方法論記事

タンパク質分解中のシクロヘキシミドチェイス分析

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DOI：

10.3791/53975

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2016年4月18日

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1Department of Biology, Ball State University, 2Bioproduct Research & Development, Eli Lilly and Company

この記事について

サマリー

タンパク質の存在量は、タンパク質合成とタンパク質分解の両方の速度を反映しています。この記事では、シクロヘキシミドチェイスとそれに続くウェスタンブロッティングを使用して、モデル単細胞真核生物であるSaccharomyces cerevisiae(出芽酵母)のタンパク質分解を分析する方法について説明します。

要約

タンパク質存在量の調節は、事実上すべての細胞プロセスに不可欠です。タンパク質の存在量は、タンパク質合成およびタンパク質分解の速度の統合を反映しています。多くのタンパク質存在量に関するレポートアッセイ（ 例えば 、単一の時点ウェスタンブロッティング、フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡、または増殖に基づくレポーターアッセイ）は、タンパク質レベルでの翻訳とタンパク質分解の相対的効果の差別を許しません。この記事では、具体的には、モデル単細胞真核生物、 サッカロマイセス・セレビシエ （出芽酵母）にタンパク質分解を分析するためのウェスタンブロッティングに続いてシクロヘキシミドチェイスの使用を記載しています。この手順では、酵母細胞は、翻訳阻害剤シクロヘキシミドの存在下でインキュベートされます。細胞のアリコートを後シクロヘキシミドの添加後の特定の時点ですぐに収集されます。細胞を溶解し、そして溶解物を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離されるFO各時点でのタンパク質量のウェスタンブロット分析をrは。シクロヘキシミドチェイス手順は、種々の細胞タンパク質の定常状態の人口の分解動態の可視化を可能にします。手順は、タンパク質分解のための遺伝的要件および環境の影響を調査するために使用することができます。

概要

タンパク質は、事実上すべての細胞プロセスにおいて重要な機能を実行します。多くの生理学的プロセスは時間のまたは特定の状況下で定義された期間に特定のタンパク質（またはタンパク質）の存在を必要とします。生物は、したがって、監視および携帯ニーズ1を満たすために、タンパク質存在量を調節します。例えば、サイクリン（細胞分裂を調節するタンパク質）は、細胞周期の特定の相に存在し、規制サイクリンレベルの損失は、悪性腫瘍の形成2に関連しています。細胞のニーズを満たすためにタンパク質レベルを調節することに加えて、細胞は、誤って折り畳まれ、組み立てられていない、またはそうでなければ異常なタンパク質分子3を除去するために分解品質管理機構を採用します。タンパク質存在量の制御は、巨大分子の合成（転写および翻訳）および分解（RNAの崩壊とタンパク質分解）の両方の調節を伴います。障害または過剰なタンパク質分解は、複数の病理に貢献します、癌、嚢胞性線維症、神経変性疾患、および心血管障害4-8を含みます。タンパク質分解のメカニズムは、したがって、病気9-12の範囲のための有望な治療標的を表します。

単一時点でのタンパク質の分析は、（ 例えば 、ウェスタンブロットで13、フローサイトメトリー14、または蛍光顕微鏡15）の合成や分解の相対的な寄与を明らかにすることなく定常状態のタンパク質存在量のスナップショットを提供します。同様に、増殖に基づくレポーターアッセイは、合成および分解15~20の影響を区別することなく、長期間にわたる定常状態タンパク質レベルを反映します。前の存在量を比較することにより、薬理学的proteを不活性化することによって、例えば、分解機構（の特定の成分を阻害した後の定常状態タンパク質レベルの分解過程の寄与を推定することが可能ですasome 21または分解13に必要とされることが仮定遺伝子）をノックアウト。分解経路を阻害した後の定常状態のタンパク質レベルの変化は、タンパク質発現量13の制御にタンパク質分解の寄与のための強力な証拠を提供します。しかし、このような分析は、依然としてタンパク質代謝回転の動態に関する情報を提供していません。ウェスタンブロッティングに続いてシクロヘキシミドチェイスは、研究者は、時間22-24かけてタンパク質分解を視覚化することを可能にすることによって、これらの弱点を克服します。シクロヘキシミドチェイス以下のタンパク質の検出は、通常、ウエスタンブロット法、放射性同位体と長い免疫沈降ステップによって行われるためさらに、また、タンパク質分解25を可視化するために行われている多くの一般的に使用されるパルスチェイス技術とは異なり、シクロヘキシミドチェイスのために必要とされていません。

シクロヘキシミドは、最初の抗真菌適切有する化合物として同定されました26,27 グリセウスグラム陽性菌ストレプトミセスによって生成ネクタイ。これは、具体的には、リボソームの転位28-31を損なうことにより、真核生物の細胞質ゾル（しかしオルガネラない）翻訳を阻害する細胞透過性分子です。シクロヘキシミドチェイス実験において、シクロヘキシミドを細胞に添加し、細胞のアリコートを、化合物22の添加後すぐに、特定の時点で収集されます。細胞を溶解し、そして各時点でのタンパク質の存在量は、典型的には、ウェスタンブロットによって分析します。シクロヘキシミドの添加後のタンパク質存在量の減少は、自信を持って、タンパク質の分解に起因することができます。比較的安定したタンパク質が豊富でほとんど変化を示すであろうしながら、不安定なタンパク質は、時間をかけて豊富に減少します。

選択的なタンパク質分解のメカニズムは非常に真核生物を通じて保存されています。タンパク質分解について知られていることの多くは、最初に学習されましたモデル単細胞真核生物、 サッカロマイセス・セレビシエ （出芽酵母）25,32-36。酵母を用いた研究は、タンパク質分解に新規で重要な洞察を提供し続ける可能性が高いです。タンパク質量のウェスタンブロット分析を行った酵母細胞におけるシクロヘキシミド追跡するための方法がここに提示されています。

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プロトコル

酵母細胞の1成長と収穫

  1. 内在性酵母タンパク質の分解速度を分析していない場合は、目的のタンパク質をコードするプラスミドを用いて、所望の酵母菌株（単数または複数）を変換します。酵母の形質転換のための信頼できる方法は、先37に記載されています。
  2. 適切な培地5mlに酵母を接種する（ 例えば、形質転換細胞または非形質転換細胞のための非選択的な酵母エキス-ペプトン-デキストロース（YPD）培地のプラスミド維持のための選択的な合成に定義（SD）培地）。回転、30℃で一晩インキュベートします。
    注：30℃、典型的な野生型実験室酵母株38のための最適な成長温度です。しかし、にいくつかの変異体酵母株は30℃で最適に増殖しないので、いくつかのタンパク質は、温度依存性の分解を受ける、酵母細胞の増殖およびシクロヘキシミドチェイスに使用される温度は、経験的に39を決定すべきです。
  3. 目を測定します各一晩培養物の600nmで（OD 600）での電子光学密度。
    注：細胞は、対数または定常増殖期にあってもよいが、最低限の新鮮な培地15mlにOD 600 = 0.2に希釈を可能にする密度に達している必要があります。
  4. 新鮮な培地の0.2〜15でミリリットルのOD 600値に一晩培養を希釈します。
  5. 細胞が中期対数増殖期（ すなわち 、0.8と1.2の間のOD 600）に達するまで振とう、30℃で酵母を培養します。
  6. 酵母細胞成長の間、シクロヘキシミドチェイス手順の準備のために次の手順を実行します。
    1. シクロヘキシミドの存在下での細胞のインキュベーションを30℃に15ミリリットルを円錐管を収容することができヒートブロックを設定します。文化への効率的な熱分布を可能にするために、ヒートブロックのウェルに水を追加します。 15ミリリットルコニカルチューブは、水位がオーバーフローに上昇するが、しないように十分の唇を引き起こすであろうことを、各ウェルなどに水を追加します。。
    2. 細胞溶解後のタンパク質の変性、95℃、1.5 mlマイクロチューブを収容可能な第2ヒートブロックを設定します。
    3. プリ暖かい新鮮な増殖培地（培養あたりの時点当たり1.1ミリリットルをアッセイする）30℃です。
    4. 50μlの20倍ストップ・ミックスを追加するために予め標識マイクロ遠心チューブ（分析対象の培養当たりの時間点につき1チューブ）。氷の上にチューブを入れます。
      注意：アジ化ナトリウム、20倍ストップミックス中の成分は、経口摂取または皮膚接触を介して、有毒です。 、準備、保存、およびアジ化ナトリウムを取り扱う際、メーカーの推奨事項に従ってください。偶発的曝露の場合には、メーカーが提供する製品安全データシートを参照してください。
  7. 細胞が中期対数増殖に達したときに、（3つの時点でのタンパク質発現量を解析するために、例えば 、7.5 OD 600単位）アッセイされるべき時点ごとに各培養物の2.5 OD 600単位を収集します。遠心分離機は3,0で15ミリリットルコニカルチューブに細胞を収集しました2分間、室温で00 XG。
    注：One OD 600単位はOD 1.0の600で1ミリリットルの培養物中に存在する酵母の量に等しいです。 V = X OD 600単位/ OD 600の測定：X OD 600単位（V）を回収するのに必要な培養液（ml単位）の量は、以下の式を用いて決定することができます。例えば、OD 1.0の600で酵母細胞培養の7.5 OD 600単位を収穫7.5 OD 600単位/ 1.0 = 7.5ミリリットル酵母培養物を収集します。
  8. 30の1ミリリットル°C（予め温めておいた）細胞の2.5 OD 600ユニット（ 例えば 、7.5 OD 600ユニットの3ミリリットル）あたりの新鮮な増殖培地中で再懸濁し、各細胞ペレット。

2.シクロヘキシミドチェイス

  1. 30℃のヒートブロックで5分間インキュベートすることによって、酵母細胞懸濁液を平衡化します。
  2. 午後12時からカウントアップするタイマーを準備します。
  3. シクロヘキシミドチェイスを開始するには、Enterキーを押して、タイマーに「スタート」。素早く、しかし、慎重に、次の手順を実行します。
    1. 最初の酵母細胞懸濁液に250μgの/ mlの最終濃度になるようにシクロヘキシミドを追加します（ 例えば、細胞懸濁液の3ミリリットルに20ミリグラム/ mlのシクロヘキシミド株式の37.5μlを添加）、および渦が簡単にミックスします。
      注意：シクロヘキシミドは、皮膚刺激性であり、経口摂取を介して、有毒です。 、準備、保存、およびシクロヘキシミドを取り扱う際、メーカーの推奨事項に従ってください。偶発的曝露の場合には、メーカーが提供する製品安全データシートを参照してください。
    2. すぐにシクロヘキシミドとボルテックスを追加した後、50μlの氷冷20倍ストップミックスを含む前標識されたマイクロ遠心チューブに加え、シクロヘキシミドで酵母細胞懸濁液の950μlの（〜2.4 OD 600ユニット）を転送します。全てのサンプルが収集されるまで氷上にマイクロ遠心管、および場所をボルテックス。
    3. 30℃に酵母細胞懸濁液を返します。
  4. 手順を繰り返し2.3を通じて2.3.1午前一時で一定時間間隔（ 例えば、シクロヘキシミドは0時30分で、午後12時で、サンプル＃2を＃1をサンプルに添加されるように30秒ごとに、サンプル＃3で、残りの酵母細胞懸濁液のそれぞれについて0.3 等 。）。
  5. その後の各時点で、渦酵母細胞懸濁液と50μlの予冷した20倍ストップ・ミックスを含む標識マイクロ遠心チューブに950μlのを転送します。氷上で回収した細胞をボルテックスし、配置します。 30℃のヒートブロックに15ミリリットルを円錐管を返します。
    1. 例えば、30分シクロヘキシミドの添加後の細胞の収集のために、渦（タイムコースの開始時に、酵母細胞懸濁液にシクロヘキシミド添加の間に30秒の間隔を仮定）と30:00でサンプル＃1からの細胞懸濁液950μLを除去します。ように30:30でサンプル＃2のために繰り返し、。
      注：チェイスの過程を通じて約15ミリリットルで、5分ごとにコニカルチューブをボルテックス細胞懸濁液を酵母の沈降を防止するために。あるいは、酵母細胞懸濁液Sはシクロヘキシミドチェイス実験の期間中、連続的に撹拌水浴中で維持することができます。
  6. 全てのサンプルが収集されたら、ペレットを30秒間、室温にて6,500×gでの遠心分離によって細胞を収集しました。ピペッティングまたは吸引により上清を取り除きます。細胞は、今、アルカリ溶解のための準備が整いました。また、スナップ凍結液体窒素とストア内のペレット化した細胞を-80℃で。

3.ポストアルカリ性タンパク質抽出（16,40から変更されました）

  1. 各細胞ペレットに100μlの蒸留水を加えます。ピペッティングまたはボルテックスによって再懸濁します。
  2. 各試料に0.2 M NaOHを100μLを加えます。ピペッティングまたはボルテックスにより混和します。
  3. インキュベートは、室温で5分間、細胞を懸濁しました。この段階において、酵母細胞は溶解されていない、およびタンパク質40をリリースしていません。
  4. 部屋の気性で18,000×gで遠心分離により細胞をペレット化30秒間ature。ピペッティングまたは吸引により上清を取り除きます。
  5. 細胞を溶解し、各細胞ペレットにレムリ試料緩衝液100μlを加えます。ピペッティングまたはボルテックスによって再懸濁します。
    注：トリス - グリシンランニング緩衝系を使用して、ドデシル硫酸ナトリウム - ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）と互換性のある形でのNaOHとのLaemmli試料バッファを解放タンパク質と細胞の連続インキュベーション。
  6. 完全タンパク質を変性するために95℃で5分間インキュベートします。
    注：95℃でのインキュベーションは、凝集しやすいタンパク質の分析には適していない（ 例えば 、いくつかの膜貫通セグメントを有するタンパク質）。高温41でインキュベートした場合、これらのタンパク質は不溶性になることがあります。経験的に決定されたとして30分、 - 10 -したがって、そのようなタンパク質の分析のために、溶解物は、より低い温度（70℃、例えば 37℃）でインキュベートする必要があります。
  7. ROで18,000×gで遠心分離した溶解物不溶性物質をペレット化するために1分間オム温度。上清（可溶化抽出したタンパク質）をSDS-PAGEおよびその後のウエスタンブロット分析による分離のために準備ができています。また、-20℃で保存溶解物。

4.代表的SDS-PAGEおよびウェスタンブロッティング手順（16から適応）

  1. 負荷タンパク質分子量標準およびSDS-PAGEゲル上に溶解物の経験的に決定されたボリューム。
    注：目的のタンパク質の分子量に基づいて、SDS-PAGEゲル中のアクリルアミドおよびビスアクリルアミドの割合を選択します。一般的に、低いパーセンテージのゲルは、より高い分子量のタンパク質を解決するために適しています。
  2. 色素の先端がゲルの下端に達するまで、200 Vでゲルを実行します。
  3. 4℃で90分 - ポリフッ化ビニリデン（PVDF）60 20 Vで湿潤転写によって膜にゲルから転送タンパク質。
  4. （TBトリス緩衝生理食塩水でインキュベートすることにより、膜をブロックS）、5％スキムミルクを含む1時間または4℃で一晩、室温で、ロッキング。
    注：一晩インキュベートした膜の存在下で微生物の増殖を防ぐためには、0.02％の最終濃度でブロッキング溶液にアジ化ナトリウムを含むことが推奨されます。
  5. 室温で1時間、揺動、0.1％のTween-20（TBS / T）及び1％のスキムミルクを含むTBS中で目的のタンパク質に特異的な一次抗体と共に膜をインキュベートします。
  6. ロッキング、TBS / Tで、室温で3×5分間メンブレンを洗浄。
  7. ロッキング、室温で1時間1％スキムミルクを含むTBS / Tで適切なフルオロフォア結合二次抗体で膜をインキュベートします。
    注：フルオロフォアは、光に敏感です。したがって、フルオロフォアに結合した抗体の希釈液は、暗闇の中で準備する必要があり、かつ蛍光団およびその後の洗浄工程に結合した抗体の存在下での膜のインキュベーションは、（ 例えば、アルミホイルにくるまれた）遮光に起こるべき共同ntainers。
  8. ロッキング、TBS / Tで、室温で3×5分間メンブレンを洗浄。
  9. 画像膜メーカーの推奨に従って、LI-CORのオデッセイCLX及び画像Studioソフトウェア（または同等のイメージング機器やソフトウェア）を使用。
  10. 膜の画像を取得した後、ロッキング、1時間室温で1％スキムミルクを含むTBS / Tでローディングコントロールタンパク質に特異的な一次抗体で膜をインキュベートします。
  11. ロッキング、TBS / Tで、室温で3×5分間メンブレンを洗浄。
  12. ロッキング、室温で1時間1％スキムミルクを含むTBS / Tで適切なフルオロフォア結合二次抗体で膜をインキュベートします。
  13. ロッキング、TBS / Tで、室温で3×5分間メンブレンを洗浄。
  14. ステップ4.9のように、画像の膜。

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結果

シクロヘキシミド追跡方法を説明するために、Deg1 -Sec62の安定性（ 図1）、モデル酵母の小胞体（ER）関連分解（ERAD）基板は、42〜44を分析しました。 ERADでは、品質管理ユビキチンリガーゼ酵素は共有結合ER膜に局在異常なタンパク質に小さなタンパク質のユビキチン鎖を取り付けます。このようなポリユビキチン化タンパク質は、その後、大きな細胞質ゾルプロテアーゼ45 ERから除去され、プロテアソームにより分解されます。それは永続的に及び異常トランスロコン、ER内腔または膜43へのタンパク質の移行を促進するチャネルに係合後Deg1 -Sec62タンパク質が分解の標的とされています。同様に、哺乳類のアポリポタンパク質B、低密度リポタンパク質のタンパク質成分は、持続的ERトランスロコンと係合し、その後ときにリップ関連機構による分解を受けイド結合パートナー46-48存在しません。 （トランスロコン関連用）4...

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ディスカッション

この論文では、タンパク質分解の動態を分析するための方法が提供されます。この技術は、容易に様々なメカニズムにより分解タンパク質の範囲に適用することができます。シクロヘキシミドチェイス実験は、所定のタンパク質の定常状態プールの分解速度について報告することに留意することが重要です。他の技術は、タンパク質の特定の集団の分解速度を分析するために使用されてもよいです。例えば、新生ポリペプチドの分解の運命は、パルスチェイス分析55によって追跡することができます。このような実験では、新生タンパク質が短時間パルス標識（ 例えば 、放射性アミノ酸を有する）です。 （または定常状態のタンパク質存在量の変化をミラーリングしてもしなくてもよい）標識された新生タンパク質の存在量の変化は、時間をかけて追跡することができます。

シクロヘキシミドチェイス（ すなわち、最大2時間）、比較的短い時間にわたってタンパク質の安定性を分析するのに適しています。長い時間c以上ourses（ すなわち 、2日間時間）、シクロヘキシミド、翻訳の世界的な阻害...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

著者は、ルーベンシュタイン研究室の現役および元メンバーが協力的で熱心な研究環境を提供してくれたことに感謝します。著者らは、試薬と専門知識を共有してくれたMark Hochstrasser氏(イェール大学)に感謝します。E.M.R.は、タンパク質の速度論的解析に関する貴重な専門知識を共有してくださったStefan Kreft氏(コンスタンツ大学)とJennifer Bruns氏(ピッツバーグ大学)に感謝します。この研究は、EMRへの国立衛生研究所の助成金(R15 GM111713)、EMRへのボール州立大学ASPiRE研究賞、Sigma XiからSMEへのボール州立大学支部からの研究賞、およびボール州立大学プロボストオフィスと生物学部からの資金によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
所望の酵母株、プラスミド、標準的な培地および緩衝成分
使い捨てホウケイ酸ガラス管フィッシャーサイエンティフィック14-961-32様々なメーカーから入手可能
温度調節インキュベーター (例えば ヘラサームインキュベーター モデルIMH180)ドットサイエンティフィック51028068様々なメーカーから入手可能
18 mmチューブ(チューブローラー)ニューブランズウィM1053-0450ローラーは、懸濁液中の酵母細胞のオーバーナイト スターター培養を維持することをお勧めします。あるいは、チューブローラーが利用できない場合は、温度制御されたインキュベーター内のプラットフォームシェーカーを使用して、一晩のスターター培養を行うことができます。プラットフォームシェーカーまたはチューブローラーを使用して、より大きな培養物を懸濁液に保持することができます。
ニューブランズウィックTC-7ローラードラム120 V 50/60 HニューブランズウィックM1053-4004チューブローラーSmartSpec
Plus分光光度計バイオ・ラッド170-2525さまざまなメーカーから入手可能
遠心分離機 5430エッペンドルフ5427 000.216 ユニットと一緒に販売されているローターは、1.5mlと2.0mlの微量遠心チューブを保持します。ローターは、15mlと50mlの円錐管を保持するものと交換することができます
固定角ローターF-35-6-30 蓋と遠心分離機用アダプター付き モデル5430/R、15/50ml円錐管、6場所エッペンドルフF-35-6-30
15mlスクリーン印刷スクリューキャップチューブ 17 x 20 mm円錐形、ポリプロピレンSarstedt62.554.205さまざまなメーカーから入手可能
1.5ミリリットルフレックスチューブ、 PCRクリーンで天然の微量遠心チューブエッペンドルフ22364120様々なメーカーから入手可能
アナログDri-Bath Heatersフィッシャーサイエンティフィック1172011AQ2つのヒーター(シクロヘキシミド処理中に細胞をインキュベートするためのものと、ライセートを沸騰させてタンパク質を変性させるためのもの)が用意されていることをお勧めします。または、30 °Cウォーターバスは、シクロヘキシミドの存在下での細胞のインキュベーションに使用できます。ホットプレート付きの沸騰水浴は、タンパク質を変性させるために交互に使用できます。
12 x 15 mlコニカルチューブ用加熱ブロックフィッシャーサイエンティフィック11-473-70シクロヘキシミドの存在下での細胞のインキュベーション中にDri-Bath Heaterと一緒に使用します。
20 x 1.5 mlコニカルチューブ用加熱ブロックフィッシャーサイエンティフィック11-718-9QDri-Bath Heaterと一緒に使用して、タンパク質変性のためのライセートを沸騰させます。
SDS-PAGEの実行および転送装置、電源、およびSDS-PAGEおよび膜ラボおよびアプリケーションによって異なります
ウェスタンブロットイメージングシステム(例 Li-Cor Odyssey CLxスキャナーおよびImage Studioソフトウェア)Li-Cor9140-01ラボおよびアプリケーションによって異なります
EMD Millipore Immobilon PVDF トランスファーメンブレンフィッシャーサイエンティフィックIPFL00010ラボとアプリケーションによって異なります
一次抗体 (例 ホスホグリセリン酸キナーゼ (Pgk1) モノクローナル抗体、マウス (クローン 22C5D8))ライフテクノロジーズ 459250ラボとアプリケーションによって異なります
二次抗体 (例 Alexa-Fluor 680 ウサギ抗マウス IgG (H + L))ライフテクノロジーズ A-21065ラボとアプリケーションによって異なります
ック用ニューブランズウィック交換ドラムチューブで使用するため への転写用のイメージング機器または暗室

参考文献

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