの細胞懸濁液を転送します。これは、負の染色対照になります。
   4. 氷の上に新しい、予冷し、50ml遠心チューブに細胞懸濁液の残りの1ミリリットルを転送し、2μlのSIRPα-PE / Cy7の追加（1：500希釈）およびCD90-FITC4μlの（1：250希釈） 。静かに転送ピペットで細胞懸濁液を混合し、氷に戻ります。
   5. 4℃で1時間、氷上で、ロッカーシェーカー上で、ネガティブコントロールおよびサンプルの両方をインキュベートします。
   6. 2 15mlの遠心管に（インスリンと）RPMI培地の3ミリリットルを追加することにより、サンプル採取チューブを準備します。各チューブにROCK阻害剤の3μlを添加し、氷上で保存します。
   7. 4℃で5分間、300×gで染色された細胞をペレット化し、リンス当たりの氷冷PBSの少なくとも10mlで二回リンス。
   8. 染色緩衝液5mlにDAPI（1μg/ ml）の1μLを加えます。優しく転送ピペットを用いて、DAPI含有染色用緩衝液1-3 mlのサンプルペレットを再懸濁します。
   9. （何のDAPIを添加しないで）負の制御に染色緩衝液500μlを追加します。
   10. 静かに細胞の塊を除去し、氷上でFACSチューブをポリスチレン転送するために40μmのセルストレーナーを介して負対照および試料の両方をフィルタリングします。すぐにセルソーターにサンプルをもたらします。
   11. 方法^18のソート確立生細胞と同様に、ゲートを設定し、生細胞（DAPI負）を選択し、FITC ^+（ すなわち 、CD90 ⁺線維芽細胞）とPE / Cy7の^+（ すなわち ^{、SIRPα+心筋}細胞の両方を収集するために、負のコントロールを使用）20 PSI（ 図2）で独立した集団。
       注：ゲートを設定した後、ネガティブコントロールは、心臓トロポニンTについての染色によって、分化効率を決定するために、4％PFAで固定することができます。
       注：一部の研究者が使用することを好みますアイソタイプ対照ではなく、非染色対照は、非特異的抗体結合を補償するためにゲートを設定します。いわゆる蛍光マイナス1（FMO）コントロールは、別の可能性です。 FITC、DAPIおよびPE-Cy7の信号の明確な二峰性分布のために、我々は控えめに、おそらくいくつかの真陽性を除外しますが、任意の偽陽性を最小限に抑えることができます正のゲートへと遠くを目指し、陽性集団からゲートさ。
3. 組織工学のための準備における細胞再凝集
   1. 細胞ソートした後、10％新生児ウシ血清、1％ペニシリン - ストレプトマイシンおよび0.2％アンホテリシンB（「NBS培地」）を含有するDMEMを1mlの両方収集チューブ再懸濁ペレット。
   2. 60 cm ²の（10cmの皿）当たり2百万個の細胞の密度でペトリ皿に処理1の比率と非組織培養中で合わせた細胞をプレート^：3SIRPα+及びCD90 ⁺細胞を再結合します。 NBSメディアと10の10ミリリットルを追加します。1; ROCK阻害剤Y-27632のリットル。
   3. 小クラスターにセル再凝集を可能にするために、48時間組織培養インキュベーター中で細胞懸濁液を置き。

4.ヒト心臓組織工学

1. マルチ組織のバイオリアクターを作製
   注： 図3Aのイラストを補うために、詳細なバイオリアクター設計回路図とCADファイルには、著者からのリクエストも承ります。
   1. 機械ポリテトラフルオロエチレンの9×33のx 3.25ミリメートルの直方体に直径0.5mmの6等間隔の穴を掘削することにより、PDMSのマスターモールド。
   2. 25×35×11ミリメートル^3を測定ポリスルホンからエンドミル、機械フレームを使用しました。フレームの目的は、ベ​​ースプレートのウェルと整列して（上記の製キャストから構築）PDMSのポストを保持することです。
   3. 1 mmのエンドミルを使用して、マシン6ウェル（6×1×1ミリメートル^3）、黒ポリの20×40×5ミリメートル³個に離れて4ミリメートルテトラフルオロエチレンは、ベースプレートを形成します。
   4. / w比wの1と6の力感知ポストの2行を作成するために、カスタムポリテトラフルオロエチレンモールド（ステップ4.1.1）に追加して、一晩の下でインキュベート：10でエラストマーベースとポリジメチルシロキサン（PDMS）のための硬化剤を混ぜます80℃の真空。硬化後、軽くマスターモールドからPDMSを削除して、慎重に強化されたコントラストと自動リアルタイムポスト偏向追跡のための黒の油性マジックで各ポストのトップをマークします。
      注：ポリテトラフルオロエチレンはかなり柔らかく、簡単に破損することができます。従来のシステムと一貫性のあるPDMSポストジオメトリの寿命を保証するために、鋳造PDMSにマスターモールドを洗浄する際は注意してください。 0.5ミリメートルのワイヤは、各使用後にポスト用の穴をきれいにするために使用されるが、穴​​の内側をこすりないように注意してくださいすることができます。
      注：別の脱ガスに室温で数時間真空下でPDMSで、次に周囲圧力で混合物硬化をしてみましょう。これは、硬化プロセス中にPDMSで形成少ない残留気泡をもたらし得ます。
   5. 蒸気オートクレーブ内のすべてのコンポーネントを滅菌します。
      注：PDMSマスターモールド（ステップ4.1.1）およびポリスルホンフレーム（ステップ4.1.2）は、両方の再利用可能です。キャスト（ステップ4.1.4）から作成されたPDMSの記事も、再利用可能なだけで約10の用途のためのものです。必要に応じて、しかし、より多くのPDMSポストは、マスターモールドを使用して作成することができます。
2. 再凝集心臓細胞を収集
   1. インキュベーターから再凝集細胞を除去し、50mlの遠心分離管に再凝集メディアのすべての10ミリリットルを転送します。
   2. 3mlのPBSでプレートをすすぎ、再凝集のメディアを含む同じ50ml遠心チューブにリンスを移します。
   3. 10cmディッシュに0.04％トリプシン/ 0.03％のEDTAの3ミリリットルを追加し、5分間インキュベーターに戻します。
   4. 5分後、完全な細胞dissociaを確保するために10倍の倍率で反転複合顕微鏡でプレートを検査しますディッシュからる。いくらかの残留クラスターがまだ接続されている場合は、ゆっくり塊を分離するためにプレートを攪拌。クラスタが付着したまま場合は、別の2-3分間インキュベーターに戻します。 10分以上インキュベートしていないか、または有意な細胞死が発生することがあります。
   5. 一旦、全ての細胞が分離され、トリプシン中和液の3ミリリットルを追加します。穏やかに再凝集培地を含有する50mLの遠心管にトリプシン細胞溶液と転送との中和溶液を混合し、PBSで一回リンス。
   6. 5mlのPBSで全体の皿をすすぎ、細胞を含む同じ50ミリリットルチューブに移します。
   7. 室温で5分間、300×gで細胞をペレット。
   8. 上清を除去し、NBSメディアの1ミリリットル中にペレットを再懸濁し、1.5ミリリットルのマイクロチューブに移します。
   9. 室温で5分間、300×gでペレット化し、上清を除去します。心臓細胞（CD90 ⁺間質細胞と^SIRPα+の MYOCytes）は現在、組織構築のための準備ができています。
3. （オプション）利息の補足細胞を採取
   注：唯一の^SIRPα+心筋細胞およびCD90 ^+の線維芽細胞様細胞を含む定義された組織に加えて、組織の機能に対するそれらの効果を調べるために、関心の追加のセルを追加することが可能です。例えば、ラットMSCは、ラット工学心臓組織¹の機能を増強することが示されています。以下のオプションのステップは、定義されたシステムのための補助的な細胞の収集について説明しています。
   1. 0.25％トリプシン/ 0.1％EDTAを用いて、関心の補足細胞型（ 例えば 、間葉系幹細胞）を収集します。
   2. 次いで、目的の細胞型の適切な細胞培養培地5mlに再懸濁し、室温で5分間、300×gで細胞をペレット。例えば、MSCのために、DMEM培養20％ウシ胎児血清、1％ペニシリン - ストレプトマイシンおよび0.2％のアンホテリシンBとCを補充使用しますells。
   3. その後、室温で5分間、300×gで再び細胞をペレット化し、血球計数器を用いて細胞計数を行います。
   4. 、上清を除去し、細胞培養培地の1ミリリットル中に再懸濁し、1.5 mlのマイクロ遠心チューブに移します。
   5. 室温で5分間、300×gで細胞をペレット。
   6. 上清を取り除きます。補足細胞は現在、組織構築のための準備ができています。
      注：補足細胞は組織中の総細胞数の10％の濃度で添加される場合、各組織500,000心臓細胞（両方のCD90 ^+間質細胞を含むように、次に定義された組織のために、これは、組織あたり50,000補足細胞を必要としますそして^、SIRPα+筋細胞）。
4. 人間のエンジニア心臓組織を作成します。
   注：室温で氷の上のすべてのソリューションおよび細胞を保管してください。以下に記載されているすべてのボリュームは組織単位です。典型的には、約6の組織を2つの6ウェルPLから構築することができます心臓分化ののATE。
   1. 1 M NaOHを1.5μlのでミリリットル3.125ミリグラム/、10×PBSの9.6μlをし、滅菌超純脱イオン水24.9μlに5 mg / mlでコラーゲン株式の60.0μlの希釈します。
      重要なステップ：気泡は、適切な組織の形成を破壊されますように準備中に各溶液への気泡の導入を避けてください。
   2. コラーゲンミックスを作成するために、希釈コラーゲン混合物に10倍MEMと0.2 N HEPES pHが9両方の12.0μlを添加します。コラーゲンミックスに気泡の導入を避けるために15ミリリットルの遠心分離管の側を下に両方のソリューションを追加します。
   3. コラーゲン混合ミリリットル0.9ミリグラム/最終濃度基底膜マトリックスを追加し、最終組織のミックスを作成するために氷上で保存します。コラーゲンの最終濃度は2 mg / mlであるべきです。
   4. 25μlの最終体積あたりに組織ミックスに再凝集細胞の500,000追加（筋細胞+線維芽細胞濃度が2000万/ mlである）と記入無細胞NBSメディアや関心の補足的な細胞型（ 例えば 、hMSCが）の50,000細胞のいずれかを有する組織、さらには細胞懸濁液を形成するために、よく混ぜます。
      注：補足した細胞の数は、異なる用途のために変化するであろう。ここで、10％の補充が使用されます。
   5. 注意して、空気を導入することなく、バイオリアクターベースプレートの6つの各ウエルにピペット細胞懸濁液の25μlを、ウェルに泡。
   6. 支柱の1対が細胞懸濁液を含む各ウェルに入るようにベースプレートの上にフレームを反転その後、反対側の柱の6対を形成、ポリスルホンフレームの両側にPDMS力センサの2つの行を押してください。
      注：ポリスルホンフレームは、PDMSの整列を助けるためのタブが含まれています。
   7. その後、10cmの皿の内側のカバーを外したままの皿を置いて上に10cmのカバーを置き、全体バイオリアクターアセンブリを移動し、60ミリメートル皿に、ダウンベースプレート、バイオリアクターを慎重に置きます組織培養インキュベーターに、ゲルの組織のための2つの時間を待っています。
   8. 2時間後、インキュベーターからバイオリアクターを削除して、ベースプレートをカバーするのに十分な、アセンブリ全体にNBSメディアの14ミリリットルを追加します。インキュベーターに戻り、毎日メディアの半分を変更します。
   9. 四十八時間後に、慎重に、静かに時のフレームから数ミリメートルをベースプレートの各辺を移動させることにより、ベースプレートを削除するメディアを変更し、その後、組織はメディアに、下に向け、バイオリアクターを返します。
   10. 毎日NBS培地の半分を変え続けます。
       注：組織の自発的収縮が早くも5日目として7に測定可能単収縮力を発生させる、早ければ3日間組織構築後に観察することができます。

Results

心筋細胞を得るためには、Bohelerとリアン分化方法を少し変更したバージョンは^30,31に使用されます。分化は、細胞増殖の対数期の間に開始することなく、出発集団（約75％が最適である）選別後の細胞の使用可能な数を得るために十分にコンフルエントであることが肝要です。典型的に、H7ヒトES細胞のために、37℃で維持不可欠8培地、5％CO ₂インキュベーター中で6ウェル皿のウェル当たり14万hESCの密度でプレーティングすると示されているように、分化を開始するために4日後に十分にコンフルエントな培養物が得られます図1Aの- D。インスリンは、分化プロセス³²中に心臓の仕様を阻害するので、インスリンを含まない培地（分化培地I、 表1）は、分化の最初の10日間使用されています。分化はGSK3インヒビターCHIR99021のアプリケーションを介して開始されると、有意な細胞死が（ 図1E）を発生します。結果として、毎日のメディアを変更することが不可欠...

Discussion

定義された人間工学的心臓組織（HECT）の構築は、人間の心筋細胞機能のより一貫性と信頼性の高いモデルを提供することができます。批判的に、システム内のすべての細胞および細胞外成分が知られており、従って、分化過程に起因する他の未知の細胞型の交絡の影響を除去し、所望のように操作することができます。急速な細胞増殖と高い収率のバランスをとるためには、分化は、理想的には四日間プレーティング後、hESCの75％コンフルエンスで開始することが好ましいです。さらに、非常に選別後の細胞の解離および再凝集の両方の間にROCK阻害剤Y-27632の使用は、細胞の生存率を高めます。分化プロセス中の筋細胞の自発的な鼓動の存在は、分化の効率化と健康の重要な指標です。自発的な鼓動が観察されていない場合、これは効果がない試薬または損失によるいずれかで、貧しい分化効率を示すことができます幹細胞の多能性。

組織構築時に、PDMSポストが収縮機能を測定するために十分長くは続かよく形成された組織を作成するために、ベースプレートのチャネルと適切に整列する必要があります。デバイスアライメントの容易さを高め、それらが破壊を受けや...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Culture	会社	カタログ番号	Comments
Amphotericin B	Sigma-Aldrich	A2411	DMSOに2.5 mg / mlのストックを調製し、
インスリンライフテクノロジーズでB27		17505055
	ライフテクノロジー	A1895601
CHIR99021	Stemgent	04-0004	クリエイト6 μM株、その後アリコートして-20 °C.
エッセンシャル 8 メディア	ライフ テクノロジー	A1517001
H7 ヒト胚性幹細胞	WiCell	WA07
hESC 認定マトリックス、コーニング マトリゲル	コーニング	354277	氷上で 4 °C で解凍します。Cは一晩で、その後アリコート150 μlを別々のチューブに入れ、-20 に保管します。°C.
IWR-1	Sigma-Aldrich	I0161	10 mMのストックと分注を作成します。-20°Cで保管します。C
新生児子牛血清	Life Technologies	16010159
非酵素的解離試薬 穏やかな細胞解離試薬	幹細胞技術	7174
ペニシリン-ストレプトマイシン	コーニング	30-002-CI
RPMI 1640	Life Technologies	11875-093	冷蔵保管
Y-27632 (ROCK阻害剤)	Stemgent	04-0012	10 mMのストック濃度に再懸濁し、アリコートして-20 °C.凍結融解サイクルを避けてください。
Cell Sorting	会社名	カタログ番号	コメント
4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、二塩酸塩(DAPI)	Life Technologies	D1306
CD90-FITC	BioLegend	328107
酵素解離試薬:Cell Detach Kit I (0.04 % Trypsin/ 0.03% EDTA, Trypsin Neutralization solution and Hanks Buffered Salt Solution)	PromoCell	C-41200
ウシ胎児血清	Atlanta Biologics	S11250
SIRP&α;-PE/Cy7	BioLegend	323807
Tissue Construction	会社名	カタログ番号	コメント
0.25% Trypsin/0.1% EDTA	フィッシャーサイエンティフィック	25-053-CI	オプション: 関心のある補足細胞の収集用
10x MEM	Sigma-Aldrich	M0275-100ML
10x PBS パケット	Sigma-Aldrich	P3813
コラーゲン、ウシ I 型	ライフ テクノロジー	ズ A10644-01	氷上に保つ
DMEM/F12	ライフ テクノロジー	ズ 11330057
ダルベッコs Modified Eagles Medium (DMEM)、高グルコース	Sigma-Aldrich	D5648
ポリジメチルシロキサン (PDMS)	Dow Corning	Sylgard 184
HEPESナトリウム	Sigma-Aldrich	H3784
水酸化ナトリウム		221465
Materials	Company	カタログ番号	コメント
>1.5 ml マイクロ遠心チューブ	フィッシャーサイエンティフィ	NC0536757
15 ml ポリプロイレン遠心チューブ	コーニング	352096
5 ml ポリスチレン丸底チューブ	コーニング	352235	統合 35 μm細胞ス
トレーナー50mlポリプロイレン遠心分離管	Corning	352070
6ウェル平底組織培養処理プレート	Corning	353046
細胞スクレーパー、使い捨て	Biologix	70-2180
ポリスルホン	McMaster-Carr
ポリテトラフルオロエチレン(テフロン)	McMaster-Carr
Equipment	会社	カタログ番号	>Comments
Dissecting Microscope	Olympus	SZ-61
を高速に取り付けるための高速カメラ用のマウントが必要ですカメラ	Pixelink	PL-B741U	または同様のものですが、正確なデータ取得のために毎秒100フレームの能力が必要です
プレート温度制御			データ取得中にメディアの温度を維持するために使用されます。
Custom Materials	Company	カタログ番号	Comments
著者からのリクエストに応じて利用可能な	ポストトラッキングプログラム