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方法論記事

代替プロモーターの使用およびマウスBcrp1の転写調節を発見する方法

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DOI：

10.3791/53827

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2016年5月27日

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1Greenebaum Cancer Center, University of Maryland School of Medicine, 2Pharmaceutical Sciences, University of Maryland School of Pharmacy, 3Baltimore VA Medical Center, 4Membrane Transport and Biopharmaceutics, School of Pharmaceutical Sciences, Kanazawa University, 5Obstetrics, Gynecology and Reproductive Science, University of Pittsburgh, 6Magee Women's Research Institute, 7Obstetrics, Gynecology, Perinatal Research Branch (NICHD), Wayne State University School of Medicine, 8Medicine, University of Maryland School of Medicine, 9Pathology, University of Maryland School of Medicine, 10Pharmacology, University of Maryland School of Medicine, 11Experimental Therapeutics, University of Maryland School of Medicine

この記事について

サマリー

例として、マウスABCトランスポーターBcrp1（ABCG2）を用いて、 イン・シリコプロトコルは、マウス組織において発現される遺伝子に代替プロモーターの使用を検出するために、レポーターアッセイを用いて同定された代替的なプロモーターの機能性を評価するために提示されています。

要約

通常非翻訳 - - 第一のエキソンの異なる組織における遺伝子発現は、しばしば、ユニークでmRNAの合成をもたらす代替的なプロモーターによって制御されます。 E1U、E1A、E1B、およびE1C：Bcrp1（ABCG2）、ABCトランスポーター乳癌耐性タンパク質（BCRP、ABCG2）のマウスオルソログは、生産対応する4つの代替最初のエクソンによって指定された少なくとも4つの代替のプロモーターを持っています。本明細書において、 インシリコプロトコルはBcrp1ための別のプロモーターの使用を予測するために提示されています。さらに、レポーターアッセイ法は、代替プロモーターのためのレポーター構築物を生成するために上流に同定されている代替の第一エキソンの推定プロモーターの機能性を決定するために記載されています。

概要

もっとヒト遺伝子の半分以上が、代替プロモーター1により調節されます。各代替プロモーターは、他の代替的なプロモーターのものと異なっていてもよい調節要素を含むことができます。つの組織に利用されるプロモーター（複数可）は、別の組織で使用されるものと異なってもよいです。例えば、所定のシグナル伝達経路の活性化はつの組織において利用遺伝子のための代替のプロモーターを誘発する、まだに影響を及ぼさない、または別の組織に利用されるのと同じ遺伝子についての別個の代替プロモーターを抑制することができる可能性があります。

Bcrp1遺伝子の発現は、別のプロモーターにより支配されます。 Bcrp1は、ヒト乳癌耐性タンパク質（BCRP）遺伝子のマウスオルソログです。 BCRPは、ATP結合カセット（ABC）トランスポーター、正式に指定さABCG2 2、3です。頂端細胞膜タンパク質として、BCRP / Bcrp1機能は、天然および生体異物基質の広範囲を流出します 3、4。 12 -ヒトとマウスでは、BCRP / Bcrp1は非常に、肝臓（毛細胆管）、腸、および腎臓、ならびに胎盤、脳や精巣2などの血液-組織障壁を持つ器官、5などの薬理学的に関連する器官で発現しています。がん幹細胞を含む造血細胞および他の幹細胞におけるBCRP / Bcrp1の発現は、生体異物および癌化学療法薬3に、これらの細胞の耐性を付与することができます。

初期の研究では、正常および新生物細胞におけるBCRP発現の調節を理解するために、BCRP mRNAの5 'cDNA末端の迅速増幅（5'-RACE）分析は、その正確な転写開始部位13を決定しました。だけでなく、見られる複数の転写開始部位がありました。また、BCRPで未翻訳である第一エクソン、の3つの代替の形態があったが発生しました。これらの代替最初のエクソン - 指定のE1a、E1bを、E1Cは - 人間の種々の組織において異なって発現させました。二つの追加の第1エクソン変異体は、BCRP 13の第2エクソンを用いてヒトESTデータベースのBLAST検索で発見されました。 4試合は、上流E1uと命名したエクソン2から第一エキソン> 70キロバイトを明らかにしました。 4その他の試合ではE1- 13と命名した完全に第一エクソンを欠いていたBCRPのmRNAを、明らかにしました。 代替リーダーエクソンの存在は、代替的なプロモーターの使用14の現れであると考えられます。

マウスでは、Bcrp1の4代替最初のエキソンは異なるマウス組織におけるBCRP 1転写を支配する代替プロモーターに対応することができることが記載されています。これらのエキソン/プロモーターはE1U、E1A、E1BとE1Cを指定し、約70、58、15、および上流Bcrp1エクソン2 5、15から5キロバイトに位置しています。 E1A mRNAのアイソフォームはムリンで支配的であることが見出されましたE E1Bアイソフォームは、骨髄5、15マウス腸、胎児肝臓細胞、および赤血球前駆細胞において発現されたのに対し、造血幹細胞、心臓、肺、脾臓、および脳。上流E1Bからのプロモーターが、ホスホサイクリックAMP応答エレメント結合タンパク質（P-CREB）とその代替に固有のCREB応答要素によって、少なくとも部分的に調節、マウス腸内Bcrp1転写を支配する主要な代替プロモーターであることが示されましたBcrp1プロモーター16。 E1CのmRNAアイソフォームは主として成体マウスの肝臓および腎臓5で表されます。 E1Uアイソフォームは、それが優勢なアイソフォームは5発現しているマウスの精巣を除き、試験したほとんどの組織では検出不能です。 （それは後期精子細胞4を保護することができる輸精内皮、中）体細胞（内皮タイトジャンクション、管周囲筋様細胞、およびセルトリ細胞）と生殖細胞の両方で発見されたBcrp1は、ラットの精巣で発現しました。 REGイオンは、上流E1Uからステロイド合成因子1（SF-1）5のための機能的応答要素が含まれています。 Bcrp1 mRNAおよびタンパク質は、著しくマウスセルトリ細胞におけるBcrp1発現はSF-1 5によって制御されることを示唆し、セルトリ細胞特異的SF-1ノックアウトマウスの精巣で低減されます。

プロトコルは、インシリコ Bcrp1の代替最初のエクソンを検出し、識別された代替最初のエクソンから上流の推定プロモーターのためのルシフェラーゼ・レポーターアッセイを確立するために、詳細な方法を提示しました。

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プロトコル

マウスESTデータベースのBLAST解析を用いたBcrp1の代替第一エキソンのインシリコ予測では 1

注：このプロトコルは、自分を確認するためにゲノム配列に一致するEST配列を整列する方法を次にBcrp1の2エクソン配列類似性とのESTのためのマウス発現配列タグ（EST）データベースを検索する方法を説明します（翻訳開始部位を含む）と、 Bcrp1エクソン2の5 '末端にマウスBcrp1遺伝子相対的な位置。

  1. Ensemblのゲノムブラウザ17の検索窓へのmRNA参照配列のID（NM_011920.3）を入力することにより、マウスのBcrp1エクソン2のシーケンスを取得し、をクリックして「GO。」次の画面で、完全長配列（16エクソンが含まれている）を選択します。
    1. 次の画面（「トランスクリプトベースの表示」）では、「16エキソン」を選択します。これは、Bcrp1のすべてのエクソンの配列を含む画面が表示されます。 Bcrp1のエクソン2は、5」をお読みます9;。-AAAGGC ... TATCAA-3 '」は、得られた結果は、参照18に示したものと同様となります。
    2. 「ダウンロードシーケンス」オプションをクリックします。次の画面では、FASTA形式を選択して、[]をクリックし、「プレビュー」。次の画面で、クリップボードにエクソン2のプレビューシーケンスをコピーします。
  2. 国立バイオテクノロジー情報センター（NCBI）のウェブサイト20上のBLASTのホームページ19に移動します。
    1. 「マウス」ゲノムを選択します。クエリボックスに、クリップボードからエクソン2配列を貼り付けます。
    2. データベースのドロップダウンから "のEST」を選択し、最適化「高度に類似した配列、"とし、選択した「BLAST」を実行時間は数分かかります。 BLASTの実行が完了すると、「結果」ページが表示されます。
    3. 「結果」ページの「説明」小見出しの下で、「ALL、 "その後"ダウンロード、 "その後" FASTA（完全を選択「ドロップダウンリストで、次に選択し、「シーケンス）続行 ".txtファイルが表示されます;。オープンでクリップボードにファイル全体をコピーする.txtファイルは、マウスBcrp1のエクソン2と高い配列類似性を有するすべてのESTの配列を含みます。しかしないBcrp1遺伝子にエクソン2に関連してそれらの位置。
      注：2015年4月15日に行われた分析は、Bcrp1エクソン2と整合し、これらを表1に記載されている14マウスのESTを同定しました。
  3. Bcrp1遺伝子に2エキソンの5 'であるEST配列の位置を特定します。マウスBcrp1遺伝子は染色体6コンティグNC_000072.6（：372099104 GI）に位置しています。
    1. 「専門ブラスト」小見出しBLASTのホームページでは、選択して "BLAST（bl2seq）を使用して、2つ（またはそれ以上）の配列を整列させます。」
    2. クエリボックスにクリップボードからテキストフ​​ァイルを貼り付けて、対象配列ボックスに372099104を入力します。プログラムの下で、「非常に類似した配列 "のために最適化選択、および実行BLAST。
    3. 結果ウィンドウが表示されたら、「線形」ウィンドウで、「グラフィックス」をクリックしてグラフィカルにアライメントを表示します。左右の矢印を使用し、Bcrp1 / ABCG2との配列アラインメントに集中するズーム。
    4. 配列アラインメントを保存：「説明」ボックスに「ALL」を選択し、「ダウンロード」のドロップダウンの下で」、表（CSV）をヒット "を選択し、をクリックして「続けます」。このファイルには、Bcrp1エクソン2の配列アラインメントおよびマウス染色体6コンティグにおけるヌクレオチドの番号に対する相対Bcrp1 EXON2に配列類似性を有するすべてのEST配列のアラインメントが含まれています。各完全なEST配列は、Bcrp1エクソン2と重複する配列を含む2のエキソン領域5 'および3'にまたがる複数のアラインメントを生成することがあります。
    5. エクソン2の5 '末端の位置は第6染色体コンティグに58655638をヌクレオチド配列に対応するように、としてこれを指定しますその後、1、および58655638に各ESTの5 'の部分配列の位置を計算します。 14のESTの結果を表1に示します。
      注：潜在的な最初のエクソンとして（ すなわち 、負の塩基値を持つ）1の5 'にあるEST配列を解析するように注意してください。例えば、 表1（AI647825及びAI664571）に示すBcrp1エクソン2と整合ESTの二つに残りの配列は、エクソン2には'3でした。

2.評価Bcrp1の代替プロモーター機能

  1. レポーターのデザインはBcrp1 E1U、E1A、E1BとE1C促進のために構築します
    1. ESTデータベースの検索から得られたE1Uの配列を用いて、+1としてE1Uの最初の5 'ヌクレオチドを​​指します。
    2. 細菌人工染色体（BAC）の上流Bcrp1 / ABCG2遺伝子配列との配列を少なくとも100キロバイト含まれているマウス染色体6のクローンを得ますBcrp1 / ABCG2遺伝子（材料および機器のリストを参照してください）​​。
      1. このようなルシフェラーゼレポータープラスミドをpGL3-Basicのような適切なレポーターベクターを特定します。
      2. レポーターベクター中の複数のクローニング部位を決定します。 KpnI、SacIで、Mlu1、NheI部位をSmaI、XhoIを、BglIIおよびHindIIIでは、5 'から3'方向のpGL3-Basicベクターのマルチクローニングサイト内の制限エンドヌクレアーゼ部位です。
        注：消化部位の配列は、制限酵素を生産する企業の商品カタログから入手可能です。
      3. このようなDNA5などのソフトウェアプログラムを使用してE1UエクソンとE1Uの2キロバイトの5 '領域内のすべての消化部位を特定します。 E1Uまたは2キロバイト上流地域で発見されていないのpGL3-Basicのマルチクローニングサイト内の少なくとも2つの消化部位を特定します。
        注意：そのインサート・ウィルを保証するために、逆方向プライマーのために選択された1の上流にあるフォワードプライマーのためのマルチクローニングサイトの制限部位を選択してくださいlは適切な方向にあります。
    3. 前方に準備し、（材料および装置のリストを参照してください）​​商業遺伝子/プライマー合成サービスまたはプライマーの選択ソフトウェアを使用して、選択したpGL3-基本的なマルチクローニングサイトの制限エンドヌクレアーゼ部位のための配列を含むPCR用リバースプライマー。 E1UシーケンスとE1U配列内リバースプライマーから〜2キロバイト上流に位置するフォワードプライマーを選択します。著者で使用されるプライマー「前作はフォワードプライマーでSacI部位、およびリバースプライマーでNheI部位を組み込み、最初の5と64に約-1906からゲノム領域を増幅した」として指定されたE1Uのヌクレオチド+ 1（上記ステップ2.1.1を参照）、および参照16に設けられています。
      1. PCRは0.01 BACμgの1に、これらのプライマーを用いてE1Uゲノム領域を増幅し、PCRマスターミックスはで変性した高忠実度のTaqポリメラーゼを（材料および機器のリストを参照してください）を含みます使用したプライマーの融解特性に基づいて、30秒間95℃、その後35〜40 72℃（2分）での伸長によるPCRのサイクル、アニーリングおよび融解温度。
        注：高忠実度Taqポリメラーゼの使用は、高いGC含量を有する配列決定プロモーター領域のために不可欠です。そのようなテンプレートとしてBACとして大きなゲノムDNA断片を用いる場合には、ゲノムDNAの二次構造は、それが困難なPCRプライマーが結合するために作ることができます。この問題が発生した場合、長いゲノムDNA鋳型は、PCR反応の前に超音波処理することによって穏やかに剪断された場合に、より良好なPCR結果を得ることができます。
      2. 0.8％TAEアガロースゲル電気泳動を使用して、1kbのDNAラダーと比較することにより、増幅されたPCR産物の長さを確認します。
    4. 得られたPCR産物とのpGL3-Basicベクターを消化、制限を使用すると、前方に導入された制限消化部位に対して特異的なエンドヌクレアーゼおよびインごとにリバースプライマー制限消化酵素で供給tructions。
      1. キットのプロトコール21以下、（材料および機器のリストを参照してください）商業SVジェルを使用して消化反応やPCRクリーンアップシステムキットを精製します。
        1. アガロースゲル電気泳動を使用して未切断ベクターに対してそれを比較することにより、ベクターの消化および線形化を確認し、その後切断し、消化したベクターDNAバンドを精製します。 （材料および機器のリストを参照してください）​​精製したPCR産物およびUV分析法を用いて精製したベクターの濃度を測定します。
    5. 精製し、制限酵素を連結することによりE1Uレポーター構築物を準備したPCR産物とのpGL3-Basicのホタルルシフェラーゼレポーターベクター消化（レポーターアッセイキットに含まれているが、材料および装置のリストを参照してください）​​インサートで：11、21および31のベクトル比を、これによりE1U rを生成し、キットの指示書22に従って「T4 DNAリガーゼ迅速ライゲーションキット」を用いてpGL3-E1Uという名前eporter構築物。
      1. （材料および機器のリストを参照してください）​​クローンTAクローニングキットの指示に従ってたpGL3-E1Uを展開する細菌を形質転換するためのpGL3-E1Uプラスミドを使用してください。
      2. 配列分析により、インサートの向きと忠実度を確認してください。
    6. 記者がE1U用と同様の方法論を用いてE1A、E1BとE1Cのために構築する準備をします。セクション2.1.5.2のように配列決定によるインサートの忠実度を確認してください。
      注：E1Aのプロモーターの挿入は、E1BとE1Cは、約-1875 / + 10、-1847 / + 60、およびE1A、E1Bの（1として指定された）最初の5 'ヌクレオチドへ-1904 / + 83の相対的でなければなりませんまたはそれぞれE1C、。
  2. レポーターアッセイ法
    注：レポーターアッセイの一般的な戦略：遺伝子の推定プロモーター（5 '上流領域）」reporteが含まれている空の「レポーター」、ベクターのマルチクローニングサイトに挿入され、多重クローニング部位の下流R遺伝子」（ 例えば 、ホタルルシフェラーゼ）。ベクターは、次いで、目的の遺伝子を発現する真核細胞にトランスフェクトされる。活性化する必要があり、これらの細胞中の目的の遺伝子の発現を促進するトランス作用因子トランスフェクトされたレポーターベクター中のプロモーター、容易に発光アッセイを用いて定量することができるホタルルシフェラーゼの発現を引き起こします。
    1. レポーターアッセイのために使用する適切な細胞株を選択します。
      注：E1U代替プロモーターレポーター構築物の活性を評価するために、それがE1Uプロモーターの制御下にBcrp1発現する細胞への構築物トランスフェクトすることが必要です。 TM4マウスのセルトリ細胞株は、（材料および機器のリストを参照してください）Bcrp1タンパク質とBcrp1のmRNA E1Uを含むだけでなく、E1A、E1B、およびE1C 5を表現します 。陰性対照として、Bcrp1タンパク質またはmRNAを発現しない細胞株を使用することを検討してください。
    2. TM4 CEの文化1で200,000細胞/ウェルの初期密度で24ウェルプレート中でLLS：1ハムF12培地の混合物1.2グラム/ Lの重炭酸ナトリウムとのダルベッコ改変イーグル培地、15mMのHEPESは、5％のウマ血清を2.5％補充し​​ました以前5に記載のように、37°C、5％CO 2で、ウシ胎児血清、ペニシリン（100 IU / mlで）、およびストレプトマイシン（100μg/ mlの）、。
    3. 六時間培養中の細胞を配置した後、空のpGL3-basicベクター0.2μgの持つまたは-1906 / + 64 E1Uまたは-1875 / + 10 E1Aまたは-1847 / + 60 E1Bを含むのpGL3ベクター0.2μgので細胞をトランスフェクトまたは-1904 / + 83 E1C BCRP 1削除は、市販のDNAトランスフェクションキット及び製造業者のプロトコル23を使用して、内部対照としてのpRL-TK（ ウミシイタケルシフェラーゼ発現ベクター）の4 ngのと一緒に構築（材料および機器のリストを参照してください） 。
    4. トランスフェクションの30時間、culturから増殖培地を除去edは、細胞をトランスフェクトしました。 200μlのPBSで細胞を1回洗浄し、洗浄液を除去します。
      1. ホタル測定し、 ウミシイタケルシフェラーゼ活性を、製造業者のプロトコール24に従って市販のキットを使用して。
    5. 内部（ ウミシイタケルシフェラーゼ）の制御によって分割ホタルルシフェラーゼ活性の比として、各チューブのための活性を発現。全体的な結果は、通常、1の値が与えられ、空のpGL3ベーシックベクターでトランスフェクトした細胞のそれに各レポーター構築物の相対活性として表現さ​​れます。

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結果

リーダーエクソンの分析によって、マウス精巣における BCRP 1 代替プロモーターの使用率 の同定

NCBIでのESTデータベースは、議定書1に記載されている手順を使用して（2015年4月）をプローブしたときに、ESTは、ゲノム内での位置と一緒に、1 mRNAは、表1に示されているBCRPにおけるエクソン2の5 '末端に隣接していたことがわかっBCRP 1 mRNA中に2エキソンに隣接しているC57BL / 6Jマウス精巣由来のエクソン2つのESTの開始までのDNAの相対E1U（ 表1）に対応する、70キロバイト上流エクソン2からのゲノ...

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ディスカッション

提示された方法および代表的な結果の大部分は2013年5に出版された「マウス精巣におけるB CRP1の転写は上流のステロイド合成因子-1によって調節される新規の第一エキソン（E1U）、のプロモーターによって制御されている」と題された前作に記載されていますここで示されている代表的な結果に加えて、前の紙は、5'-RACE PCRおよびRT-PCR法を用いた代替的な第一エクソンの利用の推定値を提供しました。また、上流E1Uからのプロモーターにおける推定SF-1応答エレメントのインシリコ識別が達成された、とクロマチン免疫沈降（チップ）アッセイは、SF-1が推定されるSF-1応答エレメントに結合することを実証しました。機能的研究は、マウスのセルトリ細胞において、BCRP 1転写がE1UプロモーターにおけるSF-1応答エレメントを介して、SF-1によって制御されることを明らかにしました。これらの機能の研究は、TRAによりTM4細胞におけるSF-1のアップレギュレーションを含まnsfectionまたはBCRP

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開示事項

ダグラスD.ロスとメリーランド大学、ボルチモアは、人間のBCRPに特許権を保持します。

謝辞

この作品は、退役軍人省からダグラスD.ロスへとアリフ・フセインにメリットレビュー賞によってサポートされていました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
COMMERCIAL BIOLOGIC MATERIALS AND KITS:
First Choice RLM-RACE kitAmbion Inc., Austin, TX, currently available through Life TechnologiesAM17005'-RACE PCR kit
TOPO TA cloning kitLife TechnologiesK450001このキットには、TOP10 化学的にコンピテントな E. coli 細菌が含まれています。
T4 DNAリガーゼクイックライゲーションキットNew England BiolabsM2200
Faststart高忠実度Taq-DNAポリメラーゼSigma-Aldrich/Roche3553400001/RMB-4738284001 ハイフィデリティのTaqポリメラーゼ酵素ブレンドを配合
XtremeGENE HP DNAトランスフェクション試薬ロシュ6366236001
デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイキットプロメガE1910pGL3-basicエンプティレポーターベクター(ホタルルシフェラーゼ)、pRLTKレニラルシフェラーゼ発現ベクター、その他のコントロールベクターが含まれています。
QIAprepQiagen27104ミドminiprepのために-細菌のコロニーpCR2.1ベクトルからのプラスミドDNAの分離そして浄化
TOPO TAのクローニングキット
のpGL3塩基性ルシフェラーゼを含んでいるベクトルPromegaE1751
pRL-TK RenillaのルシフェラーゼPromegaE2241
細菌の人工的な染色体BACPACリソースセンター、子供S Hospital Oakland Research Institute, Oakland, CARP23-285A12 and RP24-314E24http://bacpac.chori.org/clones.htm
REAGENTS/CHEMICALS/MEDIA/SUPPLIES
TRIzolLife Technologies15596026
Wizard®SVゲル&PCRクリーンアップシステム PromegaA9281制限エンドヌクレアーゼによる消化後のPCR産物の精製に有用
CRYOVIALSDenville ScientificV9012
SOFTWARE:
Ensembl softwareEnsembl projecthttp://Ensembl.org Ensemblプロジェクトは、脊椎動物やその他の真核生物のゲノムデータベースを作成し、この情報をオンラインで自由に利用できるようにしています。
ブラストソフトNCBIhttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=
ウェブ&PAGE_TYPE=BlastHome
Primer 3 ソフトウェアSimgenehttp://simgene.com/Primer35'-RACE PCR
NCBI ヌクレオチドデータベースNCBIhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/
CELL LINES:
>TM4 murine Sertoli cellsATCC, Manassas, VirginiaCRL-1715™
INSTRUMENTS:
LuminometerTurner BiosystemsTD-20/20これは比較的安価な手動操作のルミノメーターです。自動化システムは、96ウェルプレートを使用する同じメーカーからも入手できます。
NanoDrop分光測色計Thermo Scientific, Inc.NanoDrop 2000光度計は、非常に少量のサンプル
DU 800 UV/VIS分光光度計と核酸分析IIソフトウェアBeckmanCoulter Inc、Fullerton、CADU 800
プラスはベクトルを発現する分光を使用することができます

参考文献

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