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方法論記事

定量PCRを通じて非小細胞肺癌（NSCLC）患者の血漿中のエキソソームのmiRNA解析：実行可能な液体生検ツール

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DOI:

10.3791/53900

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2016年5月27日

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1Department of Biopathology and Medical Biotechnology, Section of Biology and Genetics, University of Palermo, 2Phase I-Early Clinical Trials Unit, Oncology Department, Antwerp University Hospital (UZA), 3Center for Oncological Research (CORE), Antwerp University, 4Department of Surgical, Oncological and Oral Sciences, Section of Medical Oncology, University of Palermo, 5Flemish Institute for Technological Research (VITO), 6CORE, Campus Groenenborger, Antwerp University, 7Molecular Pathology, Pathology Department, Antwerp University Hospital (UZA), 8Oncology Department, Antwerp University Hospital (UZA)

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このプロトコルは、循環するmiRNAの汚染を回避し、NSCLCにおけるそれらのバイオマーカーの特徴を評価するために、プロテイナーゼKおよびRNAse処理を含む市販のエキソソーム単離キットを通じて、NSCLC患者の血漿中に放出されるエクソソームにおけるmiRNAプロファイリングの実施可能性を説明しています。

要約

NSCLCにおけるEGFRおよびALK遺伝子などの変化の発見は、選択的チロシンキナーゼ阻害剤(TKI)を用いた標的薬物療法の開発を推進してきました。これらのTKIの使用を最適化するためには、早期発見と疾患の進行のための新しいバイオマーカーの発見が必須です。これらの血漿単離されたエキソソームは、これらのバイオマーカーの検出と追跡のための非侵襲的で再現性のある方法として使用できます。異なる変異と治療を受けた12人のNSCLC患者(および対照として6人の健康なドナー)からの血漿1 mlをエキソソーム源として使用しました。RNAse処理後、循環miRNAを分解するために、エキソソームを市販のキットで単離し、さらなる分析のために特定のバッファーに再懸濁しました。エクソソームは、ALIXおよびTSG101のウェスタンブロッティングと、これらのナノベシクルの生化学的および寸法データを取得するための標準的な技術である透過型電子顕微鏡(TEM)分析によって特徴付けられました。全RNA抽出は、高収率の市販キットを用いて行いました。エクソソームのmiRNA含有量が限られているため、選択したmiRNAごとに個別のアッセイを使用してレトロトランスクリプションPCRを実施することにしました。すべてNSCLC疾患と相関するmiRNA(30b、30c、103、122、195、203、221、222)のパネルを、リアルタイムPCR解析の優れた感度と特異性を利用して解析しました。mir-1228-3pを内因性コントロールとして使用し、データは式2-ΔΔct 13に従って処理しました。制御値をベースラインとして使用し、結果は対数スケールで示されています。

概要

NSCLC（非小細胞肺癌）患者における低い生存率は、進行した疾患と劣る早期発見1における処理の限られた有効性の主な原因です。 NSCLC患者の亜集団で発見されたEGFR遺伝子に変異を活性化し、キナーゼ阻害剤（TKIのを）チロシンする感度を付与することが知られています。残念ながら、EGFR突然変異したNSCLC患者の大多数は、TKI抵抗2を開発します 。特にこの文脈で、正しい診断が必須です。一般的に、による腫瘍の局在化を、NSCLCにおける生検組織を得ることは必ずしも可能ではありません。したがって、いくつかの研究は、これらの生物学的データを得るために、非侵襲的な方法を使用することを進行中です。エキソソームは、非侵襲的技術3と診断および予後値を得るために調査することができる液体生検成分として記載されています。

Eの - （100 nmの直径40）エキソソームはnanovesiclesあります生理学的および病理学的条件4の両方の異なる種類の細胞によって放出されるndocytic起源。彼らは、タンパク質、脂質、mRNAおよびマイクロRNAを運ぶことができます。また、いくつかの研究は、腫瘍細胞、血管形成、間質および細胞外マトリックスリモデリングおよび薬剤耐性5の成長と生存に影響を与えることができる腫瘍由来エキソソームの多面的な役割を示唆しています。

マイクロRNA（miRNA）は、転写後調節に関与している短い非コードRNA、標的mRNAの3'-UTRを結合し、劣化または非翻訳6にするmRNAをリードしています。エキソソームへのmiRNAの選択ソーティングが記載されています。この文脈では、最近、 インビトロおよびインビボで 、クルクミン処理7後の慢性骨髄性白血病細胞株によって放出エキソソームにおけるmiR-21の選択的な包装（発癌性効果を有する周知のmiRNA）を実証しました。

ザエキソソームmiRNAプロファイルは、原発腫瘍のmiRNAプロファイルと類似しており、この機能は、早期診断および予後3で利用することができます。具体的には、リアルタイムPCRによって、特徴付ける可能性があり、疾患の分子プロフィールと相関選択されるmiRNA 例えば 、他の8間のEGFR突然変異。

ここでは、NSCLC相関するmiRNA 8-9の選択されたパネルの分析は、NSCLC患者の血液中に放出されたエキソソームから単離したことが記載されています。患者からのお知らせ同意レポートを取得した後、12 NSCLC患者と6健常対照のプラズマ、分析しました。エキソソームの単離は、製造業者のプロトコルに従って市販のキットを用いて行きました。エキソソーム単離の前に、血漿試料を汚染物質の循環miRNAを分解するために、RNアーゼで処理しました。我々は、他のテクニックの制限された標準化に市販のキットを使用してこの分析を実行することを決定しましたQUES（ 例えば 、超遠心分離）臨床試料を扱うときに特に重要です。このキットは、RNA分解酵素を分解し、したがってエキソソーム溶解後エキソソームmiRNAを分解する危険性を低下させるであろうプロテイナーゼK処理を含みます。マイクロRNA分析は高感度かつ特異的なリアルタイムPCR分析により行いました。 miR-1228-3pは、式2に記載の内在性コントロールとして使用し、データを正規化した- ΔΔCT。制御値は、ベースラインとして使用され、その結果は、対数スケールで示されています。

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プロトコル

1.エキソソームの単離

注：血漿サンプルからエキソソームの単離は、製造業者のプロトコルに従って、加算RNase処理により、市販のキットを用いて行った：（すべての手順は、生物学的サンプルを操作するための具体的な法的手順に従って、個人および環境保護設備として実行する必要があります）。

  1. -80℃で保存し、各サンプルの血漿を1mlを取り、氷上に置きます。
  2. RTで20分間、2000×gでサンプルを遠心。この一節は、細胞および破片を除去するために必須です。
  3. 新しい1.5 mlチューブにプラズマ洗浄を含む上清を移します。
  4. RTで20分間、10,000×gで新しいチューブを遠心。
  5. 新しい1.5 mlチューブにプラズマ洗浄を含む上清を移します。
  6. 上清にRNアーゼの100ng / mlのを追加し、10分間37℃で管をインキュベート循環RNAを分解するため。
  7. 新しい2 mlチューブに、すべてのプラズマ処理を移し、1×PBSの0.5ボリュームを追加。
  8. 溶液を混合するために、サンプルをボルテックス。
  9. サンプルのプロテイナーゼK溶液（キットに同封）の0.05ボリュームを追加します。
  10. 渦サンプルその後10分間37℃でインキュベートします。
  11. サンプルにエキソソーム沈殿バッファーの0.2体積を追加し、反転により溶液を混合。
  12. 30分間2℃〜8℃でサンプルをインキュベートした後、室温で5分間、10,000×gでサンプルを遠心します。
  13. 吸引し、上清を捨てます。ペレットは、単離されたエキソソームを含んでいます。
  14. エキソソームを再懸濁するために、エキソソームペレットに選択されたバッファを追加します。バッファの選択は、この場合には、計画された下流の分析に依存します。
    1. TEM分析を行うために1×PBS 100μlを添加します。
    2. 特定の溶解をbufの346.5μLを追加（市販キットから）RNA抽出（化学ハザード注意）用のFER。
    3. （ - のNaCl 300 mMの - トリトンX-100 0.5％ - のTris-HCl 50mMのpHは7.6 PMSF、1mMの - ロイペプチン/アプロチニンを10μg/ ml）をタンパク質抽出のために100μlの溶解緩衝液を加えるウェスタンブロッティング分析を行うために。 （注意：化学品の危険有害性）。
  15. -20℃で再懸濁エキソソームを保管してください。

ウエスタンブロット分析による2.エキソソーム特性評価

注：孤立nanovesiclesを特徴付けるために、ALIXとTSG101（よく知られたエキソソームマーカー）に対する抗体を用いたウェスタンブロット法が推奨されます。

  1. 溶解緩衝液中のエキソソームペレットの再懸濁させた後、エキソソーム膜を溶解するために、1時間氷の上に置きます。
  2. 12,000gで10分間溶解液を遠心し、ペレットを乱すことなく、上清を新しいチューブに移します。
  3. 総エキソソームタンパク質contenを定量化ブラッドフォードアッセイまたは他の方法によりトンと負荷トリス/グリシンSDS中でウェルあたりタンパク質50μgの - 8％ポリアクリルアミドゲル。 （注意：化学品の危険有害性）。
  4. 化学的危険性：120 V.（注意で1時間30分間緩衝液（25 mMトリス、192 mMグリシン、0.1％SDS）を実行して8％SDS-PAGEゲル電気泳動でタンパク質（および適切な分子量マーカー）を分離）。
  5. 定数50 V.（：化学品の危険有害性警告）で1時間4℃の冷転写バッファー（25 mMトリス、192 mMグリシン、20％メタノール）を用いてエレクトロによりニトロセルロース膜にタンパク質を移します。
  6. 1×TBS -Tween 0.1％で5％脱脂粉乳でゆっくり撹拌中で1時間、膜をブロックします。
  7. トゥイーン0.1％ - 1×TBSで高速攪拌で5分間、膜を4回洗浄します。
  8. （従って、製造業者からの抗体のデータシートを）適当な緩衝液中ALIXとTSG101に対する一次抗体（膜につき1）を追加し、膜のO / Nインキュベート;ゆっくり撹拌インチ
  9. 過剰な抗体を除去するために、トゥイーン0.1％ - 1×TBSで高速攪拌で5分間、膜を5回洗浄します。
  10. 適切な緩衝液中で（従って、製造業者からの抗体のデータシートを）適切な二次抗体を加え、ゆっくり撹拌中で1時間、膜をインキュベートします。
  11. 過剰な抗体を除去するために、トゥイーン0.1％ - 1×TBSで高速攪拌で5分間、膜を5回洗浄します。
  12. 化学発光分析11によって選択されたタンパク質を検出します。

TEM分析による3エキソソーム特性評価

注意：単離されたエキソソームを可視化するためには、TEM（透過型電子顕微鏡）分析を行いました。

  1. パラフィルム上に1×PBSに再懸濁し、無傷エクソソームのサンプルの〜10μgの場所（以前はBradfordアッセイによって定量化）し、サンプルに入れ、1時間ホルムバール炭素コーティングされたニッケルグリッドをドロップします。
    2. <李は> 1×PBSが下がる340μlの上に配置することによって、グリッドを3回洗浄します。
  2. 5 30μlの超純水の滴の上に配置することによって、グリッドを5回洗浄します。
  3. 10分間2.5％グルタルアルデヒド（化学品の危険有害性警告）のドロップを追加することにより、サンプルを修正してください。
  4. 1×PBSが下がる340μlの上に配置することによって、グリッドを3回洗浄します。
  5. 2％酢酸ウラニル（注意：化学品の危険有害性）の低下を追加し、サンプルを対比するために15分のためにそれの上にグリッドを置きます。
  6. 0.13％メチルセルロース（注意：化学品の危険有害性）の低下にサンプルを埋め込み、0.4％酢酸ウラニルと10分間ドロップの上にグリッドをインキュベートします。
  7. ゆっくり吸収紙で液体過剰分を除去し、コーティングされた面を上にして5分間グリッドを乾燥させます。
  8. 透過型電子顕微鏡12によりグリッドを調べます。

4.エキソソームRNA抽出および定量化

注：私たちは、PERFすることを決めました製造業者のプロトコルに従って、市販のキットを使用して、エキソソーム試料からの全RNA抽出をORM：（注意：化学品の危険有害性は、製造業者のプロトコルおよびガイドラインを確認）。

  1. 溶解バッファーの346.5μlのでエキソソームペレットの再懸濁した後、βメルカプトエタノール（注意：化学品の危険有害性）の3.5μlを追加し、激しく渦を。この一節は、脂質膜を破壊するために必須です。
  2. 1分間11,000×gでコレクションチューブと遠心機で洗浄カラムにライセートを追加します。遠心分離した後、カラムを破棄し、新しい1.5 mlのRNaseフリーのチューブにろ液を移します。
  3. 70％のエタノール（注意：化学品の危険有害性）の350μlを添加して、5秒間ボルテックスして混合します。
  4. 8000×gで30秒間解決列と遠心機で溶解液をロードします。遠心分離した後、フロースルーを破棄して新しいコレクションチューブにカラムを移します。
  5. 脱塩ブフェ350μlのをロードします1分間11,000×gでrと遠心。遠心分離した後、フロースルーを廃棄し、同じコレクションチューブにカラムを返します。
  6. カラムのシリカ膜上でのDNase I反応ミックスの95μlの（各サンプル用のDNaseバッファーの再構成されたDNアーゼI +90μlの10μlのを、）を追加し、室温で15分間、室温でインキュベートします。 （注意：化学的危険性）
  7. 1分間11,000×gで列や遠心分離機に：洗浄用緩衝液200μl（化学品の危険有害性警告）を追加します。新しいコレクションチューブにカラムを置きます。
  8. 1分間11,000×gで列や遠心分離機に洗浄緩衝液600μlのを追加します。遠心分離した後、フロースルーを廃棄し、同じコレクションチューブにカラムを配置します。
  9. 2分間11,000×gで列や遠心分離機に洗浄緩衝液250μlのを追加します。 1.5ミリリットル無RNAseチューブにカラムを置きます。
  10. 11000でRNaseフリー水と遠心分離機の40μlのRNAを溶出 5;この少量の高RNA濃度を有するために1分間グラム、。
  11. 直ちに-80℃での潜在的な劣化や店舗を防止するために、氷上で溶出したRNAを置きます。
  12. RNA量を定量化します。注：ここでは、RNAの量子化は、分光光度計を介して試料を1μlを用いて行きました。

エキソソームmiRNAの5 Retrotrascription

注：これによりエキソソーム中のmiRNA量の上記制限された量に、その製造業者のプロトコールに従って、各miRNAのための個別のアッセイを用いて市販のキットにより選択されるmiRNAの逆転写を行うことにしました。各サンプルについて、NSCLCの状態に相関8のmiRNAを選択した（のmiR-30B、のmiR-30cの、のmiR-103;のmiR-122;のmiR-195;のmiR-203;のmiR-221;のmiR-222;およびmiR-1228- 3P内在性コントロールとして）。

  1. 逆転写マスターミックス（RTミックス）を準備します。で説明したように各反応について、RTミックスの7μLを準備しますhttps://www.jove.com/files/ftp_upload/53900/Table1.xlsx">Table 1（ダウンロードするにはこちらをクリックしてください）（注意：化学的危険性）。
    注記：この実験では、9つの異なるRTミックスを各サンプルのために調製しました。
  2. 穏やかに混合し、氷上でのRTミックスを格納します。反応管あたりのRTミックスの7μlを添加します。
  3. 反応管あたりのサンプルRNA（10μgの全RNA）の5μl加え、穏やかに混合します。
  4. 対応する反応管に設定された各アッセイから：（化学品の危険有害性警告）5倍逆転写プライマーの3μLを加えます。
  5. ゆっくりと混ぜ、チューブを閉じて、5分間氷上でインキュベートします。
  6. サーマルサイクラーに反応チューブをロードし、30分間16℃で次のパラメータ値（HOLDを使用して逆転写反応を開始し、42℃で30分間ホールド; 85℃で5分間HOLD、HOLD∞4 °C）。

エキソソームmiRNAの6.リアルタイムPCR解析

注：この分析はありましたサンプルごとに3つの生物学的および技術的反復で、リアルタイムPCR（定量PCR）のための市販のキットを用いて行きました。

  1. 各反応について、リアルタイムPCRミックスの17.67μlの（PCRマスターミックス+ヌクレアーゼフリー水の7.67μlに10μl）を準備し、それをミックスし、氷上に置きます。 （注意：化学的危険性）
  2. 20倍の定量PCRプライマー（：化学的危険注意）の、それぞれのPCRチューブのために、1μLを加えます。
  3. 各ウェルプレートで定量PCRミックスの18.67μLを置きます。
  4. 特派ウェルプレートに逆転写産物の1.33μLを加えます。
  5. プレートを閉じて（300 GX 5秒）をスピン。
  6. リアルタイムPCRシステムでプレートを挿入し、以下のPCR条件を使用して、実行を開始：95℃で10分間ホールド; 95℃で15秒、60℃で60秒の40サイクル。 ΔΔCT13 -式2に従ってデータを処理し、正規化します。

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結果

NSCLC患者の12の血漿および6健常対照の合計は、血漿からエキソソームを単離するための市販のキットを用いて処理しました。各サンプルは、エキソソームマーカーALIX（96キロダルトン）とTSG101（43キロダルトン）を評価するために、ウエスタンブロット分析によって処理されました。これらの結果の例は、血漿サンプルからエキソソームの単離は、このプロトコルで実行可能であることを示す、 図1の3つのサンプルのために示されています。

生物物理学的エキソソーム試料を特徴付けるために、TEM分析を行いました。 100nmで（ 図2） - TEM 40との間に、この単離プロトコールにより得られたnanovesiclesがエキソソームサイズの範囲の大きさの平均値を有することが示されています。

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ディスカッション

この組み合わされたプロトコルを用いると、NSCLC患者の血漿からエキソソームmiRNA解析を行うことが可能でした。これらのデータは、疾患の状態を反映し得るが、これはさらなる研究により確認される必要があります。

この記事で使用されるプロトコルは、エキソソームを単離するための市販のキットに基づいていました。その理由は、限られた標準化につながる、より多くの手作業を必要とする他の公知の単離手順（ 例えば 、密度勾配超遠心分離）ということでした。それにもかかわらず、このプロトコルの制限の一つは、エキソソームの単離のための密度勾配超遠心分離と比較して、密度勾配超遠心分離は、（ - 1.19グラム/ mlの1.13の間）エキソソームの比重を利用エキソソームの単離に非常に有用な技術のままであることです。潜在的な変更は、この分野でのゴールドスタンダードであるかもしれない両方の手順、のミックスです。

臨床samplを処理する可能性RNase処理とesがmiRNAを循環させるの汚染なしに私たちに純粋なサンプルを与えています。しか...

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開示事項

すべての著者は、競合する金銭的利益がないことを宣言しています。

謝辞

この研究は、2014年にMOCA(Multidisciplinair Oncologisch Centrum Antwerpen)助成金によっても資金提供されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
全エキソソーム単離キット(血漿から) Invitrogen4484450Use Proteinase K treatment
Ribonuclease ASigma-AldrichR4875-100MG
ALIX 抗体 (3A9)Cell Signaling2171S
TSG-101 抗体 (C-2)SantaCruz BiotecnologySC-7964 
抗マウスHRP 1 ml  Cell Signaling7076P2
RNAspin Illustra mini kit 50GE HealthCare25-0500-71
Taqman MicroRNA 逆転写キットLife Technologies4366596
has-miR-1228-3p TaqMan MicroRNA assayLife002919
has-miR-30b TaqMan MicroRNA assayLife Technologies000602
has-miR-30c TaqMan MicroRNA assayLife Technologies000419
has-miR-122 TaqMan MicroRNA assayLife Technologies002245
has-miR-195 TaqMan MicroRNA assayLife Technologies000494
has-miR-203 TaqMan MicroRNA assayTechnologies000507
has-miR-103 TaqMan MicroRNA assayLife Technologies
has-miR-221 TaqMan MicroRNA assayLife Technologies000524
has-miR-222 TaqMan MicroRNA assayLife Technologies002276
TaqMan Universal Master Mix II, no UNGLife Technologies4440043
Technologies Life 000439

参考文献

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