方法論記事

（A）BSL-4実験室での安全上のご注意と操作手順：2.一般プラクティス

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DOI：

10.3791/53600

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2016年10月3日

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1Integrated Research Facility at Frederick, National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID), National Institutes of Health (NIH)

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サマリー

BSL-4実験室でのウイルスアッセイの実行は、BSL-2実験室での作業と比較して、追加の安全対策が必要なため、より複雑です。ここでは、BSL-4ラボ内で使用される慣行と手順の概要を示し、適切なクラスIIバイオセーフティキャビネットの使用、廃棄物の管理/廃棄、およびサンプルの除去を示します。

要約

バイオセーフティーレベル4（BSL-4）封じ込め実験室での作業は時間と細部に大きな注意を払う必要があります。非高結果の病原体を持つBSL-2実験室で行われ、同じ仕事はBSL-4の設定にかなり長い時間がかかります。この増加した時間の要件が原因で、実験室で獲得感染症、潜在的な汚染から作業環境と高結果の病原体の可能性のあるリリースから地域社会からの研究者を保護することを目的としている多数の要因にあります。実験室の内部では、移動が必須のフルボディの安全スーツに取り付けられた空気ホースのために制限されています。また、クラスII安全キャビネット（BSCの）から削除されたすべての項目の消毒が必要です。研究所の専門家は、BSL-4実験室の慣行で訓練する必要があり、それらが実行されているスキルの高い習熟度を示さなければなりません。この記事の焦点は、研究室bを確保するために適切な手順と手法の概要を説明することです手順例として、標準的なウイルスプラークアッセイを使用してiosafetyし、実験精度。具体的には、実験を行う際にBSL-4の環境で安全に作業するための適切な技術が視覚的に強調されます。これらの技術は、次のとおりです。実験では、適切な作業が終了し、クラスII BSCの清掃、廃棄物管理やBSL-4実験室の内部で発生する廃棄物の安全な廃棄、およびBSL-内部から不活性化されたサンプルを除去するためのクラスII BSCを設定しますBSL-2実験室に4研究室。

概要

高結果の病原体を扱う実験者の安全性が（何の感染の予防法や治療法の選択肢が存在しない）最も重要であるように、米国保健社会福祉省は、生物医学における病原体として作業の安全な実施のための施設建設のためのガイドラインとベストプラクティスを確立しましたバイオセーフティの観点1から臨床検査室。法律や規制を通じて、慣行や手順の多くは、これらの病原体との仕事のために従わなければならない必須の要件となっています。米国、簡単に人から人へと伝達される病原体では、高い致死率をもたらし、および/または主要な公衆衛生への影響やバイオテロの可能性を持っている、アレルギー感染の健康/国立研究所の国立研究所に分類されます病（NIH / NIAID）優先度A病原体およびまたは疾病管理予防センター（CDC）バイオテロカテゴリーAエージェント2。また、Hこれらの病原体は、潜在的なバイオテロ剤である質量死傷者や経済、重要なインフラストラクチャ、または公衆の信頼3に壊滅的な影響の可能性を持っている場合IGH-結果の病原体は、ティア1選択薬として分類されます。

BSL-4実験室での研究機関へのアクセスを含むBSL-4の操作は、より高度BSL-2月3日の操作よりも制御されています。例えば、原因で、実質的なスーツのトレーニング要件、豊富な指導の要件、および追加の医療バイオセーフティの前提条件にBSL-2またはBSL-3実験室と比較して、BSL-4実験室へのア....

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プロトコル

1.研究室のエントリ

  1. 前BSL-4実験室への参入実験のためのBSL-2実験室（ 例えば 、細胞、培地、および消耗品）からすべての電源を収集します。
  2. （参照7に詳細に概説）BSL-4エントリの手順を実行します。

BSL-4実験室のクラスII安全キャビネットの調製

  1. 一度BSL-4実験室の内部で、毎日の内部チェックリスト（ 図1）が完了していることを確認します。チェックリストは、以前に記入し、ウイルスが使用されるかを示すされていない場合は、チェックリストを完了します。チェックリストは既に完了している場合は、名前を追加し、そのウイルスがリストに使用されます。
  2. （5％重四級アンモニウム消毒液で、例えば 、n-アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロライド、n-アルキルジメチルエチルベンジルアンモニウム（サッシなど）BSCの内部全体を下方噴霧によるクラスII BSCを清掃塩化物または使用されているエージェントの他の消毒剤の適切な）とペーパータオル10,11で拭いてください。粘着性の消毒液を除去するために、キャビネット及びサッシの内側70％エタノール溶液を噴霧します。
  3. 着席した場合、キャビネットの背面に到達することができることと研究室の専門家の顔が前面開口（

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結果

BSL-4実験室内の以下の適切な手順は、アッセイの安全かつ効果的な完了を確保するために重要です。完成した日ごとの内部チェックリスト（ 図1）を参照することにより、研究室のスタッフは、その機器が完全に動作していることを確認します。 BSCの中央に適切な体の位置は、実験が、最適な空気流条件（ 図2）で行われることを保証します。ウイルスサンプルを連続プレート当たり30-300プラーク（ 図3A）を有するプレートを取得し、ウイルス力価（ 図3B）を決定するために希釈されます。多くの要因は、宿主細胞株のウイルス向性、接種技術、ウイルス増殖は、適切な希釈範囲、オーバーレイ選択8の条件を含むプラークの形成に影響を与えます。手順中のBSCで発生した廃棄物が適正にする前にオートクレーブ処理することにより、従来BSCと再びからの除去に消毒されていますBSL-4環境を残します。これらの手順に従うことで、何の実験室に取得した感染は、IRF.......

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ディスカッション

BSL-4実験室での作業はかなりの時間と細部への追加の注意を払う必要があります。この環境での作業のいずれかのタイプがよく徹底し、訓練を受けた、と良心的な人が必要です。アッセイは、実験室での労働者が訓練を受けなければならない、いくつかの主要な概念を伴うような標準的なウイルスプラークアッセイは、BSL-4実験室で高結果の病原体を扱うための一般的な手順の正確なモデルを提供します。

最初の主要な概念は、高結果の病原体のための第一の格納容器として機能クラスII BSC、中の安全慣行の適切な使用およびアプリケーションです。クラスII BSCの機能が大幅に個人への曝露リスクを制限する慣行を決定する方法を理解します。クラスII BSC内の作業ゾーン全体の汚染地域（「汚れた側」）へのクリーンエリア（「クリーンサイド」）からの作業の流れは、クロスコンタミネーション11を回避するのに役立ちます。清潔で汚染された材料と補遺IEはクリーンなアイテムを超える汚染されたアイテムの移動を制限するように分離する必要があります。

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この出版物の内容は、必ずしも米国保健社会福祉省(DHHS)または著者と提携する機関や企業の見解や方針を反映しているわけではありません。この研究は、バテル記念研究所と米国国立アレルギー感染症研究所(NIAID)との一次契約を通じて部分的に資金提供されました。HHSN272200700016I。M.R.H.、D.P.、L.B.、K.J.、J.W.は、バテル記念研究所の従業員としてこの仕事をしました。この作業を行ったバテル記念研究所の下請け業者は、MRI Globalの従業員としてのS.M.です。MGLはLovelace Respiratory Research Institute、Inc.の従業員として。J.H.K.は、Tunnell Government Services, Inc.の従業員です。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Micro-Chem PlusNational Chemical Laboratories255
エタノールフィッシャーBP2818500
2 ml 96 ディープウェルプレートフィッシャー278743
10 ml 血清ピペットフィッシャー13-678-11E
25 ml 血清ピペットフィッシャー13-678-11
6 ウェルプレートフィッシャー
クリスタルバイオレットシグマHT90132-1L
10%ニュートラルバッファーホルマリンフィッシャー22-050-105
ガカンスフィッシャー50-702-2000 
20 μl ピペットチップFisher21-402-550
200 μl ピペットチップフィッシャー21-402-561
1,000 μl ピペットチップフィッシャー21-402-581
DMEMロンザ12-604Q
FBSシグマF2442-500mL
ペニシリン/ストレプトマイシンロンザ17-602E
2x EMEM品質 生物学的115-073-101
ピペットードラモンド4-000-101
1,000 μl ピペット レイニン L-1000XLS+
200 &l ピペット レイニン L-200XLS+
12ウェル、マルチチャンネル200 μl ピペッターレイニンL12-200XLS+
8-ウェル、マルチチャンネル 1,000 μl ピペッターレイニンLA8-1200XLS
アトストエクスプレスメディカルサプライ 
オートクレーブGetingeGEB 2404 AMB-2
オートクレーブ バッグフィッシャー01-828E
2,000 ml ビーカーフィッシャー02-591-10H
オートクレーブ トレイフィッシャー13-359-20B
ピペット トレイフィッシャー13-361-5
37 °CインキュベータフィッシャーWU-39321-00
バイオハザード缶ラバーメイドコマーシャルFG614500 RED
オートクレーブテープフィッシャー15-903IRF
施設製のオートクレーブロッド/ A
ライトボックスフィッシャーS11552
ヒートシーラーフィッシャー NC9793612 
ヒートシールポーチフィッシャー01-812-25H
バイオハザードバッグフィッシャー01-828E
140675トラMMM12192ーN

参考文献

  1. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. 5th edn. Chosewood, L. C., Wilson, D. E. , , U.S. Dept. of Health and Human Services. Washington, D.C. Available from: http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/ (2009).
  2. Bioterrorism agents/diseases by category. , Centers for Disease Control and Prevention. Atlanta, GA, USA. Available from: http://emergency.cdc.gov/agent/agentlist-category.asp (2014).
  3. Executive order 13546 -- Optimizing the security of Biologi....

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Formal Correction: Erratum: Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 2. General Practices
Posted by JoVE Editors on 12/05/2016. Citeable Link.

A correction was made to the authors section in: Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 2. General Practices

One of the authors names was corrected from:

Nicole Joselyn

to:

Nicole Josleyn

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