BSL-4実験室でのウイルスアッセイの実行は、BSL-2実験室での作業と比較して、追加の安全対策が必要なため、より複雑です。ここでは、BSL-4ラボ内で使用される慣行と手順の概要を示し、適切なクラスIIバイオセーフティキャビネットの使用、廃棄物の管理/廃棄、およびサンプルの除去を示します。
BSL-4実験室でのウイルスアッセイの実行は、BSL-2実験室での作業と比較して、追加の安全対策が必要なため、より複雑です。ここでは、BSL-4ラボ内で使用される慣行と手順の概要を示し、適切なクラスIIバイオセーフティキャビネットの使用、廃棄物の管理/廃棄、およびサンプルの除去を示します。
バイオセーフティーレベル4(BSL-4)封じ込め実験室での作業は時間と細部に大きな注意を払う必要があります。非高結果の病原体を持つBSL-2実験室で行われ、同じ仕事はBSL-4の設定にかなり長い時間がかかります。この増加した時間の要件が原因で、実験室で獲得感染症、潜在的な汚染から作業環境と高結果の病原体の可能性のあるリリースから地域社会からの研究者を保護することを目的としている多数の要因にあります。実験室の内部では、移動が必須のフルボディの安全スーツに取り付けられた空気ホースのために制限されています。また、クラスII安全キャビネット(BSCの)から削除されたすべての項目の消毒が必要です。研究所の専門家は、BSL-4実験室の慣行で訓練する必要があり、それらが実行されているスキルの高い習熟度を示さなければなりません。この記事の焦点は、研究室bを確保するために適切な手順と手法の概要を説明することです手順例として、標準的なウイルスプラークアッセイを使用してiosafetyし、実験精度。具体的には、実験を行う際にBSL-4の環境で安全に作業するための適切な技術が視覚的に強調されます。これらの技術は、次のとおりです。実験では、適切な作業が終了し、クラスII BSCの清掃、廃棄物管理やBSL-4実験室の内部で発生する廃棄物の安全な廃棄、およびBSL-内部から不活性化されたサンプルを除去するためのクラスII BSCを設定しますBSL-2実験室に4研究室。
高結果の病原体を扱う実験者の安全性が(何の感染の予防法や治療法の選択肢が存在しない)最も重要であるように、米国保健社会福祉省は、生物医学における病原体として作業の安全な実施のための施設建設のためのガイドラインとベストプラクティスを確立しましたバイオセーフティの観点1から臨床検査室。法律や規制を通じて、慣行や手順の多くは、これらの病原体との仕事のために従わなければならない必須の要件となっています。米国、簡単に人から人へと伝達される病原体では、高い致死率をもたらし、および/または主要な公衆衛生への影響やバイオテロの可能性を持っている、アレルギー感染の健康/国立研究所の国立研究所に分類されます病(NIH / NIAID)優先度A病原体およびまたは疾病管理予防センター(CDC)バイオテロカテゴリーAエージェント2。また、Hこれらの病原体は、潜在的なバイオテロ剤である質量死傷者や経済、重要なインフラストラクチャ、または公衆の信頼3に壊滅的な影響の可能性を持っている場合IGH-結果の病原体は、ティア1選択薬として分類されます。
BSL-4実験室での研究機関へのアクセスを含むBSL-4の操作は、より高度BSL-2月3日の操作よりも制御されています。例えば、原因で、実質的なスーツのトレーニング要件、豊富な指導の要件、および追加の医療バイオセーフティの前提条件にBSL-2またはBSL-3実験室と比較して、BSL-4実験室へのアクセスを得るために、実質的にはより困難です。また、BSL-2またはBSL-3施設4-6対BSL-4施設でより多くの物理的なセキュリティの障壁は、一般的にあります。 BSL-4入口と出口の手続き上の私たちの最初の記事で概説したように、研究室のスタッフは、BSL-4実験室7に入るために修飾するために広範囲の訓練、心理的スクリーニングを受けます。 WBSL-4実験室をithin、感染症やミスの危険性が確立された手順に従うことによって回避または軽減されます。研究は、最小限のマルチタスクや気晴らしで、注意深く慎重に進まなければなりません。正圧スーツに体を曲げすることは困難であり、フェースシールドは、顕微鏡などの手順を制限することができます。かさばる手袋は、このような小物を取り扱うまたはチューブを標識として微細運動タスクのパフォーマンスを低下させます。 BSL-4実験室で費やされる時間を最小限に抑えるために、研究室の専門家は、BSL-2実験室で先に行われ、その後、タスク(複数可)の完成のためのBSL-4実験室の中にこれらの物質を輸送することができる手順を識別するために、作業手順を確認してください。 BSL-2実験室でさらに処理するために物質を除去すると、材料が固定され、密封された第2の容器内のBSL-4実験室から削除されます。除去する必要があるかもしれないサンプルの例としては、酵素結合immunosorbeによって分析される感染物質の固定されたプレートまたはチューブNTアッセイ(ELISA)、免疫蛍光アッセイ(IFA)、またはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)。
BSL-2実験室におけるものと比較して、BSL-4実験室に必要な個人用保護具によって課される大きな物理的な制限に加えて、細胞培養プレートで高結果の病原体の不活性化と廃棄物処理のための手順は以下の病原性ウイルスのために必要とされるものよりも厳しいですBSL-2実験室で研究。最低でも、これらの方法は、CDCの要件を満たさなければなりません。例えば、汚染された細胞培養プレートおよび他の材料は、中性緩衝ホルマリンのような化学試薬を用いて不活性化することができます。処理された細胞培養プレートまたはチューブは、液体殺菌剤が充填されたダンクタンクを介してホルマリンを含有するヒートシール用袋に入れ、実験室から除去されます。廃棄バケットは消毒液を充填し、殺菌剤は、一時的に、実験中およびDISIために発生する廃棄物を受け取るために使用されるスプレー、手袋をnfectingそれぞれ、安全キャビネット表面や器具を洗浄します。記載されている濃度の第四級アンモニウム消毒液は、すべての米国BSL-4実験室(バールJ、私信、2015)のゴールドスタンダードと考えられています。廃棄物のバケツからの固体廃棄物は、汚染の可能性を排除するためにオートクレーブ処理されます。
視覚的に一般的なBSL-4手続きのワークフローと限界を実証するための努力で、我々は一般的に使用されるウイルスの手順の例として、標準的なウイルスのプラークアッセイを使用していました。ウイルスアッセイ法は、一般的に記載されているが、我々は、このプロトコルで実験室の人員の安全を確保するために使用されるバイオセーフティ手順を強調する。プラークアッセイ技術の8,9の追加の背景については、前の古典的なプラークアッセイの視覚化を参照してください。
ここで紹介する手順は、CDC 1で概説BMBL仕様に従ってください。しかし、提示されるプロトコルは、IRF-フレデリックに固有。各BSL-4施設は、BSL-4実験室内実験の実行に影響を与える別の標準作業手順書(SOP)や操作の方法があります。プラークアッセイの廃棄物の流れの管理と実行のための代替手順では、これらの研究室の管理や操作に基づいて異なる場合があります。それにもかかわらず、BSL-4の内部クラスIIキャビネットで作業を行うためのBSL-4スーツの研究室や手順の設定の一般的な理解は、環境は、高リスクの病原体の研究を検討する際の科学者が制約と安全性への影響を理解するのに役立ちます。 BSL-4実験室での作業を取り巻く困難の外の共同研究者の意識向上が調整された期待と研究コミュニティの医療対策の開発により容易に導くことができます。
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1.研究室のエントリ
BSL-4実験室のクラスII安全キャビネットの調製
3.例:プラークアッセイ
4.廃棄物の処理および清掃楽器や安全キャビネットの
<オール>5.オートクレーブ廃棄物
6.例:固定とプラークアッセイの染色
7. BSL-4実験室からのサンプルを削除します
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BSL-4実験室内の以下の適切な手順は、アッセイの安全かつ効果的な完了を確保するために重要です。完成した日ごとの内部チェックリスト( 図1)を参照することにより、研究室のスタッフは、その機器が完全に動作していることを確認します。 BSCの中央に適切な体の位置は、実験が、最適な空気流条件( 図2)で行われることを保証します。ウイルスサンプルを連続プレート当たり30-300プラーク( 図3A)を有するプレートを取得し、ウイルス力価( 図3B)を決定するために希釈されます。多くの要因は、宿主細胞株のウイルス向性、接種技術、ウイルス増殖は、適切な希釈範囲、オーバーレイ選択8の条件を含むプラークの形成に影響を与えます。手順中のBSCで発生した廃棄物が適正にする前にオートクレーブ処理することにより、従来BSCと再びからの除去に消毒されていますBSL-4環境を残します。これらの手順に従うことで、何の実験室に取得した感染は、IRF...
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BSL-4実験室での作業はかなりの時間と細部への追加の注意を払う必要があります。この環境での作業のいずれかのタイプがよく徹底し、訓練を受けた、と良心的な人が必要です。アッセイは、実験室での労働者が訓練を受けなければならない、いくつかの主要な概念を伴うような標準的なウイルスプラークアッセイは、BSL-4実験室で高結果の病原体を扱うための一般的な手順の正確なモデルを提供します。
最初の主要な概念は、高結果の病原体のための第一の格納容器として機能クラスII BSC、中の安全慣行の適切な使用およびアプリケーションです。クラスII BSCの機能が大幅に個人への曝露リスクを制限する慣行を決定する方法を理解します。クラスII BSC内の作業ゾーン全体の汚染地域(「汚れた側」)へのクリーンエリア(「クリーンサイド」)からの作業の流れは、クロスコンタミネーション11を回避するのに役立ちます。清潔で汚染された材料と補遺IEはクリーンなアイテムを超える汚染されたアイテムの移動を制限するように分離する必要があります。
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著者らは開示するものは何もない。
この出版物の内容は、必ずしも米国保健社会福祉省(DHHS)または著者と提携する機関や企業の見解や方針を反映しているわけではありません。この研究は、バテル記念研究所と米国国立アレルギー感染症研究所(NIAID)との一次契約を通じて部分的に資金提供されました。HHSN272200700016I。M.R.H.、D.P.、L.B.、K.J.、J.W.は、バテル記念研究所の従業員としてこの仕事をしました。この作業を行ったバテル記念研究所の下請け業者は、MRI Globalの従業員としてのS.M.です。MGLはLovelace Respiratory Research Institute、Inc.の従業員として。J.H.K.は、Tunnell Government Services, Inc.の従業員です。
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| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Micro-Chem Plus | National Chemical Laboratories | 255 | |
| エタノール | フィッシャー | BP2818500 | |
| 2 ml 96 ディープウェルプレート | フィッシャー | 278743 | |
| 10 ml 血清ピペット | フィッシャー | 13-678-11E | |
| 25 ml 血清ピペット | フィッシャー | 13-678-11 | |
| 6 ウェルプレート | フィッシャー | ||
| クリスタルバイオレット | シグマ | HT90132-1L | |
| 10%ニュートラルバッファーホルマリン | フィッシャー22-050-105 | ||
| ガカンス | フィッシャー50-702-2000 | ||
| 20 μl ピペットチップ | Fisher | 21-402-550 | |
| 200 μl ピペットチップ | フィッシャー | 21-402-561 | |
| 1,000 μl ピペットチップ | フィッシャー | 21-402-581 | |
| DMEM | ロンザ | 12-604Q | |
| FBS | シグマ | F2442-500mL | |
| ペニシリン/ストレプトマイシン | ロンザ | 17-602E | |
| 2x EMEM | 品質 生物学的 | 115-073-101 | |
| ピペットー | ドラモンド | 4-000-101 | |
| 1,000 μl ピペット | レイニン | L-1000XLS+ | |
| 200 &l ピペット | レイニン | L-200XLS+ | |
| 12ウェル、マルチチャンネル200 μl ピペッター | レイニン | L12-200XLS+ | |
| 8-ウェル、マルチチャンネル 1,000 μl ピペッター | レイニン | LA8-1200XLS | |
| アトストエクスプレス | メディカルサプライ | ||
| オートクレーブ | Getinge | GEB 2404 AMB-2 | |
| オートクレーブ バッグ | フィッシャー | 01-828E | |
| 2,000 ml ビーカー | フィッシャー | 02-591-10H | |
| オートクレーブ トレイ | フィッシャー | 13-359-20B | |
| ピペット トレイ | フィッシャー | 13-361-5 | |
| 37 °Cインキュベータ | フィッシャーWU-39321-00 | ||
| バイオハザード缶 | ラバーメイドコマーシャル | FG614500 RED | |
| オートクレーブテープ | フィ | ッシャー15-903IRF | |
| 施設製の | オートクレーブロッド | / A | |
| ライトボックス | フィ | ッシャーS11552 | |
| ヒートシーラー | フィッシャー NC9793612 | ||
| ヒートシールポーチ | フィ | ッシャー01-812-25H | |
| バイオハザードバッグ | フィ | ッシャー01-828E |
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One of the authors names was corrected from:
Nicole Joselyn
to:
Nicole Josleyn