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方法論記事

インビボでのバイオセンサーは、 ショウジョウバエの非アポトーシスカスパーゼ活性を追跡します

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DOI:

10.3791/53992

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2016年11月27日

 ,  ,  , 
1W. Harry Feinstone Department of Molecular Microbiology and Immunology, Johns Hopkins University Bloomberg School of Public Health, 2School of Life Sciences, Chinese University of Hong Kong

この記事について

サマリー

カスパーゼ活性の低いレベルを含む全動物に健康な細胞を検出するために、CaspaseTracker指定された高感度バイオセンサーは、 ショウジョウバエのために生成されました。カスパーゼ依存性のバイオセンサーの活性は、死刺激の非存在下で最適化された条件下で飼育した成体動物の臓器全体長寿命健康な細胞で検出されます。

要約

Caspaseは、そのタンパク質分解活性を通じてアポトーシス細胞死の主要なメディエーターです。カスパーゼが細胞内で利用可能な技術で検出可能なレベルまで活性化されると、一般にアポトーシスはその後すぐに起こると想定されます。カスパーゼは、多くの機能的および構造的成分を切断し、数分以内に迅速かつ完全な細胞破壊を引き起こす可能性があります。しかし、蓄積された証拠は、正常な健康な細胞では、同じカスパーゼがおそらくより低い酵素レベルで他の機能を持っていることを示しています。非アポトーシス性カスパーゼ活性の研究は、低レベルのカスパーゼ活性の検出と、生体内での最終的な細胞運命の追跡が困難であることによって妨げられてきました。ここでは、動物全体でカスパーゼ活性を経験した細胞を永久にラベルする超高感度カスパーゼレポーターであるCaspaseTrackerの使用について説明します。このショウジョウバエ用2色CaspaseTrackerバイオセンサーは、最近または進行中のカスパーゼ活性を示すために赤色蛍光タンパク質(RFP)を一過性に発現し、過去にカスパーゼ活性を経験した細胞で緑色蛍光タンパク質(GFP)を永久に発現しますが、死滅していません。重要なことに、このカスパーゼ依存性のin vivoバイオセンサーは、成虫のハエ全体の臓器系組織における非アポトーシス性カスパーゼ活性の存在を容易に明らかにします。これは、個々のハエの全マウント解剖を使用して、脳、腸、マルピーギ尿細管、噴門、卵巣管、およびその他の組織全体の健康な細胞のバイオセンサー活性を検出することで実証されています。CaspaseTrackerは、カスパーゼ活性化の少なくとも10日後に成体ニューロンや他の組織でバイオセンサー活性が検出されるため、長寿命細胞の非アポトーシス性カスパーゼ活性を検出します。このバイオセンサーは、生きた動物における非アポトーシス性カスパーゼ活性の役割と分子メカニズムを明らかにするための重要なツールとして機能します。

概要

カスパーゼは、キーアスパラギン残基の後に多くの細胞内のタンパク質を切断することにより、アポトーシス細胞死を仲介するシステインプロテアーゼです。例えば、イニシエーターカスパーゼは、エフェクターカスパーゼ、活性化するDNAヌクレアーゼ、切断する細胞骨格成分を活性化し、急速に細胞を分解し、細胞の死骸の処分隣接細胞によってそれらの認識と貪食を刺激するために、細胞膜の脂質組成を変化させる。1-4それが推定されます細胞数十億は、ヒトの体内で一日あたり死亡し、アポトーシスが化学療法誘発性腫瘍細胞死の重要なメカニズムである。5カスパーゼの異なるセットは、先天性免疫を刺激する別個の非アポトーシス過程による細胞死を引き起こす可能性があります。6ので、カスパーゼ上のほとんどの研究は、それらのプロ死の機能に焦点を当てています。

興味深いことに、フィールドの初期の証拠は、細胞死を促進する責任同じカスパーゼは、非死Fを有していることを明らかにしましたunctions。先駆的な研究では、カスパーゼは、胚形成の間の細胞の増殖および遊走の調節を含む正常細胞における多様な細胞機能に関与していることが示されている。7-9カスパーゼが代替ネクロトーシス細胞死経路を遮断するため、 ショウジョウバエ 10,11に精子細胞を個別に必要とされますマウス12,13で、およびマイクロRNAの処理のためにCでエレガンス 。おそらく最長寿命の細胞、ニューロン、カスパーゼおよび他のアポトーシス機構は、シナプス終末を剪定することによって神経活動の調節に学習や記憶のための他のシナプスを強化することが不可欠であると考えられてプロセスを関与している。16で14,15 18カスパーゼは、全細胞死なしで小さな神経突起のミニアポトーシスのタイプによってシナプス刈り込みを容易にすることが可能である。19しかし、カスパーゼはアポトーシスのようなイベントとは無関係の代替機能を有していてもよい。20,21二重の役割生と死でsがカスパーゼに固有のものではありません。 BCL-2ファミリータンパク質とシトクロムcは、健康な細胞における細胞エネルギー論における役割を持っているだけでなく、細胞ストレスの多くの種類によって活性化されるコアアポトーシス経路の一部である。22-25証明されていないが、進化は日がリンクされていることを論理的なようです不適当または望ましくない細胞のタイムリーな除去を確実にするために、同じ分子内の死ジョブに-jobs。

現在のところ、非アポトーシスカスパーゼ活性の分子メカニズムは理解されていない、および胚発生中および成体組織における非アポトーシスカスパーゼ活性の程度もまた知られていません。大きな課題は、カスパーゼの死の仕事から一日の仕事を区別するのが困難なことです。カスパーゼ活性は、タンパク質分解カスケードによって増幅された場合、アポトーシスおよびpyroptosisとは対照的に、カスパーゼの日の仕事は、多くの利用可能なTECHNによる検出以下おそらく、酵素活性の非常に低いレベルで発生することが予想されますologies。

ここで提示作業の前に、他のものは、異なる目的のためにカスパーゼバイオセンサの様々な開発しました。 SCATバイオセンサー（ 例えば 、ECFP-DEVD-金星）急速にFRETを用いて培養細胞や動物組織におけるリアルタイムのカスパーゼ活性を検出する。26,27カスパーゼ切断されると、Apolinerの核標的GFP部分（mCD8-RFP-DQVD- nucGFP）その形質膜テザーは、カスパーゼによって切断されるときに数分以内に細胞内再局在を受ける。28同様に、ApoAlert-pCaspase3センサー（NES-DEVD-YFP-NLS）は、カスパーゼ切断の際に核に細胞質ゾルからrelocalizes。29,30詳細最近、iCasperにおける発色団は、巧みショウジョウバエ胚のニューロンでリアルタイムにバイオセンサ活性の検出を可能にする、カスパーゼによって開裂が、主に発達、細胞死に関連したときに蛍光を発するように操作した。嗅覚ニューロンの31カスパーゼ依存性死たエージング中demonstCPVバイオセンサー（ 例えば、mCD8-PARP-金星）のカスパーゼ切断形の免疫検出することによって評価した。32,33重要なのは、カスパーゼ3の活性化形態は、棘に敏感な免疫染色による細胞死の非存在下で検出されましたこのように、新たなカスパーゼバイオセンサーを検出するために、培養神経細胞、および細胞体に核CellEventレポーター色素のカスパーゼ依存性蛍光を用いたが、細胞死は背骨除去後まで延期されたものの難しさが、原因フォト毒性に遭遇した。19を必要としていますおよびin vivoでの基礎カスパーゼ活性を有する細胞を追跡。

これらの困難を克服するために、我々はCaspaseTracker指定された新規のデュアルカラーカスパーゼバイオセンサーを、生成されました。この戦略は、恒久的に、in vivoで細胞を標識し、追跡するために、 ショウジョウバエ G-TRACE FRTリコンビナーゼ系34とショウジョウバエカスパーゼ敏感Apolinerバイオセンサー28の修正版を兼ね備えています。<> 35 SUP GAL4活性化G-TRACEシステムは、カスパーゼの非常に低いレベルが今までカスパーゼ活性を経験している任意の細胞で細胞質と恒久的な核標的GFP発現にRFPの発現をもたらす、CaspaseTrackerを活性化することができます。35このシステムはラベルを付けることができキイロショウジョウバエ 、カスパーゼおよび細胞死の研究のための扱いやすいと広く使用されているモデル系を用いて、動物全体での生活を通して細胞。36-38

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プロトコル

CaspaseTrackerのハエの調製

  1. CaspaseTracker（DQVD）は実験のために飛ぶ準備するには、このクロスを行います。UBI-CaspaseTrackerは G-TRACE X（UAS-RFP; UAS-FLPを、ユービーアイ>停止> GFP-NLS）、7-10処女女性（または男性）を転送することにより、一緒に男性（または女性）の数が同じでユビキチンプロモーター35によって駆動されるカスパーゼのバイオセンサー基板mCD8-DIAP1-GAL4 G-のホモ接合組み合わせの致死性を回避するために、第2染色体CYOバランサを持つG-TRACEのハエを、運ぶハエTRACE（UAS-RFP、UAS-FLP、およびユービーアイ>停止> GFP-NLS）34。場所は、タンパク質源として新鮮な酵母ペーストで生鮮食品のバイアルに飛びます。
  2. 5〜7日（最大2週間）のために18℃でファイルをインキュベートし、新しい子孫で混雑を避けるために、新たな繁殖バイアルを設定するためにバイアルから親ハエを削除します。
  3. 子孫が孵化するハエまで18℃でインキュベーションを続けます。非CYOを選択し、[非CCaspaseTrackerとG-TRACE要素35のためのトランスジェニックでurly翼] CaspaseTrackerの正しい遺伝子型の子孫、。
  4. 同時に、制御親の非トランスジェニックw118ハエおよびカスパーゼ非感受性を生成する（DQVA）は、特定のCaspaseTrackerのRFPとGFP蛍光を確認するために、並行して飛びます。
  5. プライマーを用いてCaspaseTrackerでファイルを確認するために、PCR遺伝子型解析を実行します。5'-TCCCCCGGGCTGCAGGAATTC、3'-TGGAATTGGGGTACGTCTAGA、3897 bpの産物を生産します。 G-トレース遺伝子座の遺伝子型を決定するために、GFPについては、以下のプライマー（474 bp）を使用し、5'-CAC GAC TTC TTC AAG TCC GCC ATG CCC G、3'-CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC GAG AGT GAT C; RFP（258 bp）のために、5'-GGC TGC TTC ATC TAC AAG GTG AAG TTC ATC GG、3'-GAT GTC CAG CTT GGA GTC CAC GTA GTA GTA GC。そして、Flpase（655 bp）の、5'- CCACCTAAGGTGCTTGTTCGTCAGTTTGTGG、3'-GCC TAC TAA CGC TTG TCT TTG TCT CTG TCA C. pUWRベクター中の遺伝子型判定のGal4（554 bp）の、5'-GAA GCA CAC CTT CGC ATCのGCTについてCAGTCA CGC、3'-TGG AAT TGG GGT ACGのTCT AGA。

2.組織調製、染色および取り付け

  1. フライ解離のため、水に溶解し、1％ウシ血清アルブミン（BSA）を用いてプラスチックピペットチップや遠心管、コートチップ及びチューブに粘着切開組織を防止します。
  2. ピンセットを用いてシリコーンクッション上のハエを解剖。
    1. 組織切開を行う際に、ハード面に鉗子の先端の損傷を防ぐため、シリコン表面に解剖を行います。シリコーン解剖プレートを作製するため、製造業者の説明書（物質一覧）に従って市販のキットには、シリコンを溶かします。シリコンを溶融した後、直径60mmの組織培養皿に3〜4 mLを加え。シリコン皿を再利用することができます。
    2. CO 2でハエを麻酔し、冷PBS 1mLでシリコーンプレートに移します。ブローガンを使用してフライを含むバイアルにCO 2を導入し 、その後、麻酔フライトンを転送CO 2供給を持っているOAパッド。
    3. 頭部と前腸との間の接続を損傷することなく、カバー体からフライヘッドを切断する反対方向に胸郭を引っ張ってフライヘッドを保持するピンセット、鉗子の第二の対を使用してください。
    4. 胸部から翼と脚を除去するために、鉗子の2ペアを使用してください。
    5. 前腸と中腸の間の接続を損傷することなく、再び胸部からそれを分離するために腹部を引っ張って胸部、および鉗子の別のペアを保持するためにピンセットを使用してください。
    6. 以前に示されているように、脳、腸、マルピーギ細管および卵巣などの内臓を解剖。39-41
    7. これらの組織は強い自家蛍光を生成するようにピンセットでキューティクルのすべての部分と脂肪体を除去します。忍耐と実践が示すように、完全な臓器システムを準備する必要があります。
  3. 1.5 mL遠心管に解剖した組織を移し、組織ののwiを修正組織における漂白RFPおよびGFPを回避するために、暗所で回転させながら20〜30分間室温でPBS中の4％パラホルムアルデヒド（リン酸緩衝生理食塩水）の第0.5 mLです。その後の染色結果を損なう可能性が長期の固定を避けます。
  4. 穏やかなピペッティングによりパラホルムアルデヒドを外し、室温で0.5 mLのPBST（PBS + 0.1％トリトンX-100）で3回洗浄します。
  5. 穏やかに振盪しながら4℃で一晩0.5 mLのPBSTで組織を透過性。短いインキュベーションは不完全透過性と妥協染色結果を引き起こす可能性があります。
    1. それはバックグラウンド染色を低減する必要がある場合は、代わりにPBSを、1％BSAを用いて0.5mLのPBST中で組織をインキュベート考えます。
  6. 0.5 mLのPBSTで組織を3回洗浄。
  7. 、核および繊維状アクチン（F-アクチン）の染色を10μg/ mLのヘキストの33342ブルー核染料と0.3μMアレクサフルオロ633ファロイジンFアクチン染色で0.5 mLのPBSTを適用し、RTワットで1時間組織と同時にインキュベートするには暗闇の中で穏やかに回転さi番目。これは、バックグラウンドを増加させるように長時間の染色を避けてください。
    1. で一晩抗カスパーゼ3の200希釈：抗ELAV抗体のまたは1と100希釈：免疫染色のために、4°C、1と汚れで一晩0.5 mLのPBS中の0.1％トリトンX-100を有する組織を固定し、透過処理インキュベート4°C（300μL）。 100、室温で1~3時間インキュベートする：対応する二次抗体によってフォロー1に希釈しました。特定の抗体については、物質一覧を参照してください。
  8. 穏やかに回転と0.5 mLのPBSTで5分間それぞれ、組織を3回洗浄します。
  9. ピペットで、すべてのPBSTを削除してから、完全に一晩、室温で1〜3時間、または4°Cのための組織をカバーするために（資料を参照）200μL抗漂白剤封入剤を追加します。完全に封入剤を吸収した最適な組織をチューブの底に沈んでしまいます。
  10. 水または70％エタノールでガラススライドを事前にきれいにし、グラスに封入剤を有する組織を転送sのスライド。
  11. 組織の上にガラスカバースリップを慎重に配置します。過によって組織を壊さないようにスライドガラスとカバーガラスにワセリンを適用します。ティッシュペーパーで余分な封入剤を削除します。
  12. 組織から取り付け薬剤の漏れを避けるために、すべてのカバースリップの縁に沿ってマニキュアを適用することにより、カバースリップをシール。

3.共焦点顕微鏡

  1. 倒立共焦点落射蛍光顕微鏡を使用してください。しかしながら、直立顕微鏡を使用することもできます。タイルを用いた画像組織に起因部品の熱膨張及び収縮にフォーカスし、xy平面のシフトのドリフトを避けるために、安定した室温を維持します。環境制御システムとドリフト補償システムフォーカスによる顕微鏡システムの熱平衡の喪失に、この問題を回避するのに役立ちます。
  2. 顕微鏡のステージ上にスライドを置きます。低解像度（125×125ピクセル）ANを使用して、いくつかのテスト画像を撮影関心領域（ROI）の全領域をカバーするのに必要なタイルの適切な数を決定するDは
  3. スキャン解像度などの500×500画素の画像をキャプチャするために、顕微鏡走査システムを設定します。画像（タイル）のそれぞれは、すべての側面に20％重なるように、このような20X NA 0.8またはカバーガラスを介して組織を分析するための63X NA 1.4プランアポクロマート対物レンズとして対物レンズを選択します。
  4. 長波長の光が下の写真漂白の原因として、励起波長を最短する最長からイメージシーケンスを設定します。励起波長を最短にする最長の配列は：（ⅰ）ファロイジンFアクチンのために、活性化カスパーゼに対する抗体のための633nmで、RFPのための（ii）の561 nmで、GFPのための（iii）の488nmで、および（iv）405 nmのためのヘキスト核染色。
  5. 撮像中に、組織の高品質画像を得るために、レーザ強度を減少させることによって光退色を避けるために、画像形成プロセス中、蛍光レーザー励起への細胞の曝露を最小限に抑えます。
  6. 私の後メイジは、顕微鏡ソフトウェアを用いて画像をマージし、収集されます。

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結果

CaspaseTrackerが通常の健康な細胞（ 図1a）でカスパーゼ活性を検出することを可能にする2つの主要なコンポーネントがあります。これらの最初は、カスパーゼバイオセンサーApoliner（ 図1b）をモデルにした146個のアミノ酸カスパーゼ切断可能なポリペプチドである。このポリペプチドは、典型的には、アポトーシスの間に切断された単一の天然に存在するカスパーゼ部位を含むDIAP1（アポトーシスのショウジョウバエの阻害剤）に由来する28カスパーゼによってDrICE。42,43 DrICEは、カスパーゼ3の哺乳類と切断する最も知られている細胞基質内に相当します。、DIAP1及びその誘導されたポリペプチドは、特定のアスパラギン酸後に切断され、Asp20カスパーゼ認識内に位置するカスパーゼの4,32特性シーケンス17-DQVD-20、およびAla（DQVA）への義務Asp20残基の変異は、切断を廃止。Apolin...

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ディスカッション

ここでは、建設、健康な組織で広く基礎カスパーゼ活性の検出を容易CaspaseTrackerの内部動作を説明します。 生体内で非アポトーシスカスパーゼ活性を検出するための重要なステップは次のとおりです：1）2）適切なコントロールとカスパーゼ特異的レポーターの機能を検証すること、3）解剖の技術を練習する大人のショウジョウバエのすべての内部器官系を観察するために、バイオセンサーの導入遺伝子でハエを生成します、 4）自己蛍光アーチファクトからバイオセンサーの活性を区別する。

カスパーゼ特定のセンサとして機能する天然カスパーゼ切断可能なポリペプチドは、バイオセンサーによって任意のカスパーゼ阻害活性を避けるために変更されました。さらなる修飾は、急速GAL4転写因子の分解、およびエピトープタグの挿入を回避するために行われました。また、全身の臓器ハエの解剖、免疫染色、取り付けおよびフライ組織の共焦点顕微鏡を記述します非アポトーシスカスパーゼ活性を検出することです。

CaspaseTrackerはカスパーゼ...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

我々は図中のショウジョウバエのイラストのためポランサントスとダレンObbardに感謝します。図2a、マルセロ・ジェイコブス - ロレーナJHMRIの昆虫館の使用のために。この作品は、香港のAoE / B-07/99の大学補助金委員会（MCF）、ライフサイエンス研究財団のフェローシップ（HLT）によって支持され、NIHはNS096677、NS037402とNS083373（JMH）を付与しました。ホーラム唐は、生命科学研究財団のShurlとケイクルチ財団フェローです。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
消耗品および試薬
Vectashieldベクター製品H-1000取り付け媒体
鉗子テッド・ペラ#505 (110mm, #5)デュモン ピンセット 生物学グレード、ステンレス鋼
吊り下げ式 ドロップスライドフィッシャー・サイエンティフィック12-565Bスライド
ヘキスト 33342分子プローブH1399DNA 染色
Alexa Fluor 633 PhalloidinMolecular ProbesA22284Actin 染色
Rat-Elav-7E8A10 抗 elav 抗体Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)抗体登録 ID: AB_528218 Drosophla pan-neuronal ELAVの染色
Cleaved caspase-3 (Asp175) antibodyCell Signaling Technology#9661Stain for active fragment of caspase-3
ProLong Gold antifade reagentLife TechnologiesP36934to preserve fluorophores 
ProLong Diamond 色あせ防止剤Life TechnologiesP36961蛍光色素の保存 
シルガード182シリコーンエラストマーキットダウコーニング 製品コード: 解剖プレート
Equipment
LSM780 共焦点顕微鏡カール・ツァイスN/Aイメージング
カール・ツァイス 実体顕微鏡 ステミ 2000カール・ツァイスN/Aショウジョウバエ 解剖
AmScope 光ファイバー デュアル グースネック顕微鏡 イルミネーター, 150 WAmScopeWBM99316光源
剤用0001023934

参考文献

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