共培養アッセイは、神経膠芽腫の浸潤のマクロファージとミクログリアの刺激を研究します

多形性膠芽腫は診断^1,2時から約12ヶ月の生存期間中央値との積極的な人間の脳の癌です。神経膠芽腫は、それが標準的な化学療法と外科的切除に不応性であるとして最も致命的と臨床的に挑戦的な癌の一つです。神経膠芽腫のびまん性の性質は、外科的に完全に切除するために高度な腫瘍が事実上不可能に正常な脳全体に拡散するために、腫瘍細胞を可能にします。この高度に侵襲性の側面は、神経膠芽腫およびその他の高度な星細胞腫の顕著な特徴です。そのため、多くの研究の焦点は、神経膠芽腫細胞浸潤の分子機構にされています。神経膠芽腫腫瘍微小環境は、悪性腫瘍^3-6の確立に重要な役割を果たしています。腫瘍関連マクロファージ/ミクログリアは、神経膠芽腫の浸潤^7,8の促進に関与することが示されました。これらの研究のほとんどは、しかし、使用したマクロファージ/ミクログリアの効果を測定しました物理的に神経膠芽腫細胞からそれらを分離アッセイ。私たちの研究室では、私たちは、神経膠芽腫の浸潤は共培養中のマクロファージ/ミクログリアに依存し、どのように勉強し、画像に侵攻時にそれらの間の物理的相互作用を、私たちを有効にすることを可能にする改良されたアッセイを生成するために着手しました。

細胞浸潤を測定するための古典的なアッセイは、「標準」ボイデンチャンバー走化性および化学浸潤形式を含みます。ここで検討されるべき細胞は、（一般的に、直径が0.4と8μMの間で）指定したサイズの孔を有する底部にポリカーボネートフィルターが含まれているプラ​​スチック製のチャンバー内にめっきされます。細胞浸潤のプロセスは、通常、細胞外マトリックスタンパク質からなる物理的なバリアを含みます。化学浸潤アッセイにおいて、使用される好ましいマトリックスは、細胞外マトリックスタンパク質の混合物を、エンゲル-Holm-Swarm（EHS）マウス肉腫細胞によるマトリゲル（以下、「マトリックス」と呼ばれる）分泌され、COLの大部分から成りラゲンIV型及びラミニン。チャンバは次に浸潤を刺激することが疑われる成長因子の有無にかかわらず、細胞培養培地を含有する組織培養ウェル内に配置されています。高い浸潤能を有する細胞は、より高い周波数での細胞外マトリックスコーティングされたフィルタを介して侵入し、フィルターの下面に付着します。我々は、神経膠芽腫細胞の浸潤に対するミクログリアおよび腫瘍関連マクロファージの役割を評価するために、このアッセイを変更しました。

10倍^9,10 -私たちは、ミクログリアが5で2神経膠芽腫細胞株の浸潤を刺激することができる。この論文の中に記載の共培養アッセイを用いて決定することができました。これは、神経膠芽腫の動物モデルで観察されたものが反映されます。さらに、我々は、神経膠芽腫細胞とマクロファージの間の相互作用/ミクログリアは、より直接的に調べることができる3次元浸潤アッセイを開発しました。 macrophaによって刺激神経膠芽腫細胞浸潤の程度3DアッセイにおけるGES /ミクログリアは、マトリックスコーティングされたチャンバーアプローチを用いて見られるものに匹敵します。同様のアッセイは、以前に侵攻^11-13時のマクロファージと乳癌の相互作用を研究するために開発されました。このホワイトペーパーで説明する両方の方法は、神経膠芽腫細胞のマクロファージ/ミクログリア刺激された侵入の分子機構（s）を解剖する能力に役立つはずです。

細胞の1.蛍光標識

注：蛍光色素⁹とラベルの神経膠芽腫細胞株およびミクログリア。あるいは^、14に記載されるように構成かかるGFP / RFPなどの蛍光タンパク質を発現する細胞株を生成します。

1. 染色の当日の80％コンフルエント - 6ウェルプレート上にプレート細胞は、それらが70となるように。ネズミの神経膠芽腫細胞株GL261とヒト膠芽腫細胞株U87については、染色の前に6センチの皿24時間にそれぞれのプレート1×10 ^{6〜1.5×10 6}細胞、。
2. DMSO中の蛍光細胞染色用色素溶液を調製し、メディアに5μMの染料を追加し、ロズウェルパーク記念研究所培地（RPMI）またはマクロファージ無血清培地（MSFM）、渦もどちらか。
3. 37℃で30分間、5％CO ₂のための染料で細胞をインキュベートします。
4. 染料含有培地を取り除き、細胞に新鮮な培地（RPMIまたはMSFM）を追加します。
5. 30分間細胞をインキュベートします。注：細胞は、今あります染色し、実験に使用する準備ができ。

2.プレコートマトリックス商工共培養浸潤アッセイ

1. ホルボールミリステートアセテート^{（PMA）15を}用いて^、THP-1細胞に分化します。
   1. 3×10 6ウェル培養プレート中でRPMI / 10％FBS中の1.5ミリリットルで⁵ THP-1細胞-プレート2。直ちにめっき後、100nMのPMAを添加し、48時間37℃、5％CO ₂でインキュベートします。
      注：48時間後、正常に分化を受けたTHP-1細胞は接着となり、ウェル丸形態に取っての底に広がります。
   2. 1×PBSで1回洗浄することにより、PMAを削除して、新鮮なRPMI / 10％FBSと交換してください。細胞は、アッセイで使用する準備ができるまでは、別の48時間を待ちます。
2. よく培地単独500μlの（無血清）を含有し、トップに培地単独の500μLを加えることでそれらを置くことによって、マトリックスプレコーティングチャンバを平衡化します。 37℃で2時間、5％CO ₂のためのチャンバーをインキュベートします。
   マテリアル/機器の表を参照してください。
3. 優しく細胞（蛍光標識された神経膠芽腫細胞株およびミクログリア/マクロファージ）を切り離すには、吸引によって細胞からメディアを取り出します。 2 mMのEDTA / PBSで皿に細胞を洗浄。 2 mMのEDTA / PBS500μlのを追加し、5インキュベート- 37℃の細胞インキュベーター中で10分間、5％CO _2。
4. 0.3％ウシ血清アルブミン（BSA）を含む培地5ml中の細胞を再懸濁し。
5. 120×gで5分間遠心分離します。
6. （GL261細胞およびミクログリア用）MSFM / 0.3％BSA培地または細胞の濃度が1×10 ⁶細胞/ mLに等しくなるように（U87およびTHP-1細胞）RPMI / 0.3％BSA中に吸引上清及び再懸濁ペレット。細胞をカウントし、血球計数器を使用してください。
7. 24ウェルプレートのウェルあたり500μlの培地/ 0.3％BSAを追加します。
8. 少なくとも2時間（ステップ2.2）平衡化されたチャンバーからメディアを取り出します。プレイスchambeよく500μlの培地/ 0.3％BSA（ステップ2.7）を含むでRS。
9. 阻害剤は、マクロファージ/ミクログリアに対するそれらの効果は神経膠腫の浸潤を刺激し研究するために使用されている場合は、チャンバの底部及び頂部の両方に適切な濃度を追加します。
   注：CSF-1R阻害剤が完全にミクログリアを阻害するために使用されるの濃度は、GL261神経膠芽腫の浸潤は、基準⁹で見つけることができます刺激しました。
10. マウス神経膠芽腫（2.10.1）およびヒト神経膠芽腫（2.10.2）：使用した細胞株に応じて、次の2つの手順で説明するように上部チャンバーにセルを追加。
    1. 1.5×10 ⁵ GL261（グリア芽細胞腫）細胞（150μl）を5×10 ⁴マウスミクログリア（50μl）を（メディア詳細については、ステップ2.6を参照してください）混ぜます。 300μlのMSFM / 0.3％BSAを添加することにより、500μlにボリュームを持参。上部チャンバーに細胞混合物を加え、48時間37℃、5％CO ₂でインキュベートします。
       注：私が説明したようにマウスミクログリアは、新生仔マウスから単離され、nは^1〜6。

7.5×10 ⁴ U87（神経膠芽腫）細胞（75μl）を、2.5×10 ⁴ THP1（マクロファージ）細胞（25μl）を混ぜます。 400μlのRPMI / 0.3％BSAを添加することにより、500μlのボリュームを持参してください。上部チャンバーに細胞混合物を追加します。 24時間37℃、5％CO ₂で細胞をインキュベートします。

1. インキュベーション後、穏やかな吸引により、チャンバの上部から細胞を除去し、PBS中の3.7％ホルムアルデヒド中で配置することにより、チャンバーを固定します。チャンバは、室温（または4℃で一晩）で15分間固定液中に残留することを可能にします。穏やかな吸引により固定液を削除し、500μlの1×PBSと交換してください。画像解析のためにセクション4に進んでください。
   注：実験は、この時点で一時停止し、1×PBSでのイメージングのために保存することができます。蛍光色素のシグナルは固定した後、最大2週間を検出することができます。

マトリックス中に神経膠腫およびマクロファージ/ミクログリアを-Embedding 3.浸潤アッセイ "3D"

1. 4℃で一晩解凍マトリックスミックス。フード内氷の上にマトリクスを使用して、すべてのさらなる操作を実行します。
2. 氷上で0.3％のBSAを含む培地中のマトリックスを10mg / mlの濃度（MSFMまたはRPMI）を準備します。
   注意：マトリックスのストック濃度は、典型的には約15 mg / mlです。
3. マトリックス中の懸濁液のために（ステップ1で標識された）細胞を調製するために、吸引によって細胞からメディアを取り出します。 2 mMのEDTA / PBSで皿に細胞を洗浄。細胞に2 mMのEDTA / PBS500μlのを追加し、5インキュベート- 37℃のインキュベーター中で10分間、5％CO _2。
4. 0.3％BSAを含有する培地5ml中に再懸濁細胞。
5. 120×gで5分間遠心分離します。
6. ペレットから上清を吸引。細胞濃度が1×10 ⁶細胞/ mlに等しくなるように培地/ 0.3％BSA中に再懸濁し、ペレット。細胞をカウントし、血球計数器を使用してください。
7. 1.5mlマイクロチューブに+ 5×10 ⁴ミクログリア細胞（50μl中）（150μlの中で）1.5×10 ⁵ GL261細胞を追加します。別々の1.5mlマイクロチューブに2×10 ⁵ GL261細胞（200μl）を追加します。
   注：単独でミクログリアのないGL261細胞は、コントロールとして機能します。
8. 120×gで5分間微量のスピン細胞。
9. 氷上で200μlの冷間マトリックス中の細胞を再懸濁し。
10. 8μM細孔径室インサートの上部の区画の中心上にプレートを50μl（50,000細胞）。
11. 重合が起こるために、37℃で30分間インキュベートします。
12. 上部チャンバーに200μlの無血清培地と下部ウェルに細胞増殖培地を含有する700μlの血清を加えます。
13. 48時間37℃、5％CO ₂でインキュベートします。
14. インキュベーション後、穏やかな吸引により、チャンバの上部から細胞を除去し、PBS中の3.7％ホルムアルデヒド中で配置することにより、チャンバーを固定します。チャンバは、室温（または4℃で一晩）で15分間固定液中に残留することを可能にします。穏やかな吸引により固定液を削除し、500μlの1×PBSと交換してください。セクション4 FOに進んでくださいR画像解析。

4.イメージングアッセイ

1. 3.7％ホルムアルデヒドからチャンバーを外し、十分に新鮮な500μlの1×PBSを含むで洗います。
   注：チャンバーを乾燥させないでください。
2. 綿の先端に付いたアプリケーターを使用して、静かにフィルタ表面をこすることによって、フィルタの上部（側が室内側）から非侵襲性の細胞をきれいに。静かにスタートし、徐々に圧力を高めます。室あたり、この少なくとも3回の操作を行います。
3. いずれかのガラス底の皿に室を配置するか、24ウェルプレートに残します。
4. カメラと画像キャプチャソフトウェア^9,10を備えた落射蛍光またはレーザー共焦点蛍光顕微鏡のステージ上にサンプルを置きます。
5. 代表的なフィールドのいくつかの10倍または20倍の画像を取ります。
6. そのようなImageJのように、画像解析ソフトウェアを用いて、下^9,10にフィルタを超えた神経膠芽腫細胞の数を数えます。
7. 「3Dを撮影する場合」（セクション3に記載されている）浸潤アッセイは、蛍光レーザー共焦点顕微鏡^5-6を用いて、Zスタックシリーズを生成し、画像にフィルターの下側の浸潤性細胞集団、プロトコルは4.2手順に従って- 。上記の4.6。

ここで概説した方法を用いて、ミクログリアおよびマクロファージは、実質的に神経膠芽腫細胞の浸潤を刺激することができることを示しています。二つの異なる浸潤アッセイが使用されると、図1に示されている。 図2では、構成的に蛍光タンパク質mCherryを発現するGL261細胞を用いて、48時間、ミクログリアなしプレコートチャンバー上にプレーティングしました。侵襲的な容量は約10倍増加したとき、培養ミクログリアとGL261細胞は、しかし、自分自身で低侵襲性でした。

我々は、ヒト細胞株を用いて同様の効果を観察します。分化したTHP-1細胞と共培養すると、 図3では、（5-クロロメチルジアセテート（CMFDA）緑で染色）U87細胞が5-6倍高い侵入を示しています。 THP-1（急性単球性白血病患者由来）は、ヒト単球細胞株であってもよいジありますホルボールミリステートアセテート（PMA）15を用いて、マクロファージ様の状態にfferentiated。分化したTHP-1細胞は、サイトカイン分泌、および食作用を行う能力は、ヒトマクロファージの特徴の多くを示します。

あるいは、細胞浸潤は、マトリックス中に埋め込む、チャンバインサートでフィルター上に直接めっきすることにより測定することができます。レーザー共焦点顕微鏡は、三次元表現（Zスタック）を生成する一連の画像を生成するために使用することができます。 （ 図2に示されている- 3）マトリックスでコーティングされたチャンバーアッセイで観察されるものと同様に、（赤CMPTXで染色された）小膠細胞の共培養は、交差した細胞の数によって測定されるGL261細胞（CMFDA緑）が侵入する刺激しますフィルターの下側に（ 図4）。このフォーマットはglio間の潜在的な細胞 - 細胞相互作用を可視化することができるという追加の利点を有しています侵入時の芽細胞腫細胞とミクログリア。実際、ミクログリアは密接に3Dマトリックス（ 図5）に懸濁神経膠腫細胞に関連付けるように見えます。唯一のエンドポイント分析を必要とレーザー共焦点が利用可能でない場合、マトリックスコーティングされたチャンバについて記載したように、セル室を洗浄することができます。残りの（侵襲性）細胞の数は、標準的な落射蛍光顕微鏡から得られた画像を用いて計数することによって決定することができる。 映画1は、このようなアッセイの立体組立を示す図です。

図1： ミクログリア/マクロファージ刺激神経膠芽腫細胞をアッセイするための2つの異なるプロトコルの概略は浸潤トップパネルには、事前にコーティングされたマトリックスチャンバー浸潤アッセイ（セクション2）を示します。下のパネルは、3Dマトリックス浸潤アッセイ（セクション3）を示しています。図から適応9。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2.ミクログリア（MG）GL261神経膠芽腫細胞の浸潤を強化します。 （A）非存在下でのGL261細胞を（mCherryをを表す）侵入の代表的な画像（左パネル;単独GL261）またはミクログリアの存在（右パネル; GL261 + MG）は、48のインキュベーションに続いて、結合され、マトリックスでコーティングされたチャンバーに播種しました時間と、フィルタを横断した細胞の数を評価します。 10×対物レンズを使用して撮影した画像。スケールバー= 400μM。（B）アッセイは唯一の侵襲性GL261細胞（赤）をカウントの定量。示されたデータは、3つの独立した実験からの平均±SEMである。presencにおけるミクログリア刺激GL261浸潤の（C）定量薬理学的阻害剤であるゲフィチニブ（5μM）、JNJ-28312141（10μM）、PLX3397（1μM）、PLX5562（1μM）の電子。示されたデータは、6つの独立した実験からの平均±SEMである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3. THP1マクロファージは、U87神経膠芽腫細胞の浸潤を強化します。または分化THP1マクロファージ（右パネル; U87 + THP1）で、CMFDAグリーンで染色されたU87細胞に侵入の（A）代表的な画像だけでは（U87左パネル）マトリックスでコーティングされたチャンバー上にプレーティング24時間培養し、その後の評価フィルタを超えたセルの数。 10×対物レンズを使用して撮影した画像。スケールバー= 400μM。のみカウントアッセイの（B）定量侵襲性U87細胞（緑）。示されたデータは、10の独立した実験からの平均±SEMです。

。（またはマウスミクログリアで、 図GL261とミクログリアの共培養の4次元浸潤アッセイ示す（A）画像だけでは、マトリックス中に埋め込まれた（グリーンCMFDAで染色）GL261細胞の画像のZシリーズからの突起（GL261左パネル）です右側のパネル; GL261 + MG）CMPTX赤で標識されました。 Z-突起はチャンバーフィルターの底部を含む画像スタックの底部4のスライスであったため、侵襲性の細胞を表します。スケールバー=200μmである。GL261細胞（緑色）の（B）の定量は、上述したように、フィルタの下側にあると判断しました。侵入GL261細胞の総数を決定し、単一栽培におけるGL261細胞のそれに標準化しました。示されたデータは、平均±Sを表し、重複した（10から適応図）で行われる3つの独立した実験のEMが。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

GL261の3Dスタック内のスライス（緑）、マトリックス中に埋め込まれたミクログリア（赤）の共培養から 図5. イメージ。GL261およびミクログリア細胞の相互作用は、白い矢印で強調表示されます。スケールバー= 100μM。

ムービー1：GL261（緑）、ミクログリア（赤）の共培養から撮影した画像の全体のZシリーズの3D投影のX軸周りの3D回転における神経膠芽腫およびミクログリアの相互作用はミリアンペアに埋め込まれましたトリックス。スライスは5μM単位である。 このビデオを見るにはこちらをクリックしてください。

著者らは開示するものは何もない。