インビボでのバイオセンサーは、 ショウジョウバエの非アポトーシスカスパーゼ活性を追跡します

サマリー

カスパーゼ活性の低いレベルを含む全動物に健康な細胞を検出するために、CaspaseTracker指定された高感度バイオセンサーは、 ショウジョウバエのために生成されました。カスパーゼ依存性のバイオセンサーの活性は、死刺激の非存在下で最適化された条件下で飼育した成体動物の臓器全体長寿命健康な細胞で検出されます。

要約

Caspaseは、そのタンパク質分解活性を通じてアポトーシス細胞死の主要なメディエーターです。カスパーゼが細胞内で利用可能な技術で検出可能なレベルまで活性化されると、一般にアポトーシスはその後すぐに起こると想定されます。カスパーゼは、多くの機能的および構造的成分を切断し、数分以内に迅速かつ完全な細胞破壊を引き起こす可能性があります。しかし、蓄積された証拠は、正常な健康な細胞では、同じカスパーゼがおそらくより低い酵素レベルで他の機能を持っていることを示しています。非アポトーシス性カスパーゼ活性の研究は、低レベルのカスパーゼ活性の検出と、生体内での最終的な細胞運命の追跡が困難であることによって妨げられてきました。ここでは、動物全体でカスパーゼ活性を経験した細胞を永久にラベルする超高感度カスパーゼレポーターであるCaspaseTrackerの使用について説明します。このショウジョウバエ用2色CaspaseTrackerバイオセンサーは、最近または進行中のカスパーゼ活性を示すために赤色蛍光タンパク質(RFP)を一過性に発現し、過去にカスパーゼ活性を経験した細胞で緑色蛍光タンパク質(GFP)を永久に発現しますが、死滅していません。重要なことに、このカスパーゼ依存性のin vivoバイオセンサーは、成虫のハエ全体の臓器系組織における非アポトーシス性カスパーゼ活性の存在を容易に明らかにします。これは、個々のハエの全マウント解剖を使用して、脳、腸、マルピーギ尿細管、噴門、卵巣管、およびその他の組織全体の健康な細胞のバイオセンサー活性を検出することで実証されています。CaspaseTrackerは、カスパーゼ活性化の少なくとも10日後に成体ニューロンや他の組織でバイオセンサー活性が検出されるため、長寿命細胞の非アポトーシス性カスパーゼ活性を検出します。このバイオセンサーは、生きた動物における非アポトーシス性カスパーゼ活性の役割と分子メカニズムを明らかにするための重要なツールとして機能します。

概要

カスパーゼは、キーアスパラギン残基の後に多くの細胞内のタンパク質を切断することにより、アポトーシス細胞死を仲介するシステインプロテアーゼです。例えば、イニシエーターカスパーゼは、エフェクターカスパーゼ、活性化するDNAヌクレアーゼ、切断する細胞骨格成分を活性化し、急速に細胞を分解し、細胞の死骸の処分隣接細胞によってそれらの認識と貪食を刺激するために、細胞膜の脂質組成を変化させる^。1-4それが推定されます細胞数十億は、ヒトの体内で一日あたり死亡し、アポトーシスが化学療法誘発性腫瘍細胞死の重要なメカニズムである^。5カスパーゼの異なるセットは、先天性免疫を刺激する別個の非アポトーシス過程による細胞死を引き起こす可能性があります^。6ので、カスパーゼ上のほとんどの研究は、それらのプロ死の機能に焦点を当てています。

興味深いことに、フィールドの初期の証拠は、細胞死を促進する責任同じカスパーゼは、非死Fを有していることを明らかにしましたunctions。先駆的な研究では、カスパーゼは、胚形成の間の細胞の増殖および遊走の調節を含む正常細胞における多様な細胞機能に関与していることが示されている^。7-9カスパーゼが代替ネクロトーシス細胞死経路を遮断するため、 ショウジョウバエ ^10,11に精子細胞を個別に必要とされますマウス^12,13で、およびマイ....

プロトコル

CaspaseTrackerのハエの調製

1. CaspaseTracker（DQVD）は実験のために飛ぶ準備するには、このクロスを行います。UBI-CaspaseTrackerは G-TRACE X（UAS-RFP; UAS-FLPを、ユービーアイ>停止> GFP-NLS）、7-10処女女性（または男性）を転送することにより、一緒に男性（または女性）の数が同じでユビキチンプロモーター³⁵によって駆動されるカスパーゼのバイオセンサー基板mCD8-DIAP1-GAL4 G-のホモ接合組み合わせの致死性を回避するために、第2染色体CYOバランサを持つG-TRACEのハエを、運ぶハエTRACE（UAS-RFP、UAS-FLP、およびユービーアイ>停止> ^{GFP-NLS）34。}場所は、タンパク質源として新鮮な酵母ペーストで生鮮食品のバイアルに飛びます。
2. 5〜7日（最大2週間）のために18℃でファイルをインキュベートし、新しい子孫で混雑を避けるために、新たな繁殖バイアルを設定するためにバイアルから親ハエを削除します。
3. 子孫が孵化するハエまで18℃でインキュベーションを続けます。非CYOを選択し、[非CCaspaseTrackerとG-TRACE要素³⁵のためのトランスジェニックでurly翼] CaspaseTrackerの正しい遺伝子型の子孫、。
4. 同時に、制御親の非トラ....

結果

CaspaseTrackerが通常の健康な細胞（ 図1a）でカスパーゼ活性を検出することを可能にする2つの主要なコンポーネントがあります。これらの最初は、カスパーゼバイオセンサーApoliner（ 図1b）をモデルにした146個のアミノ酸カスパーゼ切断可能なポリペプチドである。このポリペプチドは、典型的には、アポトーシスの間に切断された単一の天然に存在するカスパーゼ部位を含むDIAP1（アポトーシスのショウジョウバエの阻害剤）に由来する²⁸カスパーゼによって^{DrICE。42,43} DrICEは、カスパーゼ3の哺乳類と切断する最も知られている細胞基質内に相当します。、DIAP1及びその誘導されたポリペプチドは、特定のアスパラギン酸後に切断され、Asp20カスパーゼ認識内に位置するカスパーゼの^4,32特性シーケンス17-DQVD-20、およびAla（DQVA）への義務Asp20残基の変異は、切断を廃止^{。Apolin.......}

ディスカッション

ここでは、建設、健康な組織で広く基礎カスパーゼ活性の検出を容易CaspaseTrackerの内部動作を説明します。 生体内で非アポトーシスカスパーゼ活性を検出するための重要なステップは次のとおりです：1）2）適切なコントロールとカスパーゼ特異的レポーターの機能を検証すること、3）解剖の技術を練習する大人のショウジョウバエのすべての内部器官系を観察するために、バイオセンサーの導入遺伝子でハエを生成します、 4）自己蛍光アーチファクトからバイオセンサーの活性を区別する。

カスパーゼ特定のセンサとして機能する天然カスパーゼ切断可能なポリペプチドは、バイオセンサーによって任意のカスパーゼ阻害活性を避けるために変更されました。さらなる修飾は、急速GAL4転写因子の分解、およびエピトープタグの挿入を回避するために行われました。また、全身の臓器ハエの解剖、免疫染色、取り付けおよびフライ組織の共焦点顕微鏡を記述します非アポトーシスカスパーゼ活性を検出することです。

CaspaseTrackerはカスパーゼ.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
消耗品および試薬
Vectashield	ベクター製品	H-1000	取り付け媒体
鉗子	テッド・ペラ	#505 (110mm, #5)	デュモン ピンセット 生物学グレード、ステンレス鋼
吊り下げ式 ドロップスライド	フィッシャー・サイエンティフィック	12-565B	スライド
ヘキスト 33342	分子プローブ	H1399	DNA 染色
Alexa Fluor 633 Phalloidin	Molecular Probes	A22284	Actin 染色
Rat-Elav-7E8A10 抗 elav 抗体	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	抗体登録 ID: AB_528218	Drosophla pan-neuronal ELAVの染色
Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody	Cell Signaling Technology	#9661	Stain for active fragment of caspase-3
ProLong Gold antifade reagent	Life Technologies	P36934	to preserve fluorophores
ProLong Diamond 色あせ防止剤	Life Technologies	P36961	蛍光色素の保存
シルガード182シリコーンエラストマーキット	ダウコーニング	製品コード: 解	剖プレート
Equipment
LSM780 共焦点顕微鏡	カール・ツァイス	N/A	イメージング
カール・ツァイス 実体顕微鏡 ステミ 2000	カール・ツァイス	N/A	ショウジョウバエ 解剖
AmScope 光ファイバー デュアル グースネック顕微鏡 イルミネーター, 150 W	AmScope	WBM99316	光源

剤用0001023934