ここでは、卵巣癌細胞の接着、浸潤、増殖を調査するツールとして、初代ヒト中皮細胞と細胞外マトリックスで層状にされた線維芽細胞からなる腹腔の内層の3次元in vitroモデルを構築するためのプロトコルを提示します。
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この記事について
サマリー
要約
卵巣癌の転移パターンは、他のほとんどの上皮性腫瘍のそれとは著しく異なります。なぜなら、それはめったに血を引かないためです。代わりに、原発腫瘍から剥離した卵巣がん細胞は、腹水によって腹腔内の転移部位に運ばれます。これらの部位、特に腹部腹膜と大網は、中皮が裏打ちされた表面で覆われた臓器です。卵巣がんの播種過程を調べるために、腹腔の内壁をin vitroで再構築する複雑な三次元培養系を組み立てました。初代ヒト線維芽細胞および中皮細胞をヒト大網から単離した。次に、線維芽細胞を細胞外マトリックスと混合し、初代ヒト中皮細胞の層で覆って、転移した卵巣癌細胞が遭遇する腹膜表面と軟膜表面を模倣しました。得られた器官型モデルは、図示されているように、がん細胞の接着、浸潤、増殖など、卵巣がん播種の初期段階を調べるために使用されます。このモデルは、早期卵巣がん播種における微小環境(細胞性および非細胞性)の役割を調査するための多くの研究で使用されています。また、ハイスループットスクリーニングにも成功裏に適応しており、卵巣がん転移の阻害剤の同定と試験に使用されています。
概要
卵巣癌は最も致命的な婦人科悪性腫瘍です 1.患者の大多数は、がんが腹腔全体に広がった後に診断されます。がんが腹腔全体に拡がると、腫瘍縮小手術や化学療法はがんの再発や化学療法を防ぐのに十分な治療法ではないことが多く、5年生存率は30%未満になります。卵巣がんの転移は主に腹腔に限定され、胃がん、膵臓がん、結腸がんなど、他のいくつかの種類のがんが腹腔内の同じ解剖学的部位に転移します。一般に、卵巣がん細胞は、卵管または原発性卵巣腫瘍のin situがんから剥離し、単一細胞またはスフェロイドとして腹水中を移動し、大網、腸、および腹壁2の中皮が並ぶ表面に付着します。
腫瘍微小環境は、多くの癌3-6における疾患の進行と化学療法抵抗性において重要な役割を果たしています。腹腔は、中皮細胞単層が表面の大部分を覆う独特の微小環境です(図1A)7。中皮の内層は、低摩擦の表面を作り出すバリアとして機能し、がん細胞の接着から保護する傾向があります8。この中皮が裏打ちされた表面のすぐ下には、主に線維芽細胞と細胞外マトリックス(ECM)で作られた層があり、がん細胞の接着と浸潤を促進します8。卵巣がん細胞は、卵巣がん細胞の接着、浸潤、および転移を促進する中皮細胞内層の変化を誘発する因子を分泌します9,10。....
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プロトコル
記載されている全ての研究プロトコルは、シカゴ施設内倫理委員会の大学（IRB）によって検討されています。インフォームドコンセントは、手術前に各患者から得られたものであり、この研究は、シカゴ大学IRBによって承認されました。生物学的安全キャビネットタイプ2との手袋は、保護のためにヒト組織を取り扱う際に使用されるべきであり、細胞の汚染のリスクを低減します。
一次形質転換されていない間質細胞の単離および培養1。
- ヒト組織収集と準備。
- 腹部手術の間に除去さヒト大網、2 cm 3での標本を取得し、直ちにRTリン酸緩衝生理食塩水（PBS）（ 図2A）の組織を浸します。 X 2センチメートル大網3センチメートルの作品は、一般的に100万初代ヒト中皮細胞（HPMC）20万の一次ヒト線維芽細胞または正常大網線維芽細胞（NOF）が得られます。
- 組織が3用0.5×gで中に浸漬したPBSをスピンダウン分できるだけ早く採取後（PBS中<2時間）、50mlのコニカルチューブに新鮮な20ミリリットルのPBSに組織を移します。直径15cm、無菌培養皿（ 図2B）にメスで切り刻むことによって5ミリメートル3個に組織をカット。
- 初代ヒト中皮細胞の単離8
- HPMCを単離するた....
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結果
器官培養物を、最初にI型コラーゲンと初代ヒト線維芽細胞を混合した後、中皮細胞の5倍の数でこの文化を重ねることによって組み立てました。卵巣癌細胞の接着、浸潤または増殖を研究するために追加された前培養物を少なくとも18時間インキュベートしました。各アッセイは、複数を繰り返した（N = 5）及び浸潤アッセイ（N = 3）（N = 3~5）の異なる患者及び多数のウェルから得られた三次元培養を接着するための各条件で試験した（n = 5）を、増殖。 4時間（ 図4）の後に3次元器官培養物に付着した卵巣癌細胞は、72時間（6回HeyA8細胞倍加時間）（ 図5）の後に文化に増殖し、24時間（ 図6）の後に侵入しました。 HeyA8卵巣癌細胞の接着、増殖および浸潤は、インテグリン依存性（ 図4-6）でした。具体的には、RGDペプチド、ブロッキングantib5 -インテグリン、β1インテグリンとの αvβ3
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ディスカッション
腹膜微小環境の器官モデルは、卵巣癌の普及における微小環境の細胞と生来のコンポーネントの両方の個人や集団の機能（複数可）を評価するために設立されました。卵巣癌細胞の接着、増殖、および浸潤を調べるために、3次元器官型培養物をプレーティングし、カスタマイズするための特定のプロトコルが提供されます。初代ヒト大網中皮細胞及び線維芽細胞は、患者から単離し、正常な形態および患者の変化を維持するために初期の継代で使用しました。このモデルでは、通常の大網線維芽細胞とECM（一般的にコラーゲンタイプI）は、一次ヒト中皮細胞単層を積層しました。このモデルは組織学的には、腹膜ライニングを模倣し、私たちは再作成および卵巣癌細胞の接着、増殖、および浸潤8,27を含む卵巣癌転移における重要なイベントを調べることができます。
以前は、限定された3Dモデルを持っていますこの3D器官モデルは腹膜腔の中皮ライニングの建設を再現する最初のものですが、微小環境13,14,21-25と卵巣癌と の相互作用を調査するために確立されて。人間の大網は、年齢や健康状態に変化患者から採取.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
私たちは、すべての研修医と主治医、特にA.F.ヘイニー博士（シカゴ大学産婦人科）のオオトアル生検を収集してくださった方々に感謝します。また、この原稿を慎重に編集してくれたStacey Tobin氏とGail Isenberg氏に感謝します。この活動は、シカゴ・ベアーズ・フットボール・クラブ、国立神経疾患・脳卒中研究所(NINDS)のR21 NS075702、および国立がん研究所のE.L.への助成金R01 CA111882の慈善受益者であるベアーズ・ケアの支援を受けました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| <ストロング>1.初代細胞の単離と培養 | |||
| PBS | フィッシャーサイエンティフィック | SH3001304 | |
| 片刃カミソリの刃 | フィッシャーサイエンティフィック | 12-640 | |
| 15 cm 培養皿 | BD バイオサイエンス 353025 | ||
| ガラスフラスコ | ? | ? | |
| ウシ胎児血清(FBS) | Life Technologies | 16000044_3616914956 | |
| DMEM with L-Glutamine | コーニング | 10-013-CV | |
| MEMビタミン | コーニング | 25-020-Cl | |
| MEM 非必須アミノ酸 | コーニング | 25-025-CI | |
| ペニシリン-ストレプトマイシン | コーニング | 30-002-CI | |
| シェーカー | Thermo-Fisher | MaxQ 4450 | |
| 遠心分離機 | Eppendorf | 5702 | |
| インキュベーター | Thermo-Fisher | Forma Series II ウォータージャケット CO2 インキュベーター モデル 3100 | |
| トリプシン EDTA、1x (0.25%) | Corning | 25-053-CI | |
| ヒアルロニダーゼ | ワージントン 生化学 | LS002592 | |
| T-75 フラスコ | BD Biosciences | ||
| T-175 フラスコ | BD Biosciences | 353112 | |
| ピペットチップ | レイニン | P2、P10、P20、P200、P1000 | |
| ピペットチップ | コーニング | フィルターチップ P2、P10、P20、P200、P1000 | |
| <ストロング>試薬名/機器名 | <ストロング>会社名ロング | <>ストロング>カタログ番号 | コメント/説明 |
| 2.プレーティング 3D 培養 | |||
| セル カウンター | Invitrogen | Countess | |
| Countess Cell Counting, Chamber Slides | Invitrogen | C10313 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Collagen Type I (Rat Tail) | BD Biosciences | 354236 | |
| 96 well plate, clear bottom, black | BDバイオサイエンス | 353219 | |
| 試薬名/装置 | 会社 | カタログ番号 | コメント/説明 |
| 3.接着アッセイ | |||
| マルチチャンネルピペット | Eppendorf | Xplorer 300 | |
| パラホルムアルデヒド溶液 PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | |
| プレートリーダー | 分子デバイス | Minimax | |
| 試薬名/機器名 | 会社名 | カタログ番号 | コメント/説明 |
| 5.インベージョンアッセイ | |||
| 細胞培養インサート(8um、24ウェル) | BD Biosciences | 353097 | |
| 綿棒 | Qチップ | 綿棒 | |
| 顕微鏡 | ツァイス | アクシオーバー 200m | |
| セルプロファイラー | パブリックドメイン | ||
| 24ウェルプレート | BD Biosciences | 353047 | |
| 試薬/機器の名前 | 会社 | カタログ番号 | strongコメント/説明 |
| 6。抗体 | |||
| 抗インテグリン&アルファ;V&ベータ;3抗体、クローンLM609 | EMD Millipore | MAB1976 | |
| Beta 1 | Oncosynergy | OS2966 | |
| Alpha 5 [CD49e] | ID Pharmingen | 555615 | |
| Beta 4 [CD104] | EMD Millipore | MAB 2058 |
参考文献
- Siegel, R., Ma, J., Zou, Z., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J. Clin. 65 (1), 5-29 (2015).
- Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. Am. J. Pathol. 177, 1053-1064 (2010).
- Quail, D. F., Joyce, J. A.
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再版と許可
