方法論記事

懸濁液中のHEK293細胞の一過性トランスフェクションによる組換えヒトタンパ​​ク質のハイ・イールド式

DOI：

10.3791/53568

⸱

2015年12月28日

 ,  ,  ,  , 
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University, 2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

この記事について

訂正のお知らせ

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

適切な翻訳後修飾を伴う真核生物タンパク質の実験室規模での生産は、大きな障壁を表しています。ここでは、哺乳類の発現システムを使用したタンパク質発現の迅速な確立とターンアラウンドを実現する堅牢なプロトコールをご紹介します。このシステムは、選択的アミノ酸、タンパク質の選択的標識、および糖鎖組成の低分子モジュレーターをサポートします。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

複雑な翻訳後修飾を有する組換えタンパク質を生産する技術は、構造と機能の研究のための主要な課題です。迅速な確立と一過性にトランスフェクト哺乳動物細胞株からの高回収はこの障壁に対処し、自然にERおよびゴルジ体媒介分泌経路を通って流れるされているタンパク質を発現する有効な手段です。ここで、高いタンパク質収率のために設計された哺乳動物発現ベクターでトランスフェクトしたヒトHEK293FおよびHEK293S細胞株を用いて、タンパク質発現のための1つのプロトコルです。このシステムの適用は、培養物1リットル当たり、回収、精製したタンパク質の95から120 mgの間の収率で表される3つの代表的な糖タンパク質を用いて実証されています。これらのタンパク質は、ヒトのFcγRIIIAおよびラットα2-6シアル酸転移酵素、ST6GalI、N末端GFP融合だけでなく、変更されていないヒト免疫グロブリンG1のFcと表現の両方です。この堅牢なシステムUTI質量分析および核磁気共鳴分光法を用いて、構造研究のための同位体濃縮タンパク質および炭水化物の発現のために適合可能である無血清培地をlizes。さらに、N-グリカンの組成物は、収率を低下させないようにして特定のグリカンの改変を防止するための小分子を添加することによって調整することができます。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

構造および機能の詳細な分析のために適切に折り畳まれ、翻訳後修飾されたヒトタンパ​​ク質を高収率で製造することは重要な課題です。発現系が多数天然様の機能と動作を有する組換えタンパク質を産生すること可能です。酵母、植物、昆虫および哺乳動物系でもある1-4を説明しても細菌発現系、主に大腸菌株は、原因でこれらの発現系のシンプルさに、研究の分野で最もアクセスし、一般的に使用されるツールを表しています。しかしながら、これらのシステムの大部分は、標的タンパク質の適切な翻訳後修飾することができません。バーブとMoremen研究所の基本的な関心は、適切なグリコシル化と真核生物のタンパク質を生産しています。多くのヒトタンパク質（5を参照）適切な機能のために適切なグリコシル化を必要とします。

真核生物グリコシル化機構が広範かつ両方アスパラギン（N）を含む、修飾の多様を作成することが可能である-セリン/スレオニン（O）は、複雑なグリカン6 -結合しました。これは、ヒトタンパク質の> 50％がN-グリコシル化7であると推定されています。グリカンは、少数を示すために、本質的な治療用モノクローナル抗体を含む多くのタンパク質の構成成分、エリスロポエチン、および第IX因子などの血液凝固因子です。複数のメソッドは、11-14または操作された組換えシステム15-20からの回復を化学酵素には、純粋に合成8-10から適切にN-グリコシル化タンパク質および範囲を準備するために存在するが、驚くことではないが、人間の発現系は、これまでで最も堅牢であることが証明されましたヒトタンパ​​ク質を生成するための方法。

多くの治療用のヒト糖タンパク質は、哺乳動物細胞を用いた組換え系において産生されます。ノートのシステムは、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）、マウス骨髄腫（NS0）、ベビーハムスターKidneですY（BHK）、ヒト胚性腎臓（HEK-293）及びタンパク質産生のために4,21,22接着または懸濁培養で使用されるヒト網膜細胞株。しかし、哺乳動物タンパク質発現系は、安定な細胞株の生成、高価な増殖培地と基板補助トランスフェクション手順23を必要としています。

哺乳動物細胞のトランスフェクションは、リン酸カルシウム24,25、カチオン性ポリマー（DEAE-デキストラン、ポリブレン、ポリリジン、ポリエチ（PEI））または正に荷電したカチオン性リポソーム26-29を含む多くの薬の助けを借りて達成されます。 PEIは26ポリカチオン性、荷電、直鎖状または分岐鎖状のポリマー（25 kDaの）であるDNAと安定な複合体を形成し、エンドサイトーシスされます。エンドソームの酸性化の際に、PEIは、エンドソームおよび細胞質26,30へのDNAの放出の破裂につながる、膨潤すると考えられています。

suspensiで最近まで、一過性トランスフェクション文化に細胞培養29に加え、続いて前に、DNA / PEI複合体形成することにより実施しました。しかし、ワームおよび共同研究者らは 、in situ 31,32 で DNA / PEI複合体を形成されたHEK293細胞における組換えタンパク質産生のために最適化された非常に効率的なプロトコルを報告しました。これは、培養培地中に調製、複合体の滅菌、および緩衝液交換を回避します。大幅な収量増加につながった33の発現増強プラスミドを含むことにより、さらなる最適化。ここでは、これらの進歩の上に構築し、広く適用可能である方法です。発現条件はまた、Nグリカン合成に影響を与えるように変更されてもよいです。

中間段階でのN-グリカンの処理を停止し、遺伝子欠失を有するHEK293S細胞株は、、グルコサミン（GlcNAc 2 の Man 5）34 2、N-アセチルグルコサミン残基に加えて5マンノース残基からなる均一なN-グリカンを有するタンパク質の発現をもたらします35。これらの細胞N-アセチルトランスフェラーゼI（GNTI）下流N-グリカン処理36,37のために必要とされる遺伝子を欠いています。キフネンシン、シアル酸類似体およびフコース類似体及び2-デオキシ-2-フルオロフコースなどのグリコシルトランスフェラーゼ阻害剤の使用は、同様の効果と、N-グリカンプロセッシング38-41限界があります。

プロトコルは、ここで報告された、図1 42,43、PEI支援過渡哺乳類細胞株（HEK293FまたはHEK293S細胞）へのトランスフェクション、および適切なグリコシル化タンパク質の高収量の回復に示すようにPGEN2ベクトルを使用しています。このシステムは堅牢であり、組換えタンパク質の大規模な力価の生産のための同位体標識およびグリカンエンジニアリングを含む様々な要因に対応することができます。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、HEK293FまたはHEK293S細胞のいずれかを使用して表現するのに十分です。

1.細胞の樹立

  1. 文化接種
    注：すべての文化の操作手順は、BSL-2施設で実施されなければならず、各項目には、水溶液中の70％エタノールを噴霧することにより滅菌されなければならない生物学的安全キャビネットに持ち込ま。
    1. 135 rpmで、80％の湿度でと8.0％のCO 2、37℃のインキュベーターシェーカーを操作します。作業に少なくとも1時間前に生物学的安全キャビネットのUVランプを「オン」に。 1時間、37℃の水浴中で密封された培地Aおよび培地Bボトルを予熱します。
    2. 水溶液中の70％エタノールを噴霧することにより通気キャップ、ピペット、ピペット、およびあらかじめ温めておいたメディアボトルと125ミリリットルの三角成長フラスコを滅菌します。生物学的安全キャビネットの中でこれらの項目を配置します。注意：125ミリリットルの三角培養フラスコをカバーするだけの外側のプラスチックを滅菌した後、場合にのみ、私を削除バイオセーフティキャビネット内の。
    3. 30ミリリットルの文化のために、培地B（最終培養の10％）の培地Aの26ミリリットルと3ミリリットルを撤回し、125ミリリットルの三角培養フラスコに移し、ゆっくり（以下、新鮮な培養培地と呼ぶ）振とうして混合します。
    4. 氷の上に、-80℃で凍結し、HEK293F細胞を含む細胞の1つのバイアルを移し、培養室に移動します。注：HEK293F細胞を、1×10 7細胞/ mlの濃度で供給されます。
    5. （これは約1分かかり、細胞が完全に解凍されるべきではない）部分的に細胞を解凍するために37℃の水浴中で穏やかにバイアルを温め。水溶液中の70％エタノールでバイアルの外側を滅菌し、生物学的安全キャビネットに移動。
    6. 1 mlのピ​​ペットを用いて、細胞懸濁液（約0.7 ml）を撤回し、新鮮な培地29 mlを含む125 mlの三角フラスコに移します。培養フラスコのカバーを閉じて、インキュベーションシェーカーに移動。
  2. 細胞の維持：細胞密度、生存率および細胞継代をチェック
    1. 以下のプロトコルに従うことにより、文化の解凍の24時間後の細胞密度を確認してください。注：細胞は、> 80％の本質的な細胞増殖及び生存能力を確保するために、解凍後24時間増殖させます。
    2. 水溶液中の70％エタノールで培養フラスコを滅菌し、生物学的安全キャビネットに移動。
    3. 1ミリリットルピペットとピペッターを使用して、ゆっくりと浮遊培養液100μlを撤回し、滅菌0.5ミリリットルのエッペンドルフチュー​​ブに移します。閉じて、できるだけ早くバックシェーカーに培養フラスコを転送します。
    4. 細胞の7.5μlのトリパンブルー溶液の7.5μLを混ぜます。セル/トリパンブルー混合物の7.5マイクロリットルと激しく混合し、計数スライドに転送します。
    5. 自動セルカウンターをオンにして、ロード室にカウントスライドを配置します。オートリーダーが活性化され、細胞を単位に自動的にカウントされmlであり、パーセント生存率あたりの細胞の数の
    6. 0.3×10 6生細胞/ mlの細胞密度で新鮮培地への転送に必要なドナー培養物の容量を決定します。
      注：補足資料のサンプル計算を参照してください。
    7. 繰り返しは、新鮮な培地に必要な材料を準備するために、上記の「1.1文化接種」プロトコルの1.1.2と1.1.3を繰り返します。
    8. 新鮮な125ミリリットルの培養フラスコに培地A（23ミリリットル）と培地B（3ml）に転送します。安全キャビネットから培地Aおよび培地Bの株式ボトルを取り外します。
      注意：メディアボトルの在庫はHEK 293F細胞と同時にバイオセーフティキャビネットに保管すべきではありません。これは、株式媒体ボトルを汚染の可能性を制限します。
    9. インキュベーターからのHEK293細胞培養を削除して、水溶液中の70％エタノールでスプレー。新しいピペットを用いて、細胞（4ミリリットルのアリコートを撤回、このボリュームはTに従って測定しましたO培養物からのステップ1.2.6）、新鮮な培地を含むフラスコに移します。
    10. 1.1.1に応じて設定したインキュベーターシェーカーにバイオセーフティキャビネットからの文化の両方を転送します。 2-3×10 6生細胞/ mlのおおよその密度に細胞を増殖させます。
      注意：細胞の約2倍の時間は32時間です。それは、この密度に到達するために3-4日かかります。最初のトランスフェクション前に、細胞の安定的な成長パターンを持っている3-4の継代のために細胞をインキュベートします。

2.トランスフェクションのための材料を準備します

  1. 準備HEK293細胞（1日目）
    1. トランスフェクションの前に新鮮な培地B 24時間で1×10 6細胞/ mlの密度に継代培養細胞は1.2ステップの方法。
      注：トランスフェクション培養物の体積は、細胞の数に依存するであろう。大きなトランスフェクションボリューム（> 20ml）をこの段階で文化のより大きな容量が必要になります。
  2. セントの準備材料のocks
    1. 25mMの4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）、および150mMのNaCl（pHは7.5）を含む緩衝液中に1mg / mlの濃度で線形ポリエチレンイミン（PEI）のストック溶液を調製します。完全にPEIを溶解し;これを室温で30〜60分をとることができます。長期使用のために-20℃で、0.22μMシリンジフィルターとストアを介して滅菌します。
    2. （2.2.2.1-2.2.2.4手順に従って）無菌プラスミドDNAを準備します。プラスミド構築の手順は、他の場所に記載されている42。 DNAの調製のための簡単​​な手順は、ここで説明されています。
      1. 100μgのを補充したLB培地1 L（Tryptone-が10g / L、酵母extract-を5g / Lナトリウムクロリドを10g / L）/中PGEN2ベクターで形質転換された化学的にコンピテントな大腸菌細胞の培養物を成長させますmlのアンピシリン。E.大腸菌は、無加湿振盪インキュベーター中で37℃で成長させました。
      2. マヌーに従ってPGEN2ベクトル符号化対象のプラスミドDNAを精製facturerのDNA精製プロトコル。
      3. プラスミドDNAの完全な無菌性を確保するために、生物学的安全キャビネット内のDN​​A抽出手順の最終イソプロパノール沈殿および再懸濁の手順を実行します。
      4. 万xで溶出したDNAと遠心分離機に（プラスミド調製キットで指定された）イソプロパノールの量を追加します。 10分間のグラム。水溶液中で70％エタノールでのDNA容器の外側を滅菌し、バイオセーフティキャビネット内に転送します。ピペットと空気乾燥DNAペレットを使用して、イソプロパノール、上清を捨てます。乾燥したら、無菌の10mMトリス緩衝液、pH 8.0でペレットを再懸濁。
    3. 水に220ミリモルのバルプロ（VPA）は、酸の原液を調製し、滅菌0.22μmフィルターを通過させることによって滅菌します。さらに使用するまで-20℃で溶液を保管してください。

3.一過性トランスフェクションの確立

  1. トランスフェクション（0日目）
    1. 以下の手順により細胞密度を確認し、上記「1.2。細胞の維持」の1.2.5を介して1.2.2。トランスフェクション（> 95％の生存率で2.5〜3.0×10 6生細胞/ mlの）のための細胞の量を決定します。補足資料のサンプル計算を参照してください。
    2. 無菌の血清学的ピペットを用いて250ミリリットルの遠心管に、前のステップ（ここでは67ミリリットル）で計算された懸濁培養細胞の量を転送します。 100×gで5分間の遠心分離によって細胞を収集します。
    3. 一方、上記「1.1。文化接種」に応じてステップ1.1.3を次の新鮮なトランスフェクション培地を準備します。サンプル計算のための補足資料を参照してください。また、無菌の15mlチューブに新鮮な培養培地の転送5ミリリットル、脇に置きます。
    4. 移送管は水溶液中70％エタノールでチューブの外側を殺菌した後、バイオセーフティキャビネットにペレット化した細胞を含有する第デカント滅菌ピペットを使用して費やした培地からなる電子上清。
    5. 激しくピペッティングすることにより（ステップ3.1.3上記で調製した）新鮮なトランスフェクション培地を用いてフラスコに新鮮な培地と転送を10mlを用いてダウンペレット化した細胞を再懸濁します。通気細胞培養フラスコのキャップをねじ込み、振とうしながら15分〜1時間のために（1.1.1で設定された）インキュベーターにフラスコを移動します。
    6. この間、0.5μgの/μlの最終濃度（上記ステップ3.1.3から引き出さ5 mlの容量を使用して）新鮮な培地を用いてプラスミドDNAとPEIストックを希釈します。 DNAとPEIの量を決定するために、補足資料のサンプル計算を参照してください。バイオセーフティキャビネットに分散した細胞を培養フラスコを転送します。
    7. マイクロピペットを用いて培養し、プラスミドDNA（0.5μgの/μlと300μl）を加え、穏やかな手動振とうして混合します。 PEI文化へ（0.5μgの/μlと900μl）を追加し、穏やかに振とうして混合します。新鮮CULの3.8ミリリットルを追加します。24時間インキュベーターシェーカーに上記のステップ3.1.3、および転送フラスコからトゥーレ媒体。
    8. 1.1のステップに従ったバイオセーフティキャビネットを清掃してください。
  2. （50ミリリットルのトランスフェクションのボリュームの場合）希釈（1日目）
    1. 24時間トランスフェクトされた文化をインキュベートします。
    2. 滅菌1ミリリットルの血清学的ピペットを使用し、滅菌50mlチューブに移す。（2.2.3ステップに従って調製した。VPA）予熱し220 mMのバルプロ酸の1ミリリットルを撤回。
    3. 5.0予め温めた培地B mlの予熱し培地Aの44ミリリットルを撤回し、VPAの4.4 mMでの最終濃度で新鮮な培養培地50mlを準備するために、無菌の血清学的ピペットを用いて、VPA溶液にこれを追加します。
    4. 、水溶液中の70％エタノールでフラスコの外側を滅菌した後、安全キャビネット内にトランスフェクト文化を移動する準備希釈媒体を追加し、インキュベーションシェーカーに戻し、フラスコを転送します。
  3. 発現と収穫（日2-6）
    1. （5-6日、トランスフェクションからの合計）は、追加の4〜5日間細胞をインキュベートします。
    2. ステップ1.2.2以下の培地のアリコートを撤回。 1.2.5へ。 SDS-PAGEにより毎日でタンパク質の発現を分析するためにアリコートを、細胞の生存率を監視し、保存するために、滅菌した1ミリリットルの血清学的ピペットを用いて、上記「1.2。細胞の維持」で説明されている（以下、第5章を参照してください）​​。
    3. 5分間の千グラムで細胞プラス培地を遠心分離することにより、5-6日後に細胞を回収。細胞生存率が50％を下回った場合にはさらに、（手順を1.2.2-1.2.5参照）上清を収穫。
    4. 分泌タンパク質が含まれています上清をオフに注ぎます。 HEK細胞ペレットに10％の漂白剤の5ミリリットルを加え、バイオハザードのように捨てます。

4.タンパク質精製

  1. プロテインAセファロース5mlでカラムを準備します。緩衝液A（20mMの3-（N-モルホリノ）プロパンスルホン酸（MOPS）、pHが7.4、100 mMのNACの5カラム容量でカラムを平衡化L）。
  2. 残りの細胞破片を除去し、高速（10分14,000 g）に発現したタンパク質で回収した上清を遠心します。新しいチューブにデカントすることにより収集します。バイオハザードのようにペレットを捨てます。
  3. 上清の10μlのアリコートを収集し、さらに（5節で説明）をSDS-PAGEによって、試料を分析するために、各タンパク質精製ステップで少量のサンプルを収集します。明らかにした上清をロードし、フロースルーを収集します。
  4. バッファーAの3カラム容量でカラムを洗浄し、100 mMグリシン、pHが3.0の5カラム容量のタンパク質を溶出。急速pH値を中和するために半分の1 M TRIS緩衝液の量、8.0のpHを含むチューブ中に溶出液を収集します。
  5. 将来の使用のための緩衝液Aおよび店舗の10カラム容量でカラムを洗浄します。
  6. 緩衝液は、使用した10kDaの分子量カットオフ遠心フィルターバッファの少なくとも10倍過剰で溶出したタンパク質を交換します。注：に溶出された試料を集中しないでください溶出緩衝液中に非常に低容量（<2ミリリットル）。緩衝液Aでバッファを交換するために、遠心フィルターを使用して、
  7. ストアは、次の使用まで4℃でタンパク質を精製しました。
    注：上清中に発現されたタンパク質は、タンパク質の特性に基づいまたは親和性タグの使用に選択されたアフィニティーカラムによって精製することができます。典型的な精製手順のために、カラムは、IgGまたはFc断片またはニッケルカラムに使用することができるタンパク質は、ポリヒスチジンタグで発現されるタンパク質のために使用することができます。ここでは、プロテインAカラムを用いたIgG1-Fcのための精製工程について説明します。

SDS-PAGEによるタンパク質の分析5。

  1. 2×ローディング緩衝液（0.125 Mトリス、pHが8.0、4％SDS、10％βメルカプトエタノール、20％グリセロール、0.01％ブロモフェノールブルー）の等容量の各サンプルのアリコート（7.5μl）を希釈します。
  2. ヒートブロックまたはウォーターバスを用いて5分間90℃で混合物を沸騰させます。 10,000 gでFOでサンプルを遠心分離R 1分。マーカータンパク質の5μlの使い捨てチップで20μlのピペットを使用して分析のためのサンプルの14μlを用いて調製したゲルをロードします。
  3. 60分間25ミリアンペアで1つのゲルを実行します。電気泳動工程が完了した後、5分間水及びマイクロ波の1 Lと容器にゲルを移します。
  4. 水中で2時間および脱色のための染色溶液（40％エタノール、10％酢酸および0.1％クマシーブリリアントブルー）を用いてゲルを染色します。

質量分析による6グリカン分析

  1. 以前に説明したように44グリカンを分析します。簡単に言うと、IgG1の-Fcの75μgのは、その後グリカン45のリリースのためにPNGアーゼFによって処理され、トリプシン処理しました。放出されたグリカンを完全メチル化し、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（MALDI-TOFMS）を用いて分析しました。

特別シナリオ7.プロトコルの調整

  1. 15 N-でタンパク質を標識標識アミノ酸（50ミリリットルのトランスフェクションボリュームの）
    1. 単一の滅菌ガラスバイアルに各アミノ酸5mgを分配します。水をオートクレーブし4mlで再懸濁（Tyrが完全にLysおよびPheのとは違って、可溶化されていないことに注意）。 121℃で15分間オートクレーブして溶液を滅菌します。ソリューションは50〜60℃程度に冷却することを許可します。
    2. 50ミリリットルのトランスフェクションのボリュームについては、「3.1一過性トランスフェクションの確立」に応じてステップ3.1.3に従ってください。適切なボリュームを持つ例えば補足資料を参照してください。
    3. トランスフェクションのために、上記のように調製標識アミノ酸残基で置換され、新鮮な培地を使用して「3.一過性トランスフェクションの確立」の手順に従ってください。
    4. トランスフェクションの24時間後、培養希釈の日に、あらかじめ温めておいた培地Bの5.0ミリリットル、あらかじめ温めておいた培地Aの40ミリリットルと（ステップ7.1.1のように調製。上記の）アミノ酸混合物の新たにオートクレーブ処理4ミリリットルのアリコートを撤回そして、1を追加mlのVPAの4.4 mMの最終濃度に希釈新鮮培養培地50mlを調製するためにVPA液のストック溶液を予熱。無菌の血清学的ピペットを用いてトランスフェクション培地にこのメディアを追加します。
    5. 、水溶液中の70％エタノールでフラスコの外側を滅菌した後、安全キャビネット内にトランスフェクト文化を転送する準備希釈媒体を追加し、インキュベーションシェーカーに戻し、フラスコを転送します。
      注：中Aは、化学的に定義され、無血清培地です。これにより、異なる製剤を調製することが可能です。カスタム中に特定のアミノ酸を欠いている製剤を得るためにサプライヤーにお問い合わせください。しかし、我々は、完全なドロップアウト培地を補充した後、浸透圧の調整を必要とするので、ほんの数の選択残基を欠いている培地を使用することを好む、すべてのアミノ酸は除外させることが可能です。私たちは、補足することができ、浸透圧調整を必要としないのLys-Tyrで-Pheのドロップアウト培地を選択しました。フーrthermore、ミディアム自由に培地成分の濃度を共有していない業者。我々は成功を収めてのLys、TyrおよびPheのための100 mg / Lでそれぞれを使用していました。トランスフェクションおよび発現媒体のボリュームが追加されたアミノ酸を考慮して調整する必要があります。ここでは同位体標識については、上記のプロトコルの調整がされています
  2. 小分子でトランスフェクションをサプリメント
    1. オートクレーブ処理水を用いた2-デオキシ-2-フルオロ-L-フコースの100mMのストック溶液を調製し、0.22μmのフィルターを使用してこの溶液を滅菌します。
    2. 50ミリリットルの文化のために、トランスフェクションおよび希釈メディアへのフコースアナログソリューションの（250μMで）125μlを添加します。注：総培養体積のわずか0.25％が、この濃度アカウントに置換基を追加する.Itグリカン処理の小分子阻害剤を使用して発現を改変することが可能であるので、我々はそれ以上の音量調整を行うために無視。ここでは、2デオキシを含むための条件を記述する2-フルオロL-フコース、グリカンのフコシル化の阻害剤。我々は、トランスフェクションおよび希釈培地中の250μMの濃度でフコースアナログを追加することによって、フコシル化で> 90％の減少を発見しました。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

高レベルのタンパク質発現および純度

この最適化された発現系は、グリコシル化タンパク質の高い収率を生じました。典型的なパターンのIgG1-Fcと（ 図1）の式に示されています。この場合は、0日目、粗培地中の可溶性発現の割合を用いて分析されて5日目タンパク質発現までの1日目（希釈）に続いて、トランスフェクションの日とその後の培養の日です。培養物のアリコートを培養希釈後3時間に回収されたようなタンパク質発現の非常に少量の1日目に観察されました。これは、培養培地中で明確な緑の色を表示GFPタグ付きタンパク質を可視化することが容易です。このような増加は、5日目4日目と5日目の間で観察された5日目に2日目からのGFP-FcγRIIIAおよびGFP-ST6GalIの発現のための発現の有意な増加が観察されず、細胞があった<50％実行可​​能なので、培養物は、タンパク質分解を制限するために回収しました。収率（ 表1）...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、S又はHEK293F細胞の一過性トランスフェクションを介してタンパク質発現を示す図です。バーブとMoremen研究室で確立最適なトランスフェクション条件は、高効率のトランスフェクションを達成するために、細胞密度および試薬濃度の重要な組み合わせを採用します。このプロトコルを実装する重要な考慮事項は次のとおりです（一貫性のある文化が倍加時間で）トランスフェクションの前に安定した文化を維持します。積極的に95％を超える細胞生存率に（トランスフェクションの前に/ mlで24時間、1×10 6個の細胞に細胞を希釈することによって達成される）細胞を増殖させるのトランスフェクション。トランスフェクション時の細胞密度は90％培地Aおよび10％B培地を含む培養における生存率> 95％（トランスフェクションの密度）と6×10 2.5〜3.0の間の生細胞/ mlであるべきです。そして、31はそれぞれ、3 / mlのと9μgの/ mlの前のPEI添加にDNAを添加し;メディアコンタで1：24時間トランスフェクション後に培養液1に希釈され、2.2 mMの濃度をもたらすのにi...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

すべての著者は、この原稿に競合する金銭的利益がないことを宣言しています。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この作品は、財政補助金K22AI099165（AWB）により、P41GM103390（KWM）と国立衛生研究所からP01GM107012（KWM）、アイオワ州立大学の生化学、生物物理学＆分子生物学のロイ・J・カーバー部門からの資金によってサポートされていました。この作品の内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしもNIHの公式見解を示すものではありません。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
バイオセーフティキャビネット NuAire, Inc. (英語)CellGard ES NU-S475-400Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet
Incubation ShakerINFORS HTMultitron Cell 
Medium A: FreeStyle Expression Medium ライフテクノロジーズ12338-018
ミディアム B:エクセル 293 無血清ミディアム シグマ14571C 
125 三角フラスコ(ベントキャップ付きCorning Incorporated/Life Sciences431143
250 三角フラスコ(ベントキャップ付きCorning Incorporated/Life Sciences431144
FreeStyle HEK 293F CellsLife TechnologiesR790-07
1 ml 使い捨て血清ピペットFisher Scietific13-676-10B
10 mlディスポーザブル血清ピペットFisher Scietific13-676-10J
25 ml ディスポーザブル血清ピペットFisher Scietific13-676-10K
ピペッター (Pipet-Aid XP)ドラモンドサイエンティフィ161263
トリパン ブルー ソリューション サーモサイエンティフィック SV30084.01
スライドのカウント Bio-Rad145-0011
TC20 自動セルカウンター バイオ・ラッド 145-0102
ポリエチレンイミン(PEI)Polysciences Inc.2396625 mM 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)と150 mM NaCl(pH 7.5)を含む緩衝液に1 mg / mlの濃度で原液を調製します。PEIを完全に溶解します。0.22 μMシリンジフィルターと-20°Cで保存します。
4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)EMDケミカルズ(株)7365-45-9
25 mm シリンジ フィルター、0.22 μMFisher Scietific09-719A
トリサミノメタン (トリス塩基)Fisher ScietificBP152-1
XL1-BlueStratagene222249
TryptonFisher ScietificBP1421-2
酵母抽出物Fluka Analytical 92144
塩化ナトリウムBDH 化学薬品BDH8014
プラスミド精製キットQIAGEN12145
バルプロ酸 (VPA)SIGMAP4543で 220 mM のストック溶液を準備し、滅菌 0.22 mm フィルターを通過して滅菌し、-20 > で保存します。C
遠心分離機Thermo Scientific EW-17707-65
タンパク質 A-セファロース カラムSIGMAP9424
Ni-NTA スーパーフローQIAGEN30430
3-(N-モルフォリノ)プロパンスルホン酸 (MOPS)Fisher ScietificBP308-500
GlycineFisher ScietificBP381-500
10 kDa 分子量カットオフ Amicon®超遠心フィルター ミリポアUFC901096
ドデシル硫酸ナトリウムALDRICHL3771
β-メルカプトエタノールALDRICHM6250
グリセロールSIGMAG5516
プレシジョンプラスプロテイン オールブルースタンダードBio-Rad161-0373
酢酸、氷河 フィッシャーScietific64-19-7
クーマシーブリリアントブルー バイオ・ラッド 161-0406
MALDI-TOFMS ボイジャー・デ・プロ Applied Biosystems
15N 標識 L-チロシンALDRICH332151
15N 標識 L-リジンALDRICH 592900
非標識 L-フェニルアラニンSIGMA-ALDRICHP2126
13C6-グルコースALDRICH389374
2-デオキシ-2-フルオロ-l-フコース サンタクルスバイオテクノロジーsc-283123
) ) ック 水中

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl Microbiol Biotechnol. 72 (2), 211-222 (2006).
  2. Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. Advanced genetic strategies for recombinant protein expression in Escherichia coli. J Biotechnol. 115 (2), 113-128 (2005).
  3. Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnol Prog. 30 (1), 1-18 (2014).
  4. Bandaranayake, A. D., Almo, S. C. Recent advances in mammalian protein production. FEBS Lett. 588 (2), 253-260 (2014).
  5. Varki, A. Essentials of Glycobiology. , Second edition edn, Cold Spring Harbor . (NY). (2009).
  6. Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: diversity, synthesis and function. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (7), 448-462 (2012).
  7. Apweiler, R., Hermjakob, H., Sharon, N. On the frequency of protein glycosylation, as deduced from analysis of the SWISS-PROT database. Biochim Biophys Acta. 1473 (1), 4-8 (1999).
  8. Payne, R. J., Wong, C. H. Advances in chemical ligation strategies for the synthesis of glycopeptides and glycoproteins. Chemical Comm. 46 (1), 21-43 (2010).
  9. Wang, P., et al. Erythropoietin derived by chemical synthesis. Science. 342 (6164), 1357-1360 (2013).
  10. Yamamoto, N., Tanabe, Y., Okamoto, R., Dawson, P. E., Kajihara, Y. Chemical synthesis of a glycoprotein having an intact human complex-type sialyloligosaccharide under the Boc and Fmoc synthetic strategies. J Am Chem Soc. 130 (2), 501-510 (2008).
  11. Huang, W., Giddens, J., Fan, S. Q., Toonstra, C., Wang, L. X. Chemoenzymatic glycoengineering of intact IgG antibodies for gain of functions. J Am Chem Soc. 134 (29), 12308-12318 (2012).
  12. Schwarz, F., et al. A combined method for producing homogeneous glycoproteins with eukaryotic N-glycosylation. Nat Chem Biol. 6 (4), 264-266 (2010).
  13. Smith, E. L., et al. Chemoenzymatic Fc glycosylation via engineered aldehyde tags. Bioconj Chem. 25 (4), 788-795 (2014).
  14. Zou, G., et al. Chemoenzymatic synthesis and Fcgamma receptor binding of homogeneous glycoforms of antibody Fc domain. Presence of a bisecting sugar moiety enhances the affinity of Fc to FcgammaIIIa receptor. J Am Chem Soc. 133 (46), 18975-18991 (2011).
  15. Cox, K. M., et al. Glycan optimization of a human monoclonal antibody in the aquatic plant Lemna minor. Nat Biotech. 24 (12), 1591-1597 (2006).
  16. Jarvis, D. L. Baculovirus-insect cell expression systems. Methods Enzymol. 463, 191-222 (2009).
  17. Li, H., et al. Optimization of humanized IgGs in glycoengineered Pichia pastoris. Nature Biotech. 24 (2), 210-215 (2006).
  18. Palmberger, D., Wilson, I. B., Berger, I., Grabherr, R., Rendic, D. SweetBac: a new approach for the production of mammalianised glycoproteins in insect cells. PLoS One. 7 (4), e34226(2012).
  19. Toth, A. M., Kuo, C. W., Khoo, K. H., Jarvis, D. L. A new insect cell glycoengineering approach provides baculovirus-inducible glycogene expression and increases human-type glycosylation efficiency. J Biotech. 182-183, 19-29 (2014).
  20. Yamane-Ohnuki, N., et al. Establishment of FUT8 knockout Chinese hamster ovary cells: an ideal host cell line for producing completely defucosylated antibodies with enhanced antibody-dependent cellular cytotoxicity. Biotechnol Bioeng. 87 (5), 614-622 (2004).
  21. Dalton, A. C., Barton, W. A. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Sci. 23 (5), 517-525 (2014).
  22. Legendre, J. Y., Szoka, F. C. Cyclic amphipathic peptide-DNA complexes mediate high-efficiency transfection of adherent mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (3), 893-897 (1993).
  23. Wurm, F. M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat Biotech. 22 (11), 1393-1398 (2004).
  24. Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. Transfecting mammalian cells: optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation. Nucleic Acids Res. 24 (4), 596-601 (1996).
  25. Kingston, R. E., Chen, C. A., Okayama, H. Calcium phosphate transfection. Curr Protoc Immunol. Chapter 10, Unit 10.13(2001).
  26. Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (16), 7297-7301 (1995).
  27. Pagano, J. S., McCutchan, J. H., Vaheri, A. Factors influencing the enhancement of the infectivity of poliovirus ribonucleic acid by diethylaminoethyl-dextran. J Virol. 1 (5), 891-897 (1967).
  28. Fraley, R., Subramani, S., Berg, P., Papahadjopoulos, D. Introduction of liposome-encapsulated SV40 DNA into cells. J Biol Chem. 255 (21), 10431-10435 (1980).
  29. Schlaeger, E. J., Christensen, K. Transient gene expression in mammalian cells grown in serum-free suspension culture. Cytotechnology. 30 (1-3), 71-83 (1999).
  30. Longo, P. A., Kavran, J. M., Kim, M. S., Leahy, D. J. Transient mammalian cell transfection with polyethylenimine (PEI). Methods Enz. 529, 227-240 (2013).
  31. Backliwal, G., Hildinger, M., Hasija, V., Wurm, F. M. High-density transfection with HEK-293 cells allows doubling of transient titers and removes need for a priori DNA complex formation with PEI. Biotechnol Bioeng. 99 (3), 721-727 (2008).
  32. Backliwal, G., et al. Rational vector design and multi-pathway modulation of HEK 293E cells yield recombinant antibody titers exceeding 1 g/l by transient transfection under serum-free conditions. Nucleic Acids Res. 36 (15), e96(2008).
  33. Vink, T., Oudshoorn-Dickmann, M., Roza, M., Reitsma, J. J., de Jong, R. N. A simple, robust and highly efficient transient expression system for producing antibodies. Methods. 65 (1), 5-10 (2014).
  34. Unson, C. G. Expression of glucagon receptors in tetracycline-inducible HEK293S GnT1- stable cell lines: an approach toward purification of receptor protein for structural studies. Biopolymers. 90 (3), 287-296 (2008).
  35. Reeves, P. J., Callewaert, N., Contreras, R., Khorana, H. G. Structure and function in rhodopsin: high-level expression of rhodopsin with restricted and homogeneous N-glycosylation by a tetracycline-inducible N-acetylglucosaminyltransferase I-negative HEK293S stable mammalian cell line. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (21), 13419-13424 (2002).
  36. Stanley, P., Narasimhan, S., Siminovitch, L., Schachter, H. Chinese hamster ovary cells selected for resistance to the cytotoxicity of phytohemagglutinin are deficient in a UDP-N-acetylglucosamine--glycoprotein N-acetylglucosaminyltransferase activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 72 (9), 3323-3327 (1975).
  37. Schachter, H. The joys of HexNAc. The synthesis and function of N- and O-glycan branches. Glycoconjugate J. 17 (7-9), 465-483 (2000).
  38. Elbein, A. D., Tropea, J. E., Mitchell, M., Kaushal, G. P. Kifunensine, a potent inhibitor of the glycoprotein processing mannosidase I. J Biol Chem. 265 (26), 15599-15605 (1990).
  39. Rillahan, C. D., et al. Global metabolic inhibitors of sialyl- and fucosyltransferases remodel the glycome. Nat Chem Biol. 8 (7), 661-668 (2012).
  40. Okeley, N. M., et al. Development of orally active inhibitors of protein and cellular fucosylation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (14), 5404-5409 (2013).
  41. Chang, V. T., et al. Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem. Structure. 15 (3), 267-273 (2007).
  42. Barb, A. W., et al. NMR characterization of immunoglobulin G Fc glycan motion on enzymatic sialylation. Biochemistry. 51 (22), 4618-4626 (2012).
  43. Subedi, G. P., Hanson, Q. M., Barb, A. W. Restricted motion of the conserved immunoglobulin G1 N-glycan is essential for efficient FcgammaRIIIa binding. Structure. 22 (10), 1478-1488 (2014).
  44. Barb, A. W., Brady, E. K., Prestegard, J. H. Branch-specific sialylation of IgG-Fc glycans by ST6Gal-I. Biochemistry. 48 (41), 9705-9707 (2009).
  45. Anumula, K. R., Taylor, P. B. A Comprehensive Procedure for Preparation of Partially Methylated Alditol Acetates from Glycoprotein Carbohydrates. Anal Biochem. 203 (1), 101-108 (1992).
  46. Parekh, R. B., et al. Association of rheumatoid arthritis and primary osteoarthritis with changes in the glycosylation pattern of total serum IgG. Nature. 316 (6027), 452-457 (1985).
  47. Yagi, H., et al. Backbone H, C, and N resonance assignments of the Fc fragment of human immunoglobulin G glycoprotein. Biomol NMR Assign. , (2014).
  48. Al-Rubeai, A. B. A. M. Effects of Serum and Growth Factor on HEK 293 Proliferation and Adenovirus Productivity. Animal Cell Tech: Basic & Appl Aspects. 15, 19-23 (2009).
  49. Kaufman, S. M. A. A. R. J. Ch. 13, Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells. New Comprehensive Biochemistry. Makrides, S. C. 38, Elsevier. 411-432 (2003).
  50. Berlec, A., Strukelj, B. Current state and recent advances in biopharmaceutical production in Escherichia coli, yeasts and mammalian cells. J Ind Microbiol Biotechnol. 40 (3-4), 257-274 (2013).
  51. Nothaft, H., Szymanski, C. M. Bacterial protein N-glycosylation: new perspectives and applications. J Biol Chem. 288 (10), 6912-6920 (2013).
  52. Barb, A. W. Intramolecular N-glycan/polypeptide interactions observed at multiple N-glycan remodeling steps through [(13)C,(15)N]-N-acetylglucosamine labeling of immunoglobulin G1. Biochemistry. 54 (2), 313-322 (2015).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト

許可をリクエスト

訂正

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension
Posted by JoVE Editors on 9/08/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension. The Authors section was updated. from:

Ganesh P. Subedi1
Roy W. Johnson2
Heather A. Moniz2
Kelley W. Moremen2
Adam Barb1
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

to

Ganesh P. Subedi1
Roy W. Johnson2
Heather A. Moniz2
Kelley W. Moremen2
Adam W. Barb1
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

タグ

Recombinant Protein ExpressionGlycoprotein PurificationSuspension CultureAffinity PurificationCell Density MonitoringVPA TreatmentProtein Yield AnalysisGlycan Modification

関連記事