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方法論記事

共培養アッセイは、神経膠芽腫の浸潤のマクロファージとミクログリアの刺激を研究します

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DOI：

10.3791/53990

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2016年10月20日

 ,  ,  , 
1New Jersey Center for Science, Technology and Mathematics, Kean University, 2Department of Physiology and Medical Physics, Royal College of Surgeons in Ireland, 3The Feinstein Institute for Medical Research at North Shore-LIJ, 4Department of Anatomy and Structural Biology, Gruss Lipper Biophotonics Center, Albert Einstein College of Medicine

この記事について

サマリー

癌の悪性挙動を理解するには、腫瘍細胞がマクロファージなどの腫瘍微小環境の構成要素とどのように相互作用するかについての正確なモデルを作成する必要があります。ここでは、膠芽腫細胞と腫瘍関連マクロファージおよびミクログリアとの相互作用を研究するための2つの方法について説明し、膠芽腫の浸潤への影響

が評価されます。

要約

多形性膠芽腫（グレードIVの神経膠腫）は、1年後の診断の生存期間中央値と非常に攻撃的なヒトの癌です。膠芽腫を引き起こす分子事象の増加の理解にもかかわらず、この癌は、依然として従来の治療に非常に難治性のままです。ハイグレードの脳腫瘍の外科的切除が原因で神経膠芽腫細胞の高度に浸潤性のためまれに完了です。したがって、神経膠芽腫細胞の浸潤を減衰させる治療的アプローチは魅力的な選択肢です。私たちの研究室や他の人は、腫瘍関連マクロファージとミクログリア（常駐脳マクロファージ）が強く、神経膠芽腫の浸潤を刺激することが示されています。この論文に記載されたプロトコルは、インビトロ培養アッセイを使用して、神経膠芽腫、マクロファージ/ミクログリアの相互作用をモデル化するために使用されます。このアプローチは、大幅にこの悪性behavを可能にマクロファージとの通信を妨害する薬剤の開発および/または検出を容易にすることができますIOR。 10倍 - 私たちは、ミクログリア/マクロファージは5によって神経膠腫細胞の浸潤を刺激する2堅牢な共培養浸潤アッセイを確立しています。蛍光タンパク質を発現する構成的に蛍光マーカーで標識された、または神経膠芽腫細胞は、マトリックスでコーティングされたポリカーボネートチャンバーインサートのマクロファージ/ミクログリアなしとでめっきまたは三次元マトリックス中に埋め込まれています。細胞浸潤は、フィルターの下側にのみ侵襲性の細胞画像に蛍光顕微鏡を用いてカウントすることによって評価されます。これらのアッセイを使用して、いくつかの薬理学的阻害剤（JNJ-28312141、PLX3397、ゲフィチニブ、およびSemapimod）は、マクロファージ/ミクログリアが神経膠芽腫の浸潤を刺激ブロックが同定されています。

概要

多形性膠芽腫は診断1,2時から約12ヶ月の生存期間中央値との積極的な人間の脳の癌です。神経膠芽腫は、それが標準的な化学療法と外科的切除に不応性であるとして最も致命的と臨床的に挑戦的な癌の一つです。神経膠芽腫のびまん性の性質は、外科的に完全に切除するために高度な腫瘍が事実上不可能に正常な脳全体に拡散するために、腫瘍細胞を可能にします。この高度に侵襲性の側面は、神経膠芽腫およびその他の高度な星細胞腫の顕著な特徴です。そのため、多くの研究の焦点は、神経膠芽腫細胞浸潤の分子機構にされています。神経膠芽腫腫瘍微小環境は、悪性腫瘍3-6の確立に重要な役割を果たしています。腫瘍関連マクロファージ/ミクログリアは、神経膠芽腫の浸潤7,8の促進に関与することが示されました。これらの研究のほとんどは、しかし、使用したマクロファージ/ミクログリアの効果を測定しました物理的に神経膠芽腫細胞からそれらを分離アッセイ。私たちの研究室では、私たちは、神経膠芽腫の浸潤は共培養中のマクロファージ/ミクログリアに依存し、どのように勉強し、画像に侵攻時にそれらの間の物理的相互作用を、私たちを有効にすることを可能にする改良されたアッセイを生成するために着手しました。

細胞浸潤を測定するための古典的なアッセイは、「標準」ボイデンチャンバー走化性および化学浸潤形式を含みます。ここで検討されるべき細胞は、（一般的に、直径が0.4と8μMの間で）指定したサイズの孔を有する底部にポリカーボネートフィルターが含まれているプラ​​スチック製のチャンバー内にめっきされます。細胞浸潤のプロセスは、通常、細胞外マトリックスタンパク質からなる物理的なバリアを含みます。化学浸潤アッセイにおいて、使用される好ましいマトリックスは、細胞外マトリックスタンパク質の混合物を、エンゲル-Holm-Swarm（EHS）マウス肉腫細胞によるマトリゲル（以下、「マトリックス」と呼ばれる）分泌され、COLの大部分から成りラゲンIV型及びラミニン。チャンバは次に浸潤を刺激することが疑われる成長因子の有無にかかわらず、細胞培養培地を含有する組織培養ウェル内に配置されています。高い浸潤能を有する細胞は、より高い周波数での細胞外マトリックスコーティングされたフィルタを介して侵入し、フィルターの下面に付着します。我々は、神経膠芽腫細胞の浸潤に対するミクログリアおよび腫瘍関連マクロファージの役割を評価するために、このアッセイを変更しました。

10倍9,10 -私たちは、ミクログリアが5で2神経膠芽腫細胞株の浸潤を刺激することができる。この論文の中に記載の共培養アッセイを用いて決定することができました。これは、神経膠芽腫の動物モデルで観察されたものが反映されます。さらに、我々は、神経膠芽腫細胞とマクロファージの間の相互作用/ミクログリアは、より直接的に調べることができる3次元浸潤アッセイを開発しました。 macrophaによって刺激神経膠芽腫細胞浸潤の程度3DアッセイにおけるGES /ミクログリアは、マトリックスコーティングされたチャンバーアプローチを用いて見られるものに匹敵します。同様のアッセイは、以前に侵攻11-13時のマクロファージと乳癌の相互作用を研究するために開発されました。このホワイトペーパーで説明する両方の方法は、神経膠芽腫細胞のマクロファージ/ミクログリア刺激された侵入の分子機構（s）を解剖する能力に役立つはずです。

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プロトコル

細胞の1.蛍光標識

注：蛍光色素9とラベルの神経膠芽腫細胞株およびミクログリア。あるいは、14に記載されるように構成かかるGFP / RFPなどの蛍光タンパク質を発現する細胞株を生成します。

  1. 染色の当日の80％コンフルエント - 6ウェルプレート上にプレート細胞は、それらが70となるように。ネズミの神経膠芽腫細胞株GL261とヒト膠芽腫細胞株U87については、染色の前に6センチの皿24時間にそれぞれのプレート1×10 6〜1.5×10 6細胞、。
  2. DMSO中の蛍光細胞染色用色素溶液を調製し、メディアに5μMの染料を追加し、ロズウェルパーク記念研究所培地（RPMI）またはマクロファージ無血清培地（MSFM）、渦もどちらか。
  3. 37℃で30分間、5％CO 2のための染料で細胞をインキュベートします。
  4. 染料含有培地を取り除き、細胞に新鮮な培地（RPMIまたはMSFM）を追加します。
  5. 30分間細胞をインキュベートします。注：細胞は、今あります染色し、実験に使用する準備ができ。

2.プレコートマトリックス商工共培養浸潤アッセイ

  1. ホルボールミリステートアセテート（PMA）15を用いて、THP-1細胞に分化します。
    1. 3×10 6ウェル培養プレート中でRPMI / 10％FBS中の1.5ミリリットルで5 THP-1細胞-プレート2。直ちにめっき後、100nMのPMAを添加し、48時間37℃、5％CO 2でインキュベートします。
      注：48時間後、正常に分化を受けたTHP-1細胞は接着となり、ウェル丸形態に取っての底に広がります。
    2. 1×PBSで1回洗浄することにより、PMAを削除して、新鮮なRPMI / 10％FBSと交換してください。細胞は、アッセイで使用する準備ができるまでは、別の48時間を待ちます。
  2. よく培地単独500μlの（無血清）を含有し、トップに培地単独の500μLを加えることでそれらを置くことによって、マトリックスプレコーティングチャンバを平衡化します。 37℃で2時間、5％CO 2のためのチャンバーをインキュベートします。
    注：プレコート室は、メーカーから購入しました。 マテリアル/機器の表を参照してください。
  3. 優しく細胞（蛍光標識された神経膠芽腫細胞株およびミクログリア/マクロファージ）を切り離すには、吸引によって細胞からメディアを取り出します。 2 mMのEDTA / PBSで皿に細胞を洗浄。 2 mMのEDTA / PBS500μlのを追加し、5インキュベート- 37℃の細胞インキュベーター中で10分間、5％CO 2。
  4. 0.3％ウシ血清アルブミン（BSA）を含む培地5ml中の細胞を再懸濁し。
  5. 120×gで5分間遠心分離します。
  6. （GL261細胞およびミクログリア用）MSFM / 0.3％BSA培地または細胞の濃度が1×10 6細胞/ mLに等しくなるように（U87およびTHP-1細胞）RPMI / 0.3％BSA中に吸引上清及び再懸濁ペレット。細胞をカウントし、血球計数器を使用してください。
  7. 24ウェルプレートのウェルあたり500μlの培地/ 0.3％BSAを追加します。
  8. 少なくとも2時間（ステップ2.2）平衡化されたチャンバーからメディアを取り出します。プレイスchambeよく500μlの培地/ 0.3％BSA（ステップ2.7）を含むでRS。
  9. 阻害剤は、マクロファージ/ミクログリアに対するそれらの効果は神経膠腫の浸潤を刺激し研究するために使用されている場合は、チャンバの底部及び頂部の両方に適切な濃度を追加します。
    注：CSF-1R阻害剤が完全にミクログリアを阻害するために使用されるの濃度は、GL261神経膠芽腫の浸潤は、基準9で見つけることができます刺激しました。
  10. マウス神経膠芽腫（2.10.1）およびヒト神経膠芽腫（2.10.2）：使用した細胞株に応じて、次の2つの手順で説明するように上部チャンバーにセルを追加。
    1. 1.5×10 5 GL261（グリア芽細胞腫）細胞（150μl）を5×10 4マウスミクログリア（50μl）を（メディア詳細については、ステップ2.6を参照してください）混ぜます。 300μlのMSFM / 0.3％BSAを添加することにより、500μlにボリュームを持参。上部チャンバーに細胞混合物を加え、48時間37℃、5％CO 2でインキュベートします。
      注：私が説明したようにマウスミクログリアは、新生仔マウスから単離され、nは1〜6。

7.5×10 4 U87（神経膠芽腫）細胞（75μl）を、2.5×10 4 THP1（マクロファージ）細胞（25μl）を混ぜます。 400μlのRPMI / 0.3％BSAを添加することにより、500μlのボリュームを持参してください。上部チャンバーに細胞混合物を追加します。 24時間37℃、5％CO 2で細胞をインキュベートします。

  1. インキュベーション後、穏やかな吸引により、チャンバの上部から細胞を除去し、PBS中の3.7％ホルムアルデヒド中で配置することにより、チャンバーを固定します。チャンバは、室温（または4℃で一晩）で15分間固定液中に残留することを可能にします。穏やかな吸引により固定液を削除し、500μlの1×PBSと交換してください。画像解析のためにセクション4に進んでください。
    注：実験は、この時点で一時停止し、1×PBSでのイメージングのために保存することができます。蛍光色素のシグナルは固定した後、最大2週間を検出することができます。

マトリックス中に神経膠腫およびマクロファージ/ミクログリアを-Embedding 3.浸潤アッセイ "3D"

  1. 4℃で一晩解凍マトリックスミックス。フード内氷の上にマトリクスを使用して、すべてのさらなる操作を実行します。
  2. 氷上で0.3％のBSAを含む培地中のマトリックスを10mg / mlの濃度（MSFMまたはRPMI）を準備します。
    注意：マトリックスのストック濃度は、典型的には約15 mg / mlです。
  3. マトリックス中の懸濁液のために（ステップ1で標識された）細胞を調製するために、吸引によって細胞からメディアを取り出します。 2 mMのEDTA / PBSで皿に細胞を洗浄。細胞に2 mMのEDTA / PBS500μlのを追加し、5インキュベート- 37℃のインキュベーター中で10分間、5％CO 2。
  4. 0.3％BSAを含有する培地5ml中に再懸濁細胞。
  5. 120×gで5分間遠心分離します。
  6. ペレットから上清を吸引。細胞濃度が1×10 6細胞/ mlに等しくなるように培地/ 0.3％BSA中に再懸濁し、ペレット。細胞をカウントし、血球計数器を使用してください。
  7. 1.5mlマイクロチューブに+ 5×10 4ミクログリア細胞（50μl中）（150μlの中で）1.5×10 5 GL261細胞を追加します。別々の1.5mlマイクロチューブに2×10 5 GL261細胞（200μl）を追加します。
    注：単独でミクログリアのないGL261細胞は、コントロールとして機能します。
  8. 120×gで5分間微量のスピン細胞。
  9. 氷上で200μlの冷間マトリックス中の細胞を再懸濁し。
  10. 8μM細孔径室インサートの上部の区画の中心上にプレートを50μl（50,000細胞）。
  11. 重合が起こるために、37℃で30分間インキュベートします。
  12. 上部チャンバーに200μlの無血清培地と下部ウェルに細胞増殖培地を含有する700μlの血清を加えます。
  13. 48時間37℃、5％CO 2でインキュベートします。
  14. インキュベーション後、穏やかな吸引により、チャンバの上部から細胞を除去し、PBS中の3.7％ホルムアルデヒド中で配置することにより、チャンバーを固定します。チャンバは、室温（または4℃で一晩）で15分間固定液中に残留することを可能にします。穏やかな吸引により固定液を削除し、500μlの1×PBSと交換してください。セクション4 FOに進んでくださいR画像解析。

4.イメージングアッセイ

  1. 3.7％ホルムアルデヒドからチャンバーを外し、十分に新鮮な500μlの1×PBSを含むで洗います。
    注：チャンバーを乾燥させないでください。
  2. 綿の先端に付いたアプリケーターを使用して、静かにフィルタ表面をこすることによって、フィルタの上部（側が室内側）から非侵襲性の細胞をきれいに。静かにスタートし、徐々に圧力を高めます。室あたり、この少なくとも3回の操作を行います。
  3. いずれかのガラス底の皿に室を配置するか、24ウェルプレートに残します。
  4. カメラと画像キャプチャソフトウェア9,10を備えた落射蛍光またはレーザー共焦点蛍光顕微鏡のステージ上にサンプルを置きます。
  5. 代表的なフィールドのいくつかの10倍または20倍の画像を取ります。
  6. そのようなImageJのように、画像解析ソフトウェアを用いて、下9,10にフィルタを超えた神経膠芽腫細胞の数を数えます。
  7. 「3Dを撮影する場合」（セクション3に記載されている）浸潤アッセイは、蛍光レーザー共焦点顕微鏡5-6を用いて、Zスタックシリーズを生成し、画像にフィルターの下側の浸潤性細胞集団、プロトコルは4.2手順に従って- 。上記の4.6。

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結果

ここで概説した方法を用いて、ミクログリアおよびマクロファージは、実質的に神経膠芽腫細胞の浸潤を刺激することができることを示しています。二つの異なる浸潤アッセイが使用されると、図1に示されている。 図2では、構成的に蛍光タンパク質mCherryを発現するGL261細胞を用いて、48時間、ミクログリアなしプレコートチャンバー上にプレーティングしました。侵襲的な容量は約10倍増加したとき、培養ミクログリアとGL261細胞は、しかし、自分自身で低侵襲性でした。

我々は、ヒト細胞株を用いて同様の効果を観察します。分化したTHP-1細胞と共培養すると、 図3では、（5-クロロメチルジアセテート（CMFDA）緑で染色）U87細胞が5-6倍高い侵入を示しています。 THP-1（急性単球性白血病患者由来）は、ヒト単球細胞株であってもよいジありますホルボールミリステートア...

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ディスカッション

ハイグレード星細胞腫と神経膠芽腫の高度に侵襲性の性質は、これらの脳の癌は非常に致命的な作り。これは、神経膠芽腫の浸潤の分子・細胞メカニズムを理解することが最も重要です。多くはすでに17神経膠芽腫の浸潤のプロセスについて学習しました。 10倍 - 本論文で詳述アッセイフォーマットを使用して、私たちの研究室では、マウスおよび腫瘍関連マクロファージは5で神経膠腫細胞の浸潤を刺激することができる人間のモデルの両方に示されています。この共培養モデルは忠実に、潜在的に間の双方向通信に関与している（このようなノッチ・デルタおよびエフリンのEphなどのリガンド - 受容体系を介して）パラクリンとジャクスタクリンの相互作用を可能にする物理的にマクロファージ/ミクログリアと相互作用する神経膠芽腫細胞の能力を複製します腫瘍細胞およびマクロファージ。神経膠腫細胞の浸潤に対するマクロファージの影響を発見しようとする他のアッセイ形式は、一般的に細胞を持っていますマクロファージは井戸の底にプレーティングし、神経膠芽腫細胞がチャンバ3,4にされているように、物理的に分離しました。したがって、これらの研究は、マクロファージ刺激...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

これらの研究のためにマウスミクログリアを提供してくださったKonstantin Dobrenis博士に感謝いたします。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Corning BioCoat Matrigel Invasion Chamber: BD Matrigel Matrix Corning/Fisher ScientificCat: 354481
Macrophage Serum Free Media (MSFM) (500 ml)Life Technologies12065-074
CellTracker Red CMTPX DyeLife Technologies/Molecular ProbesC34552
CellTracker Green CMFDA DyeLife Technologies/Molecular ProbesC2925
GL261 細胞株National Cancer Institute (NCI)
U87 cell lineAmerican Tissue Type Culture CollectionHTB-14
THP-1 cell lineAmerican Tissue Type Culture CollectionATCC TIB-202
RPMI 1640 Medium (500 ml)Life Technologies/Gibco11875-093
ホルムアルデヒド溶液SigmaAldrichF1635
Corning Transwell ポリカーボネート膜細胞培養インサート (8 & micro;Mポア)パックあたり48。CorningCLS3422
Cultrex 3-D Culture Matrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, PathClearTrevigen3445-005-01
牛胎児血清 (FBS)Life TechnologiesCat: 10500064
ウシ血清アルブミン、フラクションV、ヒートショック処理FisherscientificBP1600-100
0.5 M EDTAThermoFisher Scientific15575-020
ホルボール 12-ミリスチン酸 13-アセテート (PMA)Sigma AldrichP8139-1MG
子

参考文献

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